一種同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑及其制備方法和應(yīng)用
1.本發(fā)明屬于生物化學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2.癌癥已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。化療、手術(shù)和放療這些傳統(tǒng)方法的效果差、毒副作用大，給患者的身心帶來了極大的痛苦，并且易復(fù)發(fā)。光動(dòng)力療法(pdt)和光熱療法(ptt)具有無創(chuàng)性、低耐藥性、局部的優(yōu)勢，通過光對光敏劑的激發(fā)使其產(chǎn)生活性氧(ros)和熱來殺死癌細(xì)胞，選擇性好、副作用小，因此在抗癌方面得到了廣泛的關(guān)注。
3.聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aie)型光敏劑在聚集狀態(tài)下分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)受到限制，非輻射減弱，輻射增強(qiáng)，具有熒光增強(qiáng)特性，同時(shí)聚集還能提高ros產(chǎn)生效率，為光動(dòng)力抗癌應(yīng)用提供了新契機(jī)。
4.光熱療法(ptt)是光敏劑吸收一定波長的光，從基態(tài)到激發(fā)態(tài)，能量通過振動(dòng)弛豫轉(zhuǎn)化為熱，產(chǎn)生的熱量使生物組織的溫度升高從而對癌細(xì)胞起到殺傷作用。ptt可以促進(jìn)免疫細(xì)胞的激活，并且隨著溫度的變化，生物組織的細(xì)胞形態(tài)和生存能力都會(huì)發(fā)生變化。對于腫瘤細(xì)胞而言，當(dāng)溫度升高到41℃時(shí)，細(xì)胞的跨膜擴(kuò)散和血流速度都會(huì)加快。在溫度為41～48℃時(shí)，細(xì)胞中的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生聚集，從而增加細(xì)胞對放化療的敏感性，并且這種高溫超過60min就會(huì)對細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷。若溫度升高至48-60℃，在短時(shí)間內(nèi)也會(huì)對細(xì)胞造成不可逆的損傷，如蛋白質(zhì)變性、dna受損等。而腫瘤組織由于存在供血差的特點(diǎn)，導(dǎo)致腫瘤組織對熱的耐受性會(huì)比正常組織差，這是ptt癌癥的基礎(chǔ)。
5.由于ptt具有與pdt相似的光激發(fā)特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于與pdt作用相結(jié)合來克服單一pdt抗癌的局限性。ptt過程中產(chǎn)生的熱量不僅能夠引起癌細(xì)胞的凋亡，還能使腫瘤內(nèi)血流量提高，為pdt過程提供更多的氧氣。此外，pdt過程產(chǎn)生的ros可以抑制熱休克蛋白的生成，有助于ptt更好的發(fā)揮作用。
6.目前，同時(shí)具有高效ros產(chǎn)生能力和光熱轉(zhuǎn)換效率的新型aie光敏劑還未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
7.本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明提供的光敏劑同時(shí)具有aie性質(zhì)、強(qiáng)的ros和光熱產(chǎn)生能力，可對癌細(xì)胞進(jìn)行高效的光動(dòng)力光熱協(xié)同殺傷，抗癌活性高。
8.為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
9.本發(fā)明提供了一種同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑，具有式i所示結(jié)構(gòu)：
[0010][0011]
所述式i中的a為
[0012]
所述式i中的r1和r2獨(dú)立的為氫、c
1～6
烷基、苯基、烷基取代的苯基或
[0013]
優(yōu)選的，所述式i中的r1和r2為c
1～6
烷基。
[0014]
優(yōu)選的，具有式i-1、式i-2或式i-3所示結(jié)構(gòu)：
[0015][0016]
本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述的同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑的制備方法，包括以下步驟：
[0017]
將第一反應(yīng)原料、第二反應(yīng)原料和有機(jī)溶劑混合，進(jìn)行knoevenagel反應(yīng)，得到式i所示同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑；
[0018]
所述第一反應(yīng)原料具有式ii所示結(jié)構(gòu)、式iv所示結(jié)構(gòu)或式v所示結(jié)構(gòu)；
[0019]
所述第二反應(yīng)原料具有式iii所示結(jié)構(gòu)；
[0020]
將所述第一反應(yīng)原料具有式iv所示結(jié)構(gòu)時(shí)，所述knoevenagel反應(yīng)的反應(yīng)原料還包括吡啶；
[0021]
將所述第一反應(yīng)原料具有式v所示結(jié)構(gòu)時(shí)，所述knoevenagel反應(yīng)的反應(yīng)原料還包括乙酸銨，所述knoevenagel反應(yīng)在保護(hù)氣體氛圍中進(jìn)行；
