一種半夏人工種莖的快速繁殖方法
1.本發(fā)明屬于作物繁育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種半夏人工種莖的快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
2.半夏pinellia ternata（thunb.）breit.是天南星科多年生草本植物，是一種傳統(tǒng)的中藥材，以塊莖入藥，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)之功效。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在558種中藥處方中，半夏的使用頻率位居第22位，近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，半夏也有抗腫瘤的作用。隨著人們對(duì)中成藥需求的逐漸增加，半夏的野生資源已不能滿足市場(chǎng)需求，目前市場(chǎng)上的半夏多為人工栽培提供。甘肅省西和縣被農(nóng)業(yè)部評(píng)為“中國(guó)半夏之鄉(xiāng)”，總產(chǎn)量約占國(guó)內(nèi)市場(chǎng)份額的2/3。西和半夏是半夏中的精品，具有粒大、白、淀粉含量高和藥用價(jià)值高等特性。生產(chǎn)中半夏采用塊莖和珠芽進(jìn)行無性繁殖方式，不僅播種量很大，繁殖系數(shù)也不高，生產(chǎn)成本很高。近年來西和半夏多從外地調(diào)種，導(dǎo)致生產(chǎn)中外來病蟲草害在西和縣集聚，田間發(fā)病率高，減產(chǎn)嚴(yán)重。同時(shí)，長(zhǎng)期的無性繁殖使得病毒在植株中大量積累，抑制植株的正常生長(zhǎng)，使其種莖逐年衰退，嚴(yán)重影響了半夏的產(chǎn)量和品質(zhì)。利用組織培養(yǎng)技術(shù)，可以快速繁殖半夏優(yōu)良品種，提高半夏繁殖系數(shù)，降低生產(chǎn)成本和土地壓力，是半夏高效栽培的可行途徑。有關(guān)半夏組織培養(yǎng)的研究報(bào)道較多，但多數(shù)研究報(bào)道中半夏的離體塊莖均先通過誘導(dǎo)愈傷組織、叢生芽或一團(tuán)類原球莖，然后再進(jìn)一步誘導(dǎo)分化出試管塊莖，存在激素濃度高、步驟復(fù)雜、試管塊莖形態(tài)不完整、大小不均勻、遺傳不穩(wěn)定、形態(tài)發(fā)生能力的降低和甚至喪失等問題，再加之試管苗移栽需要煉苗程序復(fù)雜，影響了半夏試管苗在生產(chǎn)實(shí)踐的應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
3.本發(fā)明的目的是提供一種半夏人工種莖的快速繁殖方法，以解決上述問題。
4.為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種半夏人工種莖的快速繁殖方法，包括如下步驟：步驟一、萌發(fā)：將三葉半夏的塊莖播于蛭石與草木灰1：1比例的營(yíng)養(yǎng)土中萌發(fā)得到半夏植株；步驟二、選擇外植體并消毒：將步驟一得到的半夏植株取總?cè)~柄和塊莖作為外植體，（1）將總?cè)~柄切成1-2cm小段，用75%乙醇處理10s，0.1%中加1滴吐溫80后處理5min，2%次氯酸鈉處理8min，無菌水沖洗3次；（2）將塊莖切成0.3-0.4cm厚的薄片，用清水洗凈后，用滅過菌的打孔器鉆取塊莖內(nèi)部，并切去兩端帶皮的部分，用75%乙醇處理10s，0.1%加1滴吐溫80后處理5min，無菌水沖洗3次；步驟三、初代培養(yǎng)和誘導(dǎo)萌發(fā)：將步驟二得到的外植體分別平放到初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，先在弱光條件下誘導(dǎo)總?cè)~柄的一端和塊莖薄片上產(chǎn)生小塊莖，再將小塊莖置于中強(qiáng)光條件下誘導(dǎo)萌發(fā)得到試管苗；
步驟四、準(zhǔn)備繼代培養(yǎng)葉柄：取試管苗，剪下莖葉，取莖葉中的葉柄；步驟五、葉柄繼代培養(yǎng)：將得到的葉柄切成0.5-2cm的小段接種到繼代培養(yǎng)基中，先在弱光條件下誘導(dǎo)葉柄產(chǎn)生小塊莖，再將小塊莖置于中強(qiáng)光條件下萌發(fā)得到試管苗，剪下莖葉，取莖葉中的葉柄，保留小塊莖，取下的葉柄重復(fù)本步驟；步驟六、小塊莖二次成苗：向步驟五保留的小塊莖的培養(yǎng)瓶中添加液體培養(yǎng)基，小塊莖二次萌發(fā)得到試管苗；步驟七、人工種莖培育及播種：將步驟六得到的試管苗剪去莖葉，取莖葉中的葉柄，切成1.0cm小段，平放于種莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25℃、弱光條件的人工氣候箱中培養(yǎng)，得到形態(tài)完整的小塊莖，經(jīng)萌發(fā)成苗后，剪下莖葉后將小塊莖從培養(yǎng)瓶中取出，于室溫下晾干塊莖的根和剩余葉柄，得到人工種莖，將人工種莖播種于蛭石中發(fā)芽成苗。
