熒光探針在細(xì)胞成像領(lǐng)域的研究進(jìn)展

2023年12月5日發(fā)(作者：記憶深處的)

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熒光探針在細(xì)胞成像領(lǐng)域的研究進(jìn)展

楊媛;馬拉毛草;馬恒昌

【摘 要】熒光成像技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究手段,可對目標(biāo)分子進(jìn)行原位實(shí)時的監(jiān)測,且這種方法具有無損傷、高特異性和高靈敏度,以及能在細(xì)胞水平獲得更高的分辨率等優(yōu)勢.近年來,熒光材料在離子分子識別、醫(yī)學(xué)診斷、生物分子檢測以及生物成像等領(lǐng)域顯示出了重要的應(yīng)用價值,因此受到越來越多的化學(xué)和材料工作者的重視.綜述了碳納米材料、半導(dǎo)體量子點(diǎn)、稀土金屬、有機(jī)熒光小分子、聚合物熒光納米顆粒幾種常見不同類型的熒光探針材料在細(xì)胞成像領(lǐng)域的應(yīng)用,介紹了其發(fā)射波長、熒光量子產(chǎn)率、生物相容性、光穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性以及遺傳毒性等特性.設(shè)計(jì)并合成發(fā)射波長較長、Stokes位移大、生物相容性好、光穩(wěn)定性好、廉價的熒光探針將是熒光成像技術(shù)的主要研究方向.

【期刊名稱】《功能材料》

【年(卷),期】2018(049)009

【總頁數(shù)】7頁(P9031-9037)

【關(guān)鍵詞】熒光材料;熒光探針;細(xì)胞成像

【作 者】楊媛;馬拉毛草;馬恒昌

【作者單位】西北師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,生態(tài)環(huán)境相關(guān)高分子材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070;西北師范大學(xué) 逸夫圖書館,蘭州 730070;西北師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,生態(tài)環(huán)境相關(guān)高分子材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070 【正文語種】中 文

【中圖分類】O63

0 引 言

熒光成像技術(shù)是生物研究和臨床診斷中最廣泛，最有力的可視化技術(shù)之一，具有選擇性、可見性和可調(diào)性[1-2]。隨著熒光探針的多樣化及相關(guān)儀器的改進(jìn)，熒光成像技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子、細(xì)胞及組織等不同層次的成像，即標(biāo)記特殊離子，檢測生物大分子，示蹤活細(xì)胞的生物學(xué)行為、體內(nèi)特殊器官或腫瘤的成像等[3-4]。

熒光探針現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于化學(xué)傳感[5]、光電材料[6]、分子檢測[7]和生物活體成像[8]等領(lǐng)域。其中，對于熒光成像技術(shù)而言，熒光探針扮演了十分重要的角色，起到對觀察對象進(jìn)行標(biāo)記和示蹤的作用。因此，設(shè)計(jì)并合成/制備出發(fā)射波長范圍廣、熒光量子產(chǎn)率高、生物相容性好、細(xì)胞毒性小等的熒光探針成為化學(xué)和材料工作者研究的熱點(diǎn)，是重要的研究課題[9]。本文綜述了近幾年報(bào)道的熒光材料，主要包括無機(jī)熒光材料和有機(jī)熒光材料。無機(jī)熒光材料又包括碳納米材料、半導(dǎo)體量子點(diǎn)、稀土金屬等，有機(jī)熒光材料包括小分子熒光探針和聚合物熒光探針。這些材料因其優(yōu)異的性能可應(yīng)用于分子/離子檢測、細(xì)胞器成像以及細(xì)胞行為學(xué)研究。

1 無機(jī)材料熒光探針

1.1 碳納米熒光探針

1.1.1 富勒烯熒光探針

1985年Smalley等[10]報(bào)道了富勒烯之后，引起了化學(xué)工作者極大的關(guān)注。2016年Tan課題組[11]制備了一種水溶性熒光富勒烯(C60-TEG-COOH)包覆的介孔二氧化硅納米粒子(MSN)，用于pH敏感藥物釋放和細(xì)胞熒光成像，如圖1所示。在體外研究中，所制備的材料顯示出優(yōu)異的生物相容性并且載有DOX的納米載體表現(xiàn)出有效的抗癌能力。