[0022][0023]
優(yōu)選的，所述第一反應(yīng)原料具有式ii所示結(jié)構(gòu)，所述第一反應(yīng)原料和第二反應(yīng)原料的摩爾比為1:1；所述knoevenagel反應(yīng)的溫度為常溫。
[0024]
優(yōu)選的，所述第一反應(yīng)原料具有式iv所示結(jié)構(gòu)，所述第一反應(yīng)原料、第二反應(yīng)原料與吡啶的摩爾比為1:1:1.5；所述knoevenagel反應(yīng)的溫度為常溫。
[0025]
優(yōu)選的，所述第一反應(yīng)原料具有式v所示結(jié)構(gòu)，所述第一反應(yīng)原料、第二反應(yīng)原料與乙酸銨的摩爾比為1:1:1.5；所述knoevenagel反應(yīng)的溫度為78℃。
[0026]
本發(fā)明提供了一種光動(dòng)力診療和光熱協(xié)同抗癌的試劑，包括上述技術(shù)方案所述的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑或上述技術(shù)方案所述的制備方法制備得到的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑。
[0027]
本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑或上述技術(shù)方案所述的制備方法制備得到的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
[0028]
本發(fā)明提供了一種改性光敏劑水分散液，包括水和分散于所述水中的改性光敏劑顆粒，所述改性光敏劑顆粒包括光敏劑顆粒和包覆于所述光敏劑顆粒表面的兩親性共聚物；所述光敏劑顆粒為上述技術(shù)方案所述的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑或上述技術(shù)方案所述的制備方法制備得到的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑。
[0029]
本發(fā)明提供了一種同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑，具有式i所示結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供的aie型光敏劑的分子結(jié)構(gòu)中存在d-a相互作用，有利于光敏劑的吸收和發(fā)射波長發(fā)生紅移，增加對生物組織的穿透深度，降低對生物組織的光損傷；本發(fā)明提供的光敏劑具有aie性質(zhì)，在聚集狀態(tài)下aie分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)受到限制，非輻射減弱，輻射增強(qiáng)，使其具有熒光增強(qiáng)的特性，同時(shí)，本發(fā)明提供的光敏劑能夠靶向活細(xì)胞內(nèi)的脂滴，進(jìn)行熒光成像，具有較強(qiáng)的ros和光熱產(chǎn)生能力。由實(shí)施例的結(jié)果表明，將式i-1、式i-2或式i-3所示結(jié)構(gòu)的光敏劑用于光動(dòng)力光熱協(xié)同抗癌，本發(fā)明提供的式i-1、式i-2或式i-3所示結(jié)構(gòu)的光敏劑對hela細(xì)胞具有良好的光動(dòng)力光熱協(xié)同殺傷效果，表明本發(fā)明提供的光敏劑有望用作熒光介導(dǎo)的pdt/ptt協(xié)同。
[0030]
本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述的同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑的制備方法，包括以下步驟：將第一反應(yīng)原料、第二反應(yīng)原料和有機(jī)溶劑混合，進(jìn)行knoevenagel反應(yīng)，得到式i所示同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑。本發(fā)明通過進(jìn)行knoevenagel反應(yīng)，制備得到式i所示結(jié)構(gòu)的同時(shí)具有ros和光熱產(chǎn)生能力的aie型光敏劑，制備方法步驟少，容易操作，適宜工業(yè)生產(chǎn)。
附圖說明
[0031]
圖1為2dmp3cn在不同甲苯體積分?jǐn)?shù)(f
t
)dmso/甲苯混合溶液中的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度與初始熒光強(qiáng)度的比值隨著f
t
的變化曲線；
[0032]
圖2為2dmp3cn nps與ros捕獲劑dcfh-da混合溶液在530nm處的熒光強(qiáng)度與初始熒光強(qiáng)度比隨光照時(shí)間的變化曲線；
[0033]
圖3為2dmp3cn nps溶液不同濃度條件下隨光照時(shí)間的溫度變化曲線(光功率：0.5w/cm2)；
[0034]
圖4為2dmp3cn nps溶液(摩爾濃度：100μm)隨光照時(shí)間的溫度變化曲線；
[0035]
圖5為2dmp3cn nps溶液在hela細(xì)胞中亞細(xì)胞器脂滴的實(shí)時(shí)熒光成像圖；
[0036]
圖6為不同濃度的2dmp3cn nps溶液對hela細(xì)胞的暗毒性和光毒性；
[0037]
圖7為本發(fā)明實(shí)施例1制備2dmp3cn的合成路線圖；
[0038]
圖8為實(shí)施例2制備的式i-1所示結(jié)構(gòu)的化合物在不同甲苯體積分?jǐn)?shù)(f
t
