硫酸銨沉淀知識分享

2024年3月15日發(作者：怎么長胸)

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硫酸銨沉淀：

有生物活性的蛋白一般在做硫胺沉淀的時候要小心一點。最保險的做

法是，把硫酸銨配成飽和溶液，把蛋白溶液置于冰浴上，再把飽和硫

胺溶液一滴一滴的加到你的蛋白溶液中，最好邊加邊攪拌，避免局部

硫胺濃度過高，但攪拌的時候注意不要攪出氣泡。按照你的比例加完

之后，最好放冰箱靜置至少2h，充分沉淀后離心即可。

4M的硫酸銨pH值為4.6，在這個酸度下可能會有一些蛋白質變性，

要小心。硫酸銨會破壞蛋白質水化層，最好是緩和地加入。邊加入邊

攪拌，如果在磁力攪拌器上攪拌，小漩渦中心有很多泡沫就表示蛋白

質變性，使得溶液粘度增加，泡沫難破，那就很難保證你的蛋白質有

沒有變性了。

溶解度，

在一定溫度下，某固態物質在100g溶劑中達到飽和狀態時所溶解的質量，

叫做這種物質在這種溶劑中的溶解度。固體物質的溶解度是指在一定的溫度

下，某物質在100克溶劑里達到飽和狀態時所溶解的克數，用字母s表示，

其單位是“g/100g水”。在未注明的情況下，通常溶解度指的是物質在水

里的溶解度。

溶液飽和度(化學)

某種溶液的飽和度是指在100g該溶液中溶質在溶液中所占質量分數.

一般情況下，一種溶液的飽和度在同一溫度下不會變.要想使不飽和溶液

飽和度增加可以選擇增加溶質.在剛好有晶體析出的時候就是溶液剛好飽

和的時候.溶液飽和度不會出現100%

加固體比較好，加得越慢越好。 如果加快了，會造成局部濃度過大，

造成意想不到的沉淀。

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硫酸銨沉淀的時候應該要注意pH值的變化，就我的實驗來說，一株

產淀粉酶曲霉固態發酵之后用超純水浸泡離心，得到含有酶的上清液

的pH值為6.5，但是淀粉酶能耐受pH4.5，為了去除更多雜質蛋白質，

我把硫酸銨濃度調節到2摩爾每升的同時會控制pH值為4.5，4度過

夜之后離心取上清液再調節到pH值7.0，4度放置，離心，又去除一

部分雜質蛋白質，上清液直接用pH7.0的疏水層析系統來純化。

一個纖維素酶的純化我也用類似的方法，只不過第一步是用4.0。

硫酸銨是酸式鹽，2M時pH值約為5，4M時更低，用來沉淀蛋白質的

時候情況就更復雜了，所以最好知道自己需要的蛋白質的耐受情況，

不要搞死了。

透析之前要選用一個不影響自己想要的蛋白質的pH值，硫酸銨沉淀

和透析都要保持一致，才能使損失減少。透析時候產生的沉淀不知道

是不是你想要的蛋白質，不過下次做最好謹慎一點，做我說過的預備

實驗。

分段鹽析的方法

對分離目的蛋白的鹽析，最好采用分段鹽析。由于不同的蛋白質其溶

解度與等電點不同，沉淀時所需的pH值與離子強度也不相同，改變鹽的

濃度與溶液的pH值，可將混合液中的蛋白質分批鹽析分開，這種分離蛋

白質的方法稱為分段鹽析法(fractional saltingout)。如半飽和硫酸銨

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可沉淀血漿球蛋白，飽和硫酸銨則可沉淀包括血漿清蛋白在內的全部蛋白