1.1.2 碳量子點(diǎn)熒光探針

碳量子點(diǎn)(CDs)的發(fā)射波長橫越可見光區(qū)和近紅外區(qū)[12]，具有細(xì)胞毒性低、光穩(wěn)定性高等優(yōu)異性質(zhì)。2015年Tarasankar等[13]合成了CDs，其發(fā)射波長為390

nm,熒光量子產(chǎn)率達(dá)5.1%。如圖2所示，作者用CDs對L929活細(xì)胞進(jìn)行染色，用溴化乙錠(選擇性地染色死細(xì)胞)進(jìn)行對比，兩部分之間幾乎沒有重疊，說明CDs是非常好的活細(xì)胞成像的熒光探針。

1.1.3 碳納米管熒光探針

碳納米管按石墨烯層數(shù)可分為單壁碳納米管(SWCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)。2015年Antaris[14]等對碳納米管進(jìn)行簡單分離得到超高純度的(6,4)SWCNTs，可用于超高靈敏度的分子成像，甚至可檢測細(xì)胞表面上的某些特殊蛋白質(zhì)。

1.1.4 氧化石墨烯熒光探針

氧化石墨烯是石墨烯的重要衍生物，被廣泛運(yùn)用于生物成像中。2017年課題組制備了一種三苯胺衍生物改性的氧化石墨烯[15]。其表現(xiàn)出優(yōu)異的光學(xué)性能，在細(xì)胞成像當(dāng)中具有廣闊的應(yīng)用前景。它能夠?qū)epG2細(xì)胞進(jìn)行清晰地顯影，如圖3所示。

圖1 HeLa細(xì)胞熒光成像[11]Fig 1 Fluorescence microscopy images of HeLa

cell [11]

圖2 L929細(xì)胞熒光成像圖片[13]Fig 2 Fluorescence imaging of L929 cell [13]

圖3 染色30 min后，在不同的放大倍數(shù)下，HepG2細(xì)胞的熒光成像[15]

Fig 3 Fluorescence images of HepG2 cell stained with GO-KH550-DNDT for

30 min under different magnification[15]

1.1.5 納米金剛石熒光探針

納米金剛石是金剛石的納米顆粒。2018年Chen等[16]通過RAFT聚合得到了一種基于FND的復(fù)合材料，將其應(yīng)用于細(xì)胞成像。這種聚合方法可控，反應(yīng)時間短，環(huán)境友好，能耗低，在表面改性中提供了一種有應(yīng)用前景的聚合方法。

1.2 半導(dǎo)體量子點(diǎn)熒光探針

半導(dǎo)體量子點(diǎn)的發(fā)射波長可通過晶粒尺寸與組成進(jìn)行調(diào)控。2015年Yang等[17]制備了水溶性的鍺摻雜的硫化鎘量子點(diǎn)。鍺的摻雜使其熒光增強(qiáng)，同時提升其光穩(wěn)定性。在其表面修飾葉酸之后被用作熒光探針來標(biāo)記MCF-7細(xì)胞，葉酸與葉酸受體的靶向快速結(jié)合可以幫助該量子點(diǎn)很好地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞成像。

1.3 稀土金屬熒光探針

2015年Chen等[18]設(shè)計(jì)合成了一種銥配合物Ir-MitoNO作為雙光子磷光探針用于線粒體中NO的成像。其具有線粒體靶向和雙光子成像屬性，可將其應(yīng)用于實(shí)時監(jiān)測和追蹤活細(xì)胞線粒體中的NO。

2 有機(jī)材料熒光探針

2.1 有機(jī)小分子熒光探針

2.1.1 羅丹明類熒光探針

羅丹明類分子發(fā)射波長長，熒光量子產(chǎn)率高[19]，是熒光探針常用的發(fā)光基團(tuán)。2015年Wang等[20]合成了一類近紅外發(fā)射的羅丹明分子，光穩(wěn)定性好，Stokes位移大。其中AFR1、AFR1E和AFR2表現(xiàn)出線粒體靶向性，AFR3有溶酶體靶向性，如圖4所示。其在細(xì)胞成像方面具有潛在的應(yīng)用價值。

2.1.2 氟硼熒類熒光探針

氟硼熒類分子摩爾吸光系數(shù)大[21]，近年來對它的研究主要是傾向于設(shè)計(jì)合成長波長的分子。2014年Jiao等[22]合成了一系列近紅外吸收的氟硼熒分子。選擇溶解性好的A3分子和A4分子用于細(xì)胞成像。兩個分子都能快速的進(jìn)入細(xì)胞中，發(fā)射紅色熒光，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞成像能力，為近紅外熒光成像探針提供了一種設(shè)計(jì)思路。 圖4 羅丹明類分子結(jié)構(gòu)和羅丹明類分子分別對A549細(xì)胞的共聚焦成像[20]

Fig 4 The molecular structures of AFR dyes and confocal fluorescence

microscopy images of A549 cell incubated with compound AFR1, AFR1E,

AFR2 and AFR3[20]