)dmso/甲苯混合溶液中的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度與初始熒光強(qiáng)度的比值隨著f
t
的變化曲線；
[0039]
圖9為實(shí)施例2制備的改性式i-1所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒溶液與ros捕獲劑dcfh-da混合溶液在530nm處的熒光強(qiáng)度與初始熒光強(qiáng)度比隨光照時(shí)間的變化曲線；
[0040]
圖10為實(shí)施例2制備的改性式i-1所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒溶液不同濃度條件下隨光照時(shí)間的溫度變化曲線(光功率：0.5w/cm2)；
[0041]
圖11為實(shí)施例2制備的改性式i-1所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒溶液(摩爾濃度：100μm)隨光照時(shí)間的溫度變化曲線；
[0042]
圖12為實(shí)施例2制備的改性式i-1所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒溶液在hela細(xì)胞中亞細(xì)胞器脂滴的實(shí)時(shí)熒光成像圖；
[0043]
圖13為實(shí)施例2制備的改性式i-1所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒溶液對hela細(xì)胞的暗毒性和光毒性；
[0044]
圖14為實(shí)施例3制備的式i-2所示結(jié)構(gòu)的化合物在不同甲苯體積分?jǐn)?shù)(f
t
)dmso/甲苯混合溶液中的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度與初始熒光強(qiáng)度的比值隨著f
t
的變化曲線；
[0045]
圖15為實(shí)施例3制備的改性式i-2所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒溶液與ros捕獲劑dcfh-da混合溶液在530nm處的熒光強(qiáng)度與初始熒光強(qiáng)度比隨光照時(shí)間的變化曲線；
[0046]
圖16為實(shí)施例3制備的改性式i-2所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒溶液不同濃度條件下隨光照時(shí)間的溫度變化曲線(光功率：0.5w/cm2)；
[0047]
圖17為實(shí)施例3制備的改性式i-2所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒溶液(摩爾濃度：100μm)隨光照時(shí)間的溫度變化曲線；
[0048]
圖18為實(shí)施例3制備的改性式i-2所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒溶液在hela細(xì)胞中亞細(xì)胞器脂滴的實(shí)時(shí)熒光成像圖；
[0049]
圖19為實(shí)施例3制備的改性式i-2所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒溶液對hela細(xì)胞的暗毒性和光毒性。
具體實(shí)施方式
[0050]
本發(fā)明提供了一種同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑，具有式i所示結(jié)構(gòu)：
[0051][0052]
所述式i中的a為
[0053]
所述式i中的r1和r2獨(dú)立的為氫、c
1～6
烷基、苯基、烷基取代的苯基或
[0054]
在本發(fā)明中，所述式i中的r1和r2優(yōu)選為c
1～6
烷基。
[0055]
在本發(fā)明中，所述同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑優(yōu)選具有式i-1、式i-2或式i-3所示結(jié)構(gòu)：
[0056][0057]
本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述的同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑的制備方法，包括以下步驟：
[0058]
將第一反應(yīng)原料、第二反應(yīng)原料和有機(jī)溶劑混合，進(jìn)行knoevenagel反應(yīng)，得到式i所示同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑；
[0059]
所述第一反應(yīng)原料具有式ii所示結(jié)構(gòu)、式iv所示結(jié)構(gòu)或式v所示結(jié)構(gòu)；
[0060]
所述第二反應(yīng)原料具有式iii所示結(jié)構(gòu)；
[0061]
將所述第一反應(yīng)原料具有式iv所示結(jié)構(gòu)時(shí)，所述knoevenagel反應(yīng)的反應(yīng)原料還包括吡啶；
[0062]
將所述第一反應(yīng)原料具有式v所示結(jié)構(gòu)時(shí)，所述knoevenagel反應(yīng)的反應(yīng)原料還包括乙酸銨，所述knoevenagel反應(yīng)在保護(hù)氣體氛圍中進(jìn)行；
[0063][0064][0065]
在本發(fā)明中，若無特殊說明，所有制備原料/組分均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的市售產(chǎn)品。
