土壤可溶性有機氮,硝態氮,銨態氮和微生物量氮測定

2024年4月1日發(作者：離開家鄉不舍心情說說)

土壤可溶性有機氮、硝態氮、銨態氮、微生物量氮最方便最簡單的測定方法

1.母液制樣：稱取新鮮土壤（30.0g）于放置燒杯中，加約等于田間持水量60%水在

25℃下培養7~15d。取15.0g土于燒杯，置于真空干燥器中，同時內放一裝有用100ml

精制氯仿的小燒杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器連到真空泵上，抽真空至氯仿

沸騰5分鐘，靜置5分鐘，再抽濾5分鐘，同樣操作三次。干燥器放入25℃培養箱中24

小時后，抽真空15-30分鐘以除盡土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，

一般就是濕土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（未熏蒸為空白直接稱取

15.0g土，加同樣比例0.5M K2SO4溶液）震蕩30分鐘，過濾。其中熏蒸后的土壤過濾

液為A母液，未熏蒸的土壤過濾液為B母液。母液要是不及時測定，需立即在-15℃以下

保存

2.測定

可溶性有機氮=可溶性全氮-（銨態氮+硝態氮）

要是有流動分析儀器還有TOC的話可以利用A母液測得碳氮減去B母液的碳氮含量

根據公式計算得出微生物碳氮，可以用B母液測的銨態氮、硝態氮和可溶性全氮，是很方

便的。

以下的是用傳統的方法測定以上指標，經過852個土壤樣品試驗結果還是很好的。

土壤可溶性全氮測定

氧化劑:將6g NaOH 和30g K

2

S

2

O

8

溶于蒸餾水中并定容至1 L(K

2

S

2

O

8

比較難溶，

在低于60℃得瑟水浴中溶解，高于60℃配置的溶液至其氧化性失效，NaOH制成溶液，

致其溫度達到常溫后與K

2

S

2

O

8

溶液混合定容至1L)

測定：移取A母液10ml至消化試管，加入10ml氧化劑，水浴中加熱，溫度升高到

120℃后保持90min，使用紫外分光光度計測定A

220

和A

275

，空白需加入1ml氧化劑并

同時作水浴處理。（Tips：農化上母液與氧化劑各取25ml，此處取其比例為1:1。）

標準曲線：0.7218g硝酸鉀溶于水中，轉入1000ml容量瓶中定容搖勻，制得濃度為

100mg/L的氮標準貯存液。稀釋10倍即為10mg/L的氮標準溶液。吸取氮標準溶液（梯

度為0ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml；對應濃度分別為0 mg/L，0.02 mg/L，

0.04 mg/L，0.06 mg/L，0.08 mg/L，0.10 mg/L，0.12mg/L）于50ml容量瓶中，各加

入1ml氧化劑并定容，得氮的標準系列，與樣品同樣消煮測定A

220

和A

275

。以A（A=

A

220

-A

275

）為縱標，氮濃度為橫標繪制標準曲線。

硝態氮測定1

注：硝態氮測定1僅適合于農田土壤，腐殖質含量比較低的土壤，森林土壤和腐殖質

含量比較高的土壤不適用，因為森林土壤和腐殖質高的土壤有腐植酸的顏色，干擾比色可

采用硝態氮測定2進行測定

測定：移取B母液5ml定容至50ml容量瓶中，使用紫外分光光度計測定即可，在

220nm和275nm直接測定A220和A275，用校正吸光度A=A220-A275查得硝酸根濃

度，空白為去離子水。

NO3--N標準曲線：0.1631g硝酸鉀溶解定容至1L，制得濃度為100mg/L的硝酸根

標準溶液。標準曲線梯度為0ml，0.5ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，對應濃度分別為

0mg/L，1mg/L，2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L。()