2.1.3 熒光素類熒光探針

熒光素結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上的氫或者羥基氫被別的基團(tuán)取代后生成多種熒光素的衍生物，是重要的熒光探針材料。2015年，Chen等[23]報(bào)道了一個熒光素衍生物分子，其在水溶液中對Au3+的選擇性好，靈敏度高，將其成功用于細(xì)胞中Au3+的熒光成像。

2.1.4 菁類熒光探針

菁類分子的發(fā)射波長位于近紅外區(qū)(650～900 nm)，在生物成像中能有效避免生物體及細(xì)胞自吸收和自身熒光背景因素的干擾[24]，有利于生物活體深層組織成像研究。2018年Gao等[25]合成了一個新型自組裝納米膠囊CF-DiR NCs。其不僅可以將雙抗癌藥物直接遞送到腫瘤，達(dá)到最大的化學(xué)療法功效和最小的副作用，也可以在熒光成像指導(dǎo)下進(jìn)行精準(zhǔn)的光熱療法減少對周圍健康組織的傷害。

2.1.5 四苯乙烯(TPE)類熒光探針

四苯乙烯分子結(jié)構(gòu)簡單，是一種理想的熒光探針基底材料。TPE作為一個典型的聚集致誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)分子[26]，克服了傳統(tǒng)有機(jī)熒光分子進(jìn)入細(xì)胞后濃度增大導(dǎo)致熒光猝滅的缺點(diǎn)。2018年Tang等[27]通過引入特定烷基鏈來大大提高基于四苯乙烯(TPE) AIEgens的熒光量子產(chǎn)率，而保持其發(fā)光顏色不變。這種智能的AIEgens不僅具有壓力、溫度、粘度和光響應(yīng)性，而且被成功應(yīng)用于動態(tài)監(jiān)測和控制聚合物共混物中的相分離形態(tài)。

2.1.6 三苯胺(TPA)類熒光探針

2017年，課題組[28]合成了一系列以TPA為核的D-A體系化合物，如圖5所示。通過研究發(fā)現(xiàn)它們對ATP具有高靈敏度、特異性地識別。其中TPA-PPA-3檢測限高達(dá)0.3×10-6。

圖5 化合物TPA-PPA-1、TPA-PPA-2、TPAPPA-3和TPA-PP的分子式以及TPA-PPA-1、TPA-PPA-2、TPAPPA-3和TPA-PP的細(xì)胞熒光共聚焦成像[28]

Fig 5 Chemical structures of TPA-PP, TPA-PPA-1, TPA-PPA-2 and TPA-PPA-3 and co-staining of HepG2 cell with TPA-PP, TPA-PPA-1, TPA-PPA-2 and

TPA-PPA-3[28]

2.2 聚合物熒光納米顆粒熒光探針

聚膦腈化學(xué)交聯(lián)的納米體系可通過化學(xué)交聯(lián)的方法有效避免熒光分子之間的堆積和相互作用，進(jìn)而避免ACQ問題，來實(shí)現(xiàn)較好的熒光發(fā)射性能，同時聚膦腈納米體系優(yōu)異的生物相容性及可降解性也為其生物成像奠定了基礎(chǔ)。2014年，Lu等[29]制備出聚膦腈TPP-PZS顆粒。其表現(xiàn)出優(yōu)異的光漂白抗性，并且對Hg2+具有高靈敏度和選擇性，被用于快速檢測/監(jiān)測Hg2+。2015年，他們[30]通過一鍋縮聚制備得到PCTPDBF納米顆粒。其形態(tài)和大小可以通過改變?nèi)軇┖头磻?yīng)物濃度來調(diào)整。熒光單元被分離并“固定”在交聯(lián)結(jié)構(gòu)中，這可以很好地抑制熒光探針的ACQ效應(yīng)。因其具有良好的生物相容性、抗光漂白和抗蛋白質(zhì)干擾性，可以用作細(xì)胞成像的理想熒光劑。

2016年，課題組[31]將TPE與NIPAM共聚得到了具有多重功能的AIE熒光探針材料P6。將其應(yīng)用于HeLa細(xì)胞成像，通過傳代實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對第10代細(xì)胞仍然能夠清晰的顯影。課題組[32]又以TPA為核設(shè)計(jì)合成了化合物TPPA-DBO，考察了TPPA-DBO對于細(xì)胞核成像的普適性，其在細(xì)胞核靶向染色領(lǐng)域具有普遍的適用。如圖6所示，染料在細(xì)胞核區(qū)域熒光強(qiáng)度高，完全覆蓋細(xì)胞核區(qū)域。