[0066]
在本發(fā)明中，所述第一反應(yīng)原料具有式ii所示結(jié)構(gòu)，所述第一反應(yīng)原料和第二反應(yīng)原料的摩爾比優(yōu)選為1:1。
[0067]
在本發(fā)明中，所述第一反應(yīng)原料具有式ii所示結(jié)構(gòu)，所述knoevenagel反應(yīng)的溫度優(yōu)選為常溫。
[0068]
在本發(fā)明中，所述第一反應(yīng)原料具有式ii所示結(jié)構(gòu)，本發(fā)明對所述knoevenagel反應(yīng)使用的有機(jī)溶劑沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的適用于進(jìn)行knoevenagel反應(yīng)的有機(jī)溶劑即可，具體如乙醇。本發(fā)明對所述有機(jī)溶劑的用量沒有特殊要求，能夠使反應(yīng)順利進(jìn)行即可。
[0069]
在本發(fā)明中，所述第一反應(yīng)原料具有式iv所示結(jié)構(gòu)，所述第一反應(yīng)原料、第二反應(yīng)原料與吡啶的摩爾比優(yōu)選為1:1:1.5。
[0070]
在本發(fā)明中，所述第一反應(yīng)原料具有式iv所示結(jié)構(gòu)，所述knoevenagel反應(yīng)的溫度優(yōu)選為常溫。
[0071]
在本發(fā)明中，所述第一反應(yīng)原料具有式iv所示結(jié)構(gòu)，本發(fā)明對所述knoevenagel反應(yīng)使用的有機(jī)溶劑沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的適用于進(jìn)行knoevenagel反應(yīng)的有機(jī)溶劑即可，具體如。本發(fā)明對所述有機(jī)溶劑的用量沒有特殊要求，能夠使反應(yīng)順利進(jìn)行即可。
[0072]
在本發(fā)明中，所述第一反應(yīng)原料具有式v所示結(jié)構(gòu)，所述第一反應(yīng)原料、第二反應(yīng)原料與乙酸銨的摩爾比優(yōu)選為1:1:1.5。
[0073]
在本發(fā)明中，所述第一反應(yīng)原料具有式v所示結(jié)構(gòu)，所述knoevenagel反應(yīng)的溫度優(yōu)選為78℃。
[0074]
在本發(fā)明中，所述第一反應(yīng)原料具有式v所示結(jié)構(gòu)，本發(fā)明對所述knoevenagel反應(yīng)使用的有機(jī)溶劑沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的適用于進(jìn)行knoevenagel反應(yīng)的有機(jī)溶劑即可，具體如乙醇。本發(fā)明對所述有機(jī)溶劑的用量沒有特殊要求，能夠使反應(yīng)順利進(jìn)行即可。
[0075]
在本發(fā)明中，所述第一反應(yīng)原料具有式v所示結(jié)構(gòu)，所述knoevenagel反應(yīng)在保護(hù)氣體氛圍中進(jìn)行，本發(fā)明對所述保護(hù)氣體氣氛沒有特殊限定，在常規(guī)的保護(hù)氣體氣氛中進(jìn)行即可，如氮?dú)夥諊蚨栊詺怏w氛圍。
[0076]
在本發(fā)明中，所述knoevenagel反應(yīng)優(yōu)選在攪拌條件下進(jìn)行，本發(fā)明對于所述攪拌的速率沒有特殊的限定，能夠攪拌均勻即可。
[0077]
本發(fā)明對于所述knoevenagel反應(yīng)的時(shí)間沒有特殊的限定，優(yōu)選通過本領(lǐng)域公知的薄層譜點(diǎn)板(tlc板)對所述knoevenagel反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)控，反應(yīng)至具有式iii所示結(jié)構(gòu)化合物完全消失即可。
[0078]
在本發(fā)明中，knoevenagel反應(yīng)后，本發(fā)明優(yōu)選還包括對knoevenagel反應(yīng)體系進(jìn)行后處理，得到式i所示同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑。
[0079]
在本發(fā)明中，所述后處理優(yōu)選包括以下步驟：
[0080]
將所述knoevenagel反應(yīng)得到的反應(yīng)液濃縮，得到濃縮物；
[0081]
將所述濃縮物進(jìn)行柱層析，得到純化反應(yīng)液；
[0082]
將所述純化反應(yīng)和二氯甲烷和正己烷的混合溶劑混合，進(jìn)行重結(jié)晶，固液分離后，得到式i所示同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑。
[0083]
本發(fā)明對所述濃縮的具體實(shí)施方式?jīng)]有特殊限定，采用常規(guī)的濃縮的方式即可，如旋蒸。
[0084]
在本發(fā)明中，所述柱層析用洗脫劑優(yōu)選為石油醚和乙酸乙酯的混合液，其中，石油醚和乙酸乙酯的體積比優(yōu)選為3:1。
[0085]
在本發(fā)明中，對所述柱層析得到的純化反應(yīng)液進(jìn)行所述重結(jié)晶時(shí)，所述二氯甲烷和正己烷的體積比優(yōu)選為1:6。
[0086]
在本發(fā)明中，所述固液分離優(yōu)選為過濾。
[0087]
本發(fā)明提供了一種光動(dòng)力診療和光熱協(xié)同抗癌的試劑，包括上述技術(shù)方案所述的同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑或上述技術(shù)方案所述的制備方法制備得到的同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑。