硝態氮測定2

1、酚二磺酸比色法

1）方法原理

土壤用飽和CaSO4 2H2O溶液浸提，在微堿性條件下蒸發至干，土壤浸提液中的NO3

－—N在無水的條件下能與酚二磺酸試劑作用，生成硝基酚二磺酸。

C6H3OH(HSO3)2+HNO3→C6H2OH(HSO3)2 NO2+H2O

2，4-酚二磺酸 6-硝基酚-2，4-二磺酸

此反應必須在無水條件下才能迅速完成，反應產物在酸性介質中無色，堿化后則為穩

定的黃色溶液，黃色的深淺與NO3－—N含量在一定范圍內成正相關，可在400～425nm

處（或用藍色濾光片）比色測定。酚二磺酸法的靈敏度很高，可測出溶液中0.1mg?L-1 NO3

－—N，測定范圍為0.1～2mg?L-1。

2）主要儀器

分光光度計、水浴鍋、瓷蒸發皿。

3）試劑

（1）酚二磺酸試劑：

稱取白色苯酚（C6H5OH，分析純）25.0g置于500mL三角瓶中，以150mL純濃

H2SO4溶解，再加入發煙H2SO475mL并置于沸水中加熱2h，可得酚二磺酸溶液，儲于

棕色瓶中保存。使用時須注意其強烈的腐蝕性。如無發煙H2SO4，可用酚25.0g，加濃

H2SO4225mL，沸水加熱6h配成。試劑冷后可能析出結晶，用時須重新加熱溶解，但不

可加水，試劑必須貯于密閉的玻塞棕色瓶中，嚴防吸濕。

（2）10μg?mL-1 NO3－—N標準溶液：

準確稱取KNO3（二級）0.7221g溶于水，定容1L，此為100μg?mL-1 NO3－—N

溶液，將此液準確稀釋10倍，即為10μg?mL-1 NO3－—N標準溶液。

（3）CaSO4?2H2O（分析純、粉狀）、

（4）CaCO3（分析純、粉狀）、

（5）1:1 NH4OH、

（6）活性碳（不含NO3－），用以除去有機質的顏色。

（7）Ag2SO4（分析純、粉狀）、Ca(OH)2（分析純、粉狀）和MgCO3（分析純、

粉狀），用以消除Cl-1的干擾。

4）操作步驟

測定

（1）吸取B母液 50mL加入0.1g CaSO4?2H2O（注2）[凝聚劑的作用，使濾液不

混濁而澄清（含]NO3－—N 20～150μg）震蕩過濾，取25ml濾液于瓷蒸發皿中，加CaCO3

約0.05g（注5）[調節pH，防止NO3－—N在酸性和中性條件下蒸干分解而損失]，在水

浴上蒸干（注6），到達干燥時不應繼續加熱。稍冷，迅速加入酚二磺酸試劑1---2 mL，

將皿旋轉，使試劑接觸到所有的蒸干物。靜止10min使其充分作用后，加水20 mL，用玻

璃棒攪拌直到蒸干物完全溶解。冷卻后緩緩加入1：1 NH4OH（注7）并不斷攪拌混勻，

至溶液呈微堿性（溶液顯黃色 不再加深）再多加2mL，以保證NH4OH試劑過量。然后

將溶液全部轉入100mL容量瓶中，加水定容（注8）。在分光光度計上用光徑1cm比色杯

在波長420nm處比色，以空白溶液作參比，調節儀器零點。

（2）同時，NO3－—N工作曲線繪制：分別取10μg?mL-1NO3－—N標準液0、1、

2、5、10、15、20mL于蒸發皿中，在水浴上蒸干，與待測液相同操作，進行顯色和比色，

繪制成標準曲線，或用計算器求出回歸方程。

5）結果計算

土壤中NO3－—N含量（mg?kg-1）

=

式中：C(NO3－-N)——從標準曲線上查得（或回歸所求）的顯色液NO3－-N 質量

濃度（μg?mL-1）；

V——顯色液的體積（mL）；

ts——分取倍數；

m——風干樣品質量，g。

H——風干樣品水分質量含量百分數。

6）注釋

注1．

硝酸根為陰離子，不為土壤膠體吸附，且易溶于水，很易在土壤內部移動，在土壤剖

面上下層移動頻繁，因此測定硝態氮時注采樣深度。即不僅要采集表層土壤，而且要采集

心土和底土，采樣深度可達40cm、60 cm以至120 cm。試驗證明，旱地土壤上分析全

剖面的硝態氮含量能更好地反映土壤的供氮水平。和表層土壤比較，則全剖面的硝態氮含

量與生物反應之間有更好的相關性，土壤經風干或烘干易引起NO3－—N變化，故一般都

用新鮮土樣測定。

注2．

用酚二磺酸法測定硝態氮，首先要求浸提液清徹，不能混濁，但是一般中性或堿性土

壤濾液不易澄清，且帶有機質的顏色，為此在浸提液中應加入凝聚劑。凝聚劑的種類很多，

有CaSO4、CaO、Ca(OH)2、CaCO3、MgCO3、KAl(SO4)2、CuSO4等，其中CuSO4

有防止生物轉化的作用，但在過濾前必須以氫氧化鈣或碳酸鎂除去多余的銅，因此以

CaSO4法提取較為方便。

注3．