圖6 化合物TPPA-DBO化學(xué)結(jié)構(gòu)式，TPPA-DBO對A549, HeLa, H4, HCM細(xì)胞系的細(xì)胞核染色[32]

Fig 6 The molecule structure of TPPA-DBO and nuclear staining of TPPA-DBO (10 μg/mL) toward living A549, HeLa, H4 and HCM cell [32]

3 結(jié) 語

在熒光成像的多種探針中，碳納米材料的種類豐富、細(xì)胞毒性最小，適用于活體成像，但是多數(shù)碳納米材料熒光量子產(chǎn)率低，對細(xì)胞背景抗干擾能力差。半導(dǎo)體量子點(diǎn)光漂白抗性差，所含金屬元素細(xì)胞毒性大。稀土金屬材料在細(xì)胞成像過程中表現(xiàn)出其獨(dú)特的熒光壽命優(yōu)勢，但是所含金屬元素細(xì)胞毒性也比較大。有機(jī)小分子熒光探針，熒光量子產(chǎn)率高，發(fā)光波長橫跨可見光和近紅外光區(qū)，能實(shí)現(xiàn)深層組織的成像，卻仍然受限于大部分有機(jī)小分子細(xì)胞毒性大、生物相容性差，不能實(shí)現(xiàn)更高分辨的細(xì)胞成像。聚合物分子合成方法復(fù)雜，溶解性差，不利于拓展應(yīng)用。相較于普通有機(jī)熒光材料，D-π-A體系的熒光探針，因其較好的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，所以具有良好的光穩(wěn)定性、抗光漂白性等優(yōu)點(diǎn)。因此，通過簡單的方法如設(shè)計(jì)合成D-π-A體系的化合物、與NIPAM等生物相容性好的化合物聚合、引入吡啶等雜環(huán)化合物，來得到發(fā)射波長較長、Stokes位移大、生物相容性好、光穩(wěn)定性好且廉價的熒光探針，并使其實(shí)現(xiàn)高分辨率的細(xì)胞成像，具有很大的研究價值與意義。

參考文獻(xiàn)：

【相關(guān)文獻(xiàn)】

[1] Giepmans B N G, Adams S R, Ellisman M H, et al. The fluorescent toolbox for asssing

protein location and function[J]. Science, 2006, 312(5771): 217-224.

[2] Kircher M F, Gambhir S S, Grimm J. Noninvasive cell-tracking methods[J]. Nature

Reviews Clinical Oncology, 2011, 8(11): 677.

[3] Vendrell M, Zhai D, Er J C, et al. Combinatorial strategies in fluorescent probe development[J]. Chemical Reviews, 2012, 112(8): 4391-4420.

[4] Umezawa K, Yoshida M, Kamiya M, et al. Rational design of reversible fluorescent

probes for live-cell imaging and quantification of fast glutathione dynamics[J]. Nature

Chemistry, 2017, 9(3): 279-286.

[5] Yue Y, Huo F, Yin C, et al. Recent progress in chromogenic and fluorogenic

chemonsors for hypochlorous acid[J]. Analyst, 2016, 141(6): 1859-1873.

[6] Mei J, Hong Y, Lam J W Y, et al. Aggregation-induced emission: the whole is more

brilliant than the parts[J]. Advanced Materials, 2014, 26(31): 5429-5479.

[7] Wang X, Hu J, Zhang G, et al. Highly lective fluorogenic multianalyte bionsors

constructed via enzyme-catalyzed coupling and aggregation-induced emission[J]. Journal

of the American Chemical Society, 2014, 136(28): 9890-9893.

[8] Liang G, Lam J W Y, Qin W, et al. Molecular luminogens bad on restriction of

intramolecular motions through host-guest inclusion for cell imaging[J]. Chemical

Communications, 2014, 50(14): 1725-1727.

[9] Lehn J M. Supramolecular chemistry[M]. Weinheim: Vch, Weinheim, 1995.

[10] Kroto H W, Heath J R, O’Brien S C, et al. C60: buckminsterfullerene[J]. Nature, 1985,

318(6042): 162-163.

[11] Tan L, Wu T, Tang Z W, et al. Water-soluble photoluminescent fullerene capped

mesoporous silica for pH-responsive drug delivery and bioimaging[J]. Nanotechnology,

2016, 27(31): 315104.

[12] Anilkumar P, Wang X, Cao L, et al. Toward quantitatively fluorescent carbon-bad

“quantum” dots[J]. Nanoscale, 2011, 3(5): 2023-2027.