[0088]
本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述的同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑或上述技術(shù)方案所述的制備方法制備得到的同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
[0089]
本發(fā)明提供了一種改性光敏劑水分散液，包括水和分散于所述水中的改性光敏劑顆粒，所述改性光敏劑顆粒包括光敏劑顆粒和包覆于所述光敏劑顆粒表面的兩親性共聚物；所述光敏劑顆粒為上述技術(shù)方案所述的同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑或上述技術(shù)方案所述的制備方法制備得到的同時(shí)具有活性氧和光熱產(chǎn)生能力的聚集誘導(dǎo)發(fā)光型光敏劑。
[0090]
在本發(fā)明中，所述兩親性共聚物具體優(yōu)選為泊洛沙姆(f127)。
[0091]
本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述改性光敏劑水分散液的制備方法，包括以下步驟：
[0092]
將式i所示結(jié)構(gòu)的光敏劑和f127溶解于四氫呋喃(thf)中，得到混合溶液；
[0093]
將所述混合溶液和水進(jìn)行超聲混合，得到所述改性光敏劑納米顆粒的水分散液。
[0094]
在本發(fā)明中，具有式i所示結(jié)構(gòu)的光敏劑和f127的質(zhì)量比優(yōu)選為1：4～1：6，更優(yōu)選為1:5。
[0095]
在本發(fā)明中，所述混合溶液中式i所示結(jié)構(gòu)的光敏劑的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.1～0.4mg/ml更優(yōu)選為0.2mg/ml。
[0096]
在本發(fā)明中，所述混合溶液中f127的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.3～0.6mg/ml更優(yōu)選為0.5mg/ml。
[0097]
本發(fā)明優(yōu)選將所述混合溶液滴加至所述水中進(jìn)行所述超聲混合。
[0098]
在本發(fā)明中，所述超聲混合時(shí)，超聲的功率優(yōu)選為150w。
[0099]
在本發(fā)明中，所述滴加完畢后，本發(fā)明優(yōu)選繼續(xù)超聲3～5min。
[0100]
在本發(fā)明中，所述f127為兩親性共聚物，在超聲作用和親疏水相互作用下，f127和光敏劑進(jìn)行自組裝，疏水的光敏劑和f127的疏水部分相互作用，形成納米粒子的內(nèi)核，而f127的親水性部分則分散在粒子表面，形成f127包覆光敏劑納米顆粒的形式，得到改性光敏劑顆粒，使改性后的光敏劑均勻而穩(wěn)定的分散在水中，防止沉淀，最終制備成水溶性的納米顆粒(nps)水分散液。
[0101]
在本發(fā)明中，由于改性光敏劑納米顆粒獨(dú)特的高滲透/滯留的“被動(dòng)”腫瘤靶向能力，使夠使改性的光敏劑納米顆粒水分散液用于活體動(dòng)物體內(nèi)癌癥診斷和成為可能。
[0102]
為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明提供的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地描述，但不能將它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
[0103]
實(shí)施例1
[0104]
按照圖7所述的合成路線圖制備：
[0105]
將第一反應(yīng)原料(圖7中的化合物1，135mg，0.68mmol)、第二反應(yīng)原料(圖7中的化合物2，200mg，0.68mmol)和乙酸銨(78mg，1.02mmol)溶于乙醇中得到混合液。將混合液在78℃條件下反應(yīng)過夜，用tlc板監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程直至第二反應(yīng)原料完全消失，將反應(yīng)完全的反應(yīng)液濃縮，以石油醚(pe):乙酸乙酯(ea)＝3:1(v:v)為洗脫劑進(jìn)行柱層析得到純化反應(yīng)液，然后將純化反應(yīng)液與二氯甲烷:正己烷＝1:6(v:v)的混合溶劑混合進(jìn)行重結(jié)晶，得到深綠固體產(chǎn)物，產(chǎn)率：92％；
[0106]
對本實(shí)施例所得固體產(chǎn)物進(jìn)行表征，具體核磁數(shù)據(jù)如下：
[0107]1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.56-7.47(m,1h),7.36(d,j＝9.0hz,2h),7.16(d,j＝8.7hz,2h),6.82(d,j＝11.8hz,1h),6.76(d,j＝7.5hz,2h),6.69(d,j＝9.0hz,2h),6.51(d,j＝15.0hz,1h),3.10(s,12h),1.58(d,j＝4.4hz,6h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ173.85,161.78,152.22,151.73,149.53,133.04,131.85,128.03,125.52,122.43,114.49,113.16,112.30,111.55,111.28,96.34,40.26,40.15,26.76.