如果土壤浸提液由于有機質而有較深的顏色，則可用活性炭除去，但不宜用H2O2，

以防最后顯色時反常。

注4．

土壤中的亞硝酸根和氯離子是本法的主要干擾離子。亞硝酸和酚二磺酸產生同樣的黃

色化合物，但一般土壤中亞硝酸含量極少，可忽略不計。必要時可加少量尿素、硫尿和氨

基磺酸（20g?L-1NH2SO3H）以除去之。例如亞硝酸根如果超出了1μg?mL-1時，一般

每10mL待測液中加入20mg尿素，并放置過夜，以破壞亞硝酸根。

檢查亞硝酸根的方法：可取待測液5滴于白瓷板上，加入亞硝酸試粉0.1g，用玻璃棒

攪拌后，放置10min，如有紅色出現，即有1mg?L-1亞硝酸根存在。如果紅色極淺或無

色，則可省去破壞亞硝酸根手續。

Cl-對反應的干擾，主要是加酸后生成亞硝酰氯化合物或其它氯的氣體。如果土壤中含

氯化合物超過15mg?kg-1，則必須加Ag2SO4除去，方法是每100mL浸出液中加入

Ag2SO4 0.1g (0.1g Ag2SO4 可沉淀22.72mg Cl-)，搖動15min，然后加入Ca(OH)2

0.2g及MgCO3 0.5g，以沉過量的銀，搖動5min后過濾，繼續按蒸干顯色步驟進行。

NO3- + 3Cl- + 4H+ → NOCl + Cl2 + 2H2O

亞硝酰氯

注5．

在蒸干過程中加入碳酸鈣是為了防止硝態氮的損失。因為在酸性和中性條件下蒸干易

導致硝酸離子的分解，如果浸出液中含銨鹽較多，更易產生負誤差。

注6．

此反應必須在無水條件下才能完成，因此反應前必須蒸干。

注7．

堿化時應用NH4OH，而不用NaOH或KOH，是因為NH3能與Ag+絡合成水溶性

的[ (NH3)2]+，不致生成Ag2O的黑色沉淀而影響比色。

注8．

在蒸干前，顯色和轉入容量瓶時應防止損失

銨態氮測定

方法原理

0.5mol?L-1 K2SO4溶液浸提土壤，把吸附在土壤膠體上的NH4+及水溶性NH4+浸

提出來。土壤浸提液中的銨態氮在強堿性介質中與次氯酸鹽和苯酚作用，生成水溶性染料

靛酚藍，溶液的顏色很穩定。在含氮0.05～0.5mg?L-1的范圍內，吸光度與銨態氮含量成

正比，可用比色法測定。

2）試劑

（1）2mol/LKCl溶液 稱取149.1g氯化鉀（KCl，化學純）溶于水中，稀釋至1L。

（2）苯酚溶液 稱取苯酚（C6H5OH，化學純）10g和硝基鐵氰化鈉

[Na2Fe(CN)5NO2H2O]100mg稀釋至1L。此試劑不穩定，須貯于棕色瓶中，在4℃冰箱

中保存。

（3）次氯酸鈉堿性溶液 稱取氫氧化鈉（化學純）10g、磷酸氫二鈉

（Na2HPO4?12H2O, 化學純）9.431g、磷酸鈉（Na3PO4?12H2O, 化學純）31.8g和 5.25%

次氯酸鈉(NaOCl，化學純，即含5%有效氯的漂白粉溶液)10mL溶于1L水中，貯于棕色

瓶中，在4℃冰箱中保存。

（4）掩蔽劑 將400g/L的酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6?4H2O, 化學純）與100g/L

的EDTA二鈉鹽溶液等體積混合。每100mL混合液中加入10 mol?L-1氫氧化鈉0.5mL。

得清亮溶液。

（5）5mg/L 銨態氮（NH4+—N）標準溶液 稱取烘干的硫酸銨[(NH4)2SO4，分

析純]0.4717g溶于水中，洗入容量瓶后定容至1L，制備成含銨態氮（N）100μg?mL –1

的貯存溶液；使用前取5ml將其加水稀釋至100ml，即配制成含銨態氮（N）5mg/L的

標準溶液備用。

3）儀器與設備：分光光度計。

4）分析步驟

測定： 吸取B土壤浸出液2mL～10mL(含NH4+—N2μg～25μg)放入50mL容量

瓶中，用氯化鉀溶液補充至總體積為10mL，加水20ml，然后加入苯酚溶液5mL和次氯

酸鈉堿性溶液5mL，搖勻。在20℃左右的室溫下放置1h后（注1），加掩蔽劑1mL以溶

解可能產生的沉淀物，然后用水定容至刻度。用1cm比色槽在625nm波長處（或紅色濾

光片）進行比色，讀取吸光度。用空白試驗溶液（只有相同試劑，但無土壤浸出液的空白

溶液），調零。

（3）工作曲線 分別吸取0，0.5，1，2，3，4，5mL的含銨態氮（N）5mg/L的標

準溶液于50mL容量瓶中，各加10mL氯化鉀溶液，同（2）步驟進行比色測定。

6）注釋

注1. 顯色后在20℃左右放置1h,再加入掩蔽劑.過早加入會使顯色反應很慢,藍色偏弱;

加入過晚,則生成的氫氧化物沉淀可能老化而不易溶解.