[13] Jana J, Ganguly M, Das B, et al. One pot synthesis of intriguing fluorescent carbon

dots for nsing and live cell imaging[J]. Talanta, 2016, 150: 253-264.

[14] Antaris A L, Yaghi O K, Hong G, et al. Single chirality (6, 4) single-walled carbon

nanotubes for fluorescence imaging with silicon detectors[J]. Small, 2015, 11(47): 6325-6330.

[15] Lei L, Ma H, Yang M, et al. Fluorophore-functionalized graphene oxide with

application in cell imaging[J]. New Journal of Chemistry, 2017, 41(21): 12375-12379.

[16] Chen J, Liu M, Huang Q, et al. Facile preparation of fluorescent nanodiamond-bad

polymer composites through a metal-free photo-initiated RAFT process and their cellular

imaging[J]. Chemical Engineering Journal, 2018, 337: 82-90.

[17] Luo J, Bai H, Yang P, et al. One-pot aqueous synthesis of germanium-doped cadmium

sulfide quantum dots as fluorescent probes for cell imaging[J]. Materials Science in

Semiconductor Processing, 2015, 34: 1-7.

[18] Chen X, Sun L, Chen Y, et al. A fast and lective two-photon phosphorescent probe

for the imaging of nitric oxide in mitochondria[J]. Biomaterials, 2015, 58: 72-81. [19] Pastierik T, ebej P, Medalova J, et al. Near-infrared fluorescent 9-phenylethynylpyronin analogues for bioimaging[J]. The Journal of Organic Chemistry,

2014, 79(8): 3374-3382.

[20] Niu G, Liu W, Wu J, et al. Aminobenzofuran-fud rhodamine dyes with deep-red to

near-infrared emission for biological applications[J]. The Journal of Organic Chemistry,

2015, 80(6): 3170-3175.

[21] Bestte A, Hanan G S. Design, synthesis and photophysical studies of

dipyrromethene-bad materials: insights into their applications in organic photovoltaic

devices[J]. Chemical Society Reviews, 2014, 43(10): 3342-3405.

[22] Jiao L, Wu Y, Wang S, et al. Accessing near-infrared-absorbing BF2-azadipyrromethenes via a push-pull effect[J]. The Journal of Organic Chemistry, 2014,

79(4): 1830-1835.

[23] Kambam S, Wang B, Wang F, et al. A highly nsitive and lective fluorescein-bad

fluorescence probe for Au3+ and its application in living cell imaging[J]. Sensors and

Actuators B: Chemical, 2015, 209: 1005-1010.

[24] Guo Z, Park S, Yoon J, et al. Recent progress in the development of near-infrared

fluorescent probes for bioimaging applications[J]. Chemical Society Reviews, 2014, 43(1):

16-29.

[25] Gao C, Liang X, Mo S, et al. Near-infrared cyanine loaded liposome-like nanocapsules

of camptothecin-floxuridine conjugate for enhanced chemophotothermal combination

cancer therapy[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2018, 10(4):3219-3228.

[26] Hong Y, Lam J W Y, Tang B Z. Aggregation-induced emission[J]. Chemical Society

Reviews, 2011, 40(11): 5361-5388.

[27] Leung C W T, Hong Y, Chen S, et al. A photostable AIE luminogen for specific

mitochondrial imaging and tracking[J]. Journal of the American Chemical Society, 2012,

135(1): 62-65.

[28] Ma H, Yang M, Zhang C, et al. Aggregation-induced emission (AIE)-active fluorescent

probes with multiple binding sites toward ATP nsing and live cell imaging[J]. Journal of

Materials Chemistry B, 2017, 5(43): 8525-8531.

[29] Hu Y, Meng L, Lu Q. “Fastening” porphyrin in highly cross-linked polyphosphazene

hybrid nanoparticles: powerful red fluorescent probe for detecting mercury ion[J].

Langmuir, 2014, 30(15): 4458-4464.

[30] Meng L, Xu C, Liu T, et al. One-pot synthesis of highly cross-linked fluorescent

polyphosphazene nanoparticles for cell imaging[J]. Polymer Chemistry, 2015, 6(16): 3155-3163.

[31] Ma H, Qi C, Cheng C, et al. AIE-active tetraphenylethylene cross-linked N-isopropylacrylamide polymer: a long-term fluorescent cellular tracker[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2016, 8(13): 8341-8348.

[32] Ma H, Yang Z, Cao H, et al. One bioprobe: a fluorescent and AIE-active

macromolecule; two targets: nucleolus and mitochondria with long term tracking[J].

Journal of Materials Chemistry B, 2017, 5(4): 655-660.

-