[0108]
根據(jù)上述核磁表征數(shù)據(jù)可知得到本實(shí)施例制備的同時(shí)具有ros和光熱產(chǎn)生能力的aie型光敏劑的結(jié)構(gòu)式如式i-3所示，記為2dmp3cn。
[0109][0110]
為了使2dmp3cn能夠被應(yīng)用于生物環(huán)境水體系，本實(shí)施例以2dmp3cn顆粒為光敏劑顆粒，以兩親性共聚物f127為包覆基質(zhì)，采用超聲的方法制備改性光敏劑納米顆粒水水分散液。制備步驟如下：
[0111]
將2dmp3cn和f127(2dmp3cn和f127質(zhì)量比為1:5)分散溶解在thf中，得到混合溶液，混合溶液中，2dmp3cn的質(zhì)量濃度為0.2mg/ml，f127的質(zhì)量濃度為0.5mg/ml；在超聲條件(超聲功率為150w)下向水中緩慢滴加所得混合溶液，滴加完畢后繼續(xù)超聲混合3～5min，得到改性的2dmp3cn納米顆粒(記為2dmp3cn nps)，的水分散液，然后用持續(xù)的氮?dú)獯捣鳚饪s后，再用pbs溶液稀釋，獲得指定濃度的2dmp3cn nps的pbs溶液。
[0112]
性能測試：
[0113]
(1)aie性質(zhì)測試：在不同甲苯體積分?jǐn)?shù)(f
t
)的dmso/甲苯混合溶液中加入2dmp3cn的dmso溶液(1mm)，得到濃度為10μm的2dmp3cn溶液，以600nm為激發(fā)波長測定不同甲苯體積分?jǐn)?shù)的混合溶液中在742nm處的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度與初始熒光強(qiáng)度的比值變化情況，測試結(jié)果如圖1所示。
[0114]
圖1為2dmp3cn在不同甲苯體積分?jǐn)?shù)的dmso/甲苯混合溶液中742nm處的熒光強(qiáng)度比隨甲苯體積分?jǐn)?shù)的變化情況，從低到高對應(yīng)的正己烷的體積分?jǐn)?shù)依次為0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和99％，激發(fā)光波長為600nm。從圖1中可以看出，隨著甲苯體積分?jǐn)?shù)的增加，2dmp3cn熒光發(fā)射強(qiáng)度比逐漸增加，直至90％之后出現(xiàn)一定程度的下降，這說明2dmp3cn具有aie性質(zhì)，甲苯體積分?jǐn)?shù)90％后的熒光下降可能是由于其聚集狀態(tài)的改變導(dǎo)致的。
[0115]
(2)ros產(chǎn)生能力測試：利用2
′
，7
′?
二氯熒光黃雙乙酸鹽(dcfh-da)為ros捕獲劑，檢測改性光敏劑納米顆粒2dmp3cn nps產(chǎn)生ros的效率。首先需要用無水乙醇配置濃度為1mm的dcfh-da母液，吸取500μl的dcfh-da的無水乙醇母液于naoh溶液中(2ml、10mm)，混合均勻，避光條件下保存30min以活化dcfh-da得到二氯熒光素(dcfh)溶液。最后將dcfh溶液加入到10ml pbs緩沖溶液(ph＝7.4、25mm)中，混合均勻后得到終濃度為40μm的dcfh溶液。在含有一定濃度光敏劑的2ml比皿中加入50μl的dcfh溶液，用cel-pe300l-3a太陽能模擬器白光光照，此為實(shí)驗(yàn)組。利用熒光光譜儀收集光照時(shí)間從0s開始，一定時(shí)間間隔的熒光光譜(激發(fā)波長為489nm，發(fā)射波長范圍：500-600nm)，將只加dcfh后光照組做為空白對照組，結(jié)果如圖2所示。
[0116]
圖2為2dmp3cn nps與ros捕獲劑dcfh混合溶液在530nm處的熒光強(qiáng)度與0s時(shí)的熒光強(qiáng)度比隨光照時(shí)間的變化情況。從圖2可以看出，隨著光照時(shí)間的延長，空白dcfh組熒光強(qiáng)度比無明顯變化，但有本實(shí)施例的光敏劑納米顆粒存在時(shí)，dcfh的熒光強(qiáng)度比上升明顯，說明2dmp3cn nps具有ros產(chǎn)生能力。
[0117]
(3)2dmp3cn nps的光熱產(chǎn)生能力測試：將改性光敏劑納米顆粒(2dmp3cn nps)配置成不同濃度的水溶液(0μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm)，吸取200μl上述溶液于0.5ml的pe管中，使用660nm的激光作為光源對納米粒子進(jìn)行光照，同時(shí)利用紅外熱成像儀監(jiān)測納米粒子溫度的變化。結(jié)果如圖3所示。固定2dmp3cn nps的濃度為100μm，改變激光功率，測定不同光功率下的納米粒子的溫度變化，最后用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果如圖3～4所示。
[0118]
圖3為不同濃度的2dmp3cn nps水溶液隨光照時(shí)間的溫度變化(光功率：0.5w/cm2)；圖4為不同光功率下的2dmp3cn nps水溶液隨光照時(shí)間的溫度變化(濃度：100μm)。從圖3可以看出，隨著光照時(shí)間的延長，納米粒子水溶液的溫度逐漸上升，表現(xiàn)出一定的濃度依賴性，從圖4可以看出，隨著光照時(shí)間的延長，納米顆粒水溶液的溫度逐漸上升，表現(xiàn)出光功率依賴性。證明上述光敏劑納米粒子有一定的光熱產(chǎn)生能力。