參考文獻

（1）南京農業大學主編. 土壤農化分析（二版） 北京:農業出版社, 1986, 40～64

（2）李酉開. 紫外分光光度法測定硝酸鹽, 土壤學進展. 1992, 6, 44～45

（3）易小琳, 李酉開, 韓瑯豐. 紫外分光光度法測定硝酸氮. 土壤通報. 1983, 6

（4）鮑士旦主編. 土壤農化分析（三版） 北京:中國農業出版社, 2000, 49～61

微生物氮的測定

試劑配制：

混合催化劑：按照硫酸鉀：五水硫酸銅：硒粉=100：10：1，稱取硫酸鉀100g、五

水硫酸銅10g、硒粉1g。均勻混合后研細,貯于瓶中。

密度為1.84濃硫酸。

40%氫氧化鈉：稱400g氫氧化鈉于燒杯中，加蒸餾水600ml，攪拌使之全部溶解定

容至1L。

2%硼酸溶液：稱20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示劑。（按體積比

100:2加入混合指示劑）

混合指示劑：稱取溴甲酚綠0.5g和甲基紅0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中,用稀氫

氧化鈉或鹽酸調節使之呈淡紫色，此溶液pH應為4.5。

0.01mol的鹽酸標準溶液：取比重1.19的濃鹽酸0.84ml，用蒸餾水稀釋至1000ml，

用基準物質標定之。5M K2SO4溶液：稱取K2SO4174.33g溶解于蒸

0.5M K2SO4溶液：稱取K2SO4 87.165g溶解于蒸餾水中，攪拌溶解，（可加熱）

定容至1L。

去乙醇氯仿的配制：在通風柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗中，加入

200毫升的蒸餾水，加塞，上下振蕩10下，打開塞子放氣，而后加塞再振蕩10下，反復

3次，將分液漏斗置于鐵架臺上，靜止溶液分層，打開分液漏斗下端的閥，將下層溶液（氯

仿）放入200毫升的燒杯中，將剩余的溶液倒入水槽，用自來水沖洗。再將燒杯中的氯仿

倒入分液漏斗中，反復3次。將精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入無水分析純的CaCl2 10g，

置于暗處保存。

試驗步驟

測定：經試驗：微生物碳測定只吸取2ml，采用重鉻酸鉀-硫酸亞鐵滴定法測定。微生

物氮吸取濾液A和B母液10ml于消化管中，加入2g催化劑，在再加5ml濃硫酸，管口

放一彎頸小漏斗，將消化管置于通風櫥內遠紅外消煮爐的加熱孔中。打開消煮爐上的所有

加熱開關進行消化，加熱至微沸，關閉高檔開關，繼續加熱。消煮至溶液呈清徹淡藍色，

然后繼續消煮0.5—1.0h，最后溶液呈藍綠色，土呈灰白色，全部消煮時間約85一90 min。

消煮完畢冷卻，同時做兩個試劑空白試驗。

（3）計算：

A．氮含量計算

土壤含氮量（%）=(V-V0)*N*0.014*100*ts/W

V-滴定試樣時消耗的鹽酸標準溶液體積，ml。

V0 -滴定空白時消耗的鹽酸標準溶液體積，ml。

N-鹽酸標準溶液的當量濃度。（此處為0.01）

W-土壤樣品重（用水分系數換算成烘干土重）g。

0.014-氮的毫克當量

ts為分取倍數，濾液為30ml，試驗測定用了10ml，因此處ts為3

B．微生物氮計算

B(N) =EN／KEN

式中 B(N)——微生物量氮（BN）質量分數，-1；

EN——熏蒸土樣浸提的全 N 與未熏蒸土樣之間的差值，-1；（取上述A母液

測定的氮和B母液測定的氮的差值）

KEN—代表被氯仿熏蒸殺死的土壤微生物生物量碳在培養期間礦化為礦質態氮的比例，

常取 0.57（Jenkinson.1988）

注：所有的濾液測定參考的方法為：陳立新《土壤實驗實習教程》，步驟和熏蒸前期處

理參考：吳金水《土壤微生物生物量測定方法及其應用》，所有的藥品全是分析純，若土壤

比較貧瘠可在消煮的時候加多點浸提液。