質。

1. 分段鹽析的條件先需要進行小實驗探索，如：先進行0%-30%的硫

酸銨沉淀，再進行30%-60%的硫酸銨沉淀，最后進行60%-80%的硫酸銨沉

淀。

2. 每一段鹽析靜置之后都將離心取沉淀，透析并檢測活性。通過實

驗結果可以看出哪一段鹽析出來的目的產物最多，相對來說雜質就更少。

3. 比如實驗中的活性物質主要在60%-80%這段出來，在以后的實驗

中，就可以首先進行0%-60%的硫酸銨沉淀，這段沉淀物可以拋棄（去處大

多數雜質）；然后進行60%-80%的硫酸銨沉淀，這段沉淀出來是物質是所

需要的目的物質含量比較高的物質，將其收集進行下一步純化工作。

鹽析法：

蛋白質、酶在低鹽濃度下的溶解度隨著鹽濃度升高而增加（此時稱為鹽

溶）；當鹽濃度不斷上升時，蛋白質和酶的溶解度又以不同程度下降并先

后析出，稱為蛋白質的鹽析。這一現象是由于蛋白質分子內及分子間電荷

的極性基團有著靜電引力，當水中加入少量鹽類時，由于鹽類離子與水分

子對蛋白質分子上的極性基團的影響，使蛋白質在水中溶解度增大。但鹽

濃度增加到一定程度時，蛋白質表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，

于是蛋白質就相互聚集而沉淀析出。鹽析法就根據不同蛋白質和酶在一定

濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達到彼此分離的方法。

硫酸銨，25度時飽和溶解度為4.1M，即767g/L；0度時飽和溶解度為3.9M，

即676g/L。應用硫酸銨時，對蛋白氮的測定有干擾，且緩沖能力比較差。

硫酸銨濃溶液的pH在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫

酸或氨水調節。

硫酸銨飽和度計算方法及加入方式：在分段鹽析時，加鹽濃度一般以飽和度表示，

飽和溶液的飽和度定為100%。用硫酸銨鹽析時其溶液飽和度調整方法有3種。

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一是當蛋白質溶液體積不大，所需調整的濃度不高時，可加入飽和硫酸銨溶液；

飽和硫酸銨配制方法可加入過量的硫酸銨，加熱至50-60度保溫數分鐘，趁熱濾

去沉淀，再在0度或25度下平衡1-2天，有固體析出時即達100%飽和度。鹽析

所需飽和度可按下式計算：

今天作的實驗是利用硫酸銨沉淀蛋白質，從之前作過的經驗知道，這一個步驟是有名的煩，

要慢慢用敲的把硫酸銨緩緩的加入蛋白質溶液中。

相關的原理可以在莊榮輝學習網站中找到，與鹽溶剛好相反，在蛋白質溶液中加入硫酸銨，

會使得蛋白質的溶解度下降，因而沉淀出來。因為硫酸銨所解離的離子容很大，所帶的電子

數也多(NH4+, SO42-)，因此當其溶入水中時，會吸引大量水分子與這些離子水合。

蛋白質分子表面多少有一些較不具極性的區域，水分子會在這些非極性區的表面聚集，形

成類似『水籠』的構造(請見下圖)，以便把蛋白質溶入水中。一旦蛋白質溶液加入硫酸銨，

后者吸引了大量水分子，使水籠無法有效隔離蛋白質的非極性區，造成這些非極性區之間的

吸引，因而沉淀下來。因此，分子表面上若有越多的非極性區域，就越容易用硫酸銨沉淀下

來。

在計算所添加的硫酸銨的重量方面，找到了一個不錯的網站——硫酸銨計算機

這個網頁上可以靠著輸入實驗溫度、溶液體積、想要到達的百分濃度以及初始的百分濃度這

四個數值，就可以得到需要添加的硫酸銨克數，以及在加入固體硫酸銨后所增加的體積，算

是一個很不錯的網站。

此外另一個比較值得提的，是我有用兩種方式加入硫酸銨，第一種是固體的硫酸銨模碎加入，

另一種是將硫酸銨溶成飽和溶液再加入，各有各的優缺點，比較如下：

1.造成蛋白質變質的程度：固體的硫酸銨>硫酸銨飽和溶液

利用硫酸銨飽和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成變質(沒試過用倒入的)。 不

像固體的硫酸銨只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白質就壞了(溶液有致密的白色氣泡產生)。

2.操作的容易度： 硫酸銨飽和溶液>>固體的硫酸銨

固體硫酸銨最大的缺點就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以當你要溶解的蛋白

質很多時，這是很累的步驟。然而硫酸銨飽和溶液比較麻煩只有在配制部分，要先加熱讓它

飽合后，回到操作溫度讓它過飽和，最后用濾紙把硫酸銨結晶去掉。

3.蛋白質溶液的體積放大程度 硫酸銨飽和溶液>>固體的硫酸銨

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這是使用硫酸銨飽和溶液最頭痛的部分，舉例來說，要讓100 ml的硫酸銨百分比從0%到

25%， 如果是加入固體的硫酸銨，只會讓溶液從100 ml變成107 ml左右，但若是加入硫酸

銨飽和溶液，會讓溶液變成125 ml！而且若是要提高到50%，須加等量的硫酸銨飽和溶液，

所以會讓蛋白質溶液從100 ml變成200 ml。

因此在加入硫酸銨時，若是低百分濃度可以利用硫酸銨飽和溶液，然而如果是高百分濃度的，

除非不在意蛋白質溶液體積的放大(反正都要離心離下來)，否則還是用固體硫酸銨來的好。

所以今天從0%拉到25%及從25%拉到50%時，都是利用硫酸銨飽和溶液，但是當要從50%

拉到75%時，我選擇利用固體硫酸銨，因為如果用硫酸銨飽和溶液， 離心機無法離那么多

的溶液體積。

硫酸銨沉淀法純化蛋白的原理和操作及配比用表 - Ox Liu - Ox Liu的博客

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