[0119]
(4)改性光敏劑納米顆粒對hela細(xì)胞的靶向熒光成像能力測試，具體步驟如下：
[0120]
將hela細(xì)胞鋪在共聚焦皿中放置在二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃，5％co2)中培養(yǎng)過夜。在hela細(xì)胞中加入商業(yè)染料bodipy 493/503(3μm)，孵化30min，pbs沖洗三次后加入2dmp3cn nps水溶液(50μm)孵化7h，使用蔡司lsm 880激光掃描顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行成像。2dmp3cn nps的激發(fā)波長為633nm，發(fā)射接收波長》645nm；bodipy 493/503的激發(fā)波長為488nm，發(fā)射接收波長為495～620nm，測試結(jié)果如圖5所示。
[0121]
圖5為2dmp3cn nps和商業(yè)脂滴染料bodipy 493/503對hela細(xì)胞的實(shí)時(shí)熒光成像圖，從圖5中可以看出，2dmp3cn nps可在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)明亮的紅熒光，商業(yè)脂滴染料bodipy493/503在細(xì)胞中呈現(xiàn)綠熒光，兩者的疊加圖可以看出，紅熒光和綠英光可以很好的重疊，說明2dmp3cn nps具有脂滴靶向熒光成像能力。
[0122]
(5)改性光敏劑納米顆粒對hela細(xì)胞光動(dòng)力光熱殺傷能力測試，具體步驟如下：
[0123]
hela細(xì)胞在含10％(體積含量)熱滅活胎牛血清、100mg
·
ml-1
青霉素和100mg
·
ml-1
鏈霉素的dmem(含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基)中，37℃條件下，在含有5％co2(體積含量)的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用mtt法測定細(xì)胞活力，mtt法是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性mtt(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑)還原為水不溶性的藍(lán)紫結(jié)晶甲臜并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。dmso能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，mtt結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。
[0124]
將100μl細(xì)胞懸液(5000個(gè)細(xì)胞/孔)置于96孔板中。37℃條件下，在含有5％co2的加濕培養(yǎng)箱中預(yù)孵育24h。孔中加入不同濃度的2dmp3cn nps水溶液，終濃度分別為0μm、0.5μm、1μm、2.5μm、5μm、10μm。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育16h后，用0.5w/cm2，660nm激光對hela細(xì)胞光照5min，繼續(xù)在37℃條件下孵育4h后，用含20μg/ml mtt的新鮮培養(yǎng)基(100μl)交換細(xì)胞培養(yǎng)液。孵育4h后移去培養(yǎng)基，加入100μl的dmso溶解甲臜晶體。用酶標(biāo)儀測定490nm處吸光度，作為光毒性組。未處理細(xì)胞作為對照。按照上述方法，區(qū)別在于不進(jìn)行光照處理，細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育20h后，用含20μg/ml mtt的新鮮培養(yǎng)基(100μl)交換細(xì)胞培養(yǎng)液。孵育4h后移去培養(yǎng)基，加入100μl的dmso溶解甲臜晶體。用酶標(biāo)儀測定490nm處吸光度，作為暗毒性組，測試結(jié)果如圖6所示。
[0125]
圖6為不同濃度的2dmp3cn nps對hela細(xì)胞的光動(dòng)力光熱殺傷情況。從圖6可以看出，隨著2dmp3cn nps濃度的增大，光毒性組hela細(xì)胞的存活率明顯下降，暗毒性組hela細(xì)胞的存活率均保持在80％左右，說明黑暗條件下，2dmp3cn nps對hela細(xì)胞具有較高的安全性，光照條件下，對hela細(xì)胞的光動(dòng)力光熱殺傷作用明顯。
[0126]
實(shí)施例2
[0127]
與實(shí)施例1的制備方法基本相同，不同之處在于：將化合物1替換為
[0128]
將所得產(chǎn)物進(jìn)行核磁表征，核磁數(shù)據(jù)為：1h nmr(500mhz,cdcl3)δ8.69
–
8.55(m,2h),8.39(d,j＝12.6hz,1h),7.82(d,j＝6.5hz,1h),7.69
–
7.60(m,2h),7.50(d,j＝8.8hz,2h),7.24(s,1h),6.77(d,j＝8.4hz,2h),6.68(d,j＝8.8hz,2h),3.10(d,j＝4.4hz,12h)
.
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ189.86,168.69,152.74,152.41,147.42,139.97,137.31,134.03,134.00,133.37,133.34,128.55,125.23,124.62,122.89,121.64,120.16,116.07,111.68,111.47,40.25,40.15.
[0129]
由核磁數(shù)據(jù)可知本實(shí)施例得到的同時(shí)具有ros和光熱產(chǎn)生能力的aie光敏劑的結(jié)構(gòu)式如式i-1所示。
[0130][0131]
將式i-1所示結(jié)構(gòu)的化合物和f127(2dmp3cn和f127質(zhì)量比為1:5)分散溶解在thf中，得到混合溶液，混合溶液中，式i-1所示結(jié)構(gòu)的化合物的質(zhì)量濃度為0.2mg/ml，f127的質(zhì)量濃度為0.5mg/ml；在超聲條件(超聲功率為150w)下向水中緩慢滴加所得混合溶液，滴加完畢后繼續(xù)超聲混合3～5min，得到改性的式i-1所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒的水分散液，然后用持續(xù)的氮?dú)獯捣鳚饪s后，再用pbs溶液稀釋，獲得指定濃度的改性的式i-1所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒的pbs溶液。
[0132]
按照實(shí)施例1的方法對實(shí)施例2所得式i-1的光敏劑的ros和光熱產(chǎn)生能力進(jìn)行測試，所得結(jié)果如圖8～13所示，與實(shí)施例1制備的產(chǎn)品測試結(jié)果相似。
[0133]
實(shí)施例3
[0134]
與實(shí)施例1的制備方法基本相同，不同之處在于：將化合物1替換為
[0135]
將所得產(chǎn)物進(jìn)行核磁表征，核磁數(shù)據(jù)為：1h nmr(500mhz,cdcl3)δ8.60(d,j＝12.7hz,1h),8.43(dd,j＝10.2,6.5hz,1h),8.35(d,j＝12.7hz,1h),7.58(t,j＝7.7hz,1h),7.52(d,j＝8.7hz,2h),7.25(s,2h),6.80(s,2h),6.71(d,j＝8.8hz,2h),3.13(d,j＝5.9hz,12h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ189.86,168.69,152.74,152.41,147.42,139.97,137.31,134.03,134.00,133.37,133.34,128.55,125.23,124.62,122.89,121.64,120.16,116.07,111.68,111.47,40.25,40.15.
[0136]
由核磁數(shù)據(jù)可知本實(shí)施例得到的同時(shí)具有ros產(chǎn)生能力的aie光敏劑的結(jié)構(gòu)式如式i-2所示。
[0137]
[0138]
將式i-2所示結(jié)構(gòu)的化合物和f127(2dmp3cn和f127質(zhì)量比為1:5)分散溶解在thf中，得到混合溶液，混合溶液中，式i-2所示結(jié)構(gòu)的化合物的質(zhì)量濃度為0.2mg/ml，f127的質(zhì)量濃度為0.5mg/ml；在超聲條件(超聲功率為150w)下向水中緩慢滴加所得混合溶液，滴加完畢后繼續(xù)超聲混合3～5min，得到改性的式i-2所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒的水分散液，然后用持續(xù)的氮?dú)獯捣鳚饪s后，再用pbs溶液稀釋，獲得指定濃度的改性的式i-2所示結(jié)構(gòu)的化合物納米顆粒的pbs溶液。
[0139]
按照實(shí)施例1的方法對實(shí)施例3所得式i-2的光敏劑的ros和光熱產(chǎn)生能力進(jìn)行測試，所得結(jié)果如圖14～19所示，與實(shí)施例1制備的產(chǎn)品測試結(jié)果相似。
[0140]
由以上實(shí)施例可知，本發(fā)明提供的同時(shí)具有ros和光熱產(chǎn)生能力的aie型光敏劑合成步驟簡單，分離純化操作簡便；對hela細(xì)胞有良好的光動(dòng)力光熱殺傷效果；同時(shí)，本發(fā)明所述光敏劑還具有良好的aie性質(zhì)，可靶向癌細(xì)胞脂滴進(jìn)行熒光成像，可用于構(gòu)建熒光介導(dǎo)的pdt/ptt抗癌藥物。
[0141]
盡管上述實(shí)施例對本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