5.為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟三、步驟五和步驟七中所述弱光條件的光照時(shí)長(zhǎng)為12-16h/d，光強(qiáng)為500-1000lx。
6.為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟三和步驟五中所述中強(qiáng)光條件的光照時(shí)長(zhǎng)為12-16h/d，光強(qiáng)為2000-3000lx。
7.為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟六中所述的試管苗重復(fù)步驟四至步驟七。即小塊莖二次成苗得到的試管苗重新進(jìn)入步驟四剪下莖葉并取得葉柄，然后進(jìn)入步驟五葉柄繼代培養(yǎng)及后續(xù)步驟，并重復(fù)若干次。
8.為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟七中所述的小塊莖經(jīng)萌發(fā)成苗后，剪下莖葉，取莖葉中的葉柄，重復(fù)步驟五至步驟七。即形態(tài)完整的小塊莖萌發(fā)得到的苗剪下莖葉取得的葉柄，也可以重新進(jìn)入葉柄繼代培養(yǎng)及后續(xù)步驟，并重復(fù)若干次。
9.為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟三中所述初代培養(yǎng)基配方為1/2ms+0.1mg/l 6-ba+0.01mg/l naa+3wt%蔗糖+0.8wt%瓊脂，ph5.8。
10.為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟五中所述繼代培養(yǎng)基配方為1/2ms+0.01mg/l 6-ba+0.001mg/l naa+3wt%蔗糖+0.8wt%瓊脂，ph5.8；為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟六中所述的液體培養(yǎng)配方為1/2ms+3wt%蔗糖，ph5.8。
11.為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟七中所述種莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2ms+3wt%蔗糖+0.8wt%瓊脂，ph5.8。
12.本發(fā)明相較于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為：本發(fā)明以葉柄為繁殖材料，直接誘導(dǎo)產(chǎn)生試管塊莖并萌發(fā)成苗。在繼代繁殖時(shí)采用低無機(jī)鹽、低激素濃度培養(yǎng)基，可促使葉柄形成塊莖及莖葉抽出的時(shí)間更早，縮短繼代時(shí)間，提高了繁殖效率，增殖倍數(shù)達(dá)9.2。
13.為了提高繁殖的效率，在剪去葉柄用于繼代繁殖的同時(shí)，向培養(yǎng)瓶中直接添加液體培養(yǎng)基，促使塊莖的二次萌發(fā)成苗，二次成苗僅需15d，不僅操作簡(jiǎn)便易行，可提高繁殖效率，增殖倍數(shù)達(dá)2.99，總增殖倍數(shù)達(dá)12.19。
14.本發(fā)明采用二次成苗的葉柄誘導(dǎo)產(chǎn)生一個(gè)形態(tài)完整的塊莖，經(jīng)萌發(fā)成苗，塊莖進(jìn)一步長(zhǎng)大成熟，可作為人工種莖使用，萌發(fā)率高達(dá)100%。
15.本發(fā)明設(shè)計(jì)的植株再生的途徑是在低激素濃度下誘導(dǎo)葉柄一端直接產(chǎn)生形態(tài)完整的小塊莖，與自然條件下珠芽產(chǎn)生的部位和的形態(tài)十分相似。塊莖發(fā)生不經(jīng)過愈傷組織階段，遺傳穩(wěn)定性高，能夠保持優(yōu)良品種的特征特性，是半夏離體快速繁殖的最佳途徑。同時(shí)，培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度降低，添加的激素濃度極低，生產(chǎn)成本大大降低。此外，經(jīng)二次成苗的健壯葉柄，可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生形態(tài)完整的小塊莖，再次萌發(fā)成苗后，塊莖明顯長(zhǎng)大，由此獲得成熟飽滿人工種莖，直接播種可以在土壤中萌發(fā)形成小植株，可省去試管苗誘導(dǎo)生根和馴化等步驟，便于實(shí)踐操作和規(guī)模化生產(chǎn)，是理想的播種材料，具有廣闊的生產(chǎn)應(yīng)用前景。同時(shí)也克服了用體細(xì)胞胚制作人工種子中存在的體細(xì)胞胚發(fā)生率低、篩選難和萌發(fā)率低的難題。離體塊莖具有較強(qiáng)的抗逆性、耐貯藏，不需特殊馴化可直接移栽于大田，成活率高，生產(chǎn)不受季節(jié)限制。本發(fā)明建立了增殖倍數(shù)高，遺傳穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低的半夏快速繁殖技術(shù)體系，可為半夏工廠化育苗提供技術(shù)支撐。
附圖說明
16.圖1為本發(fā)明中bx
②
培養(yǎng)基中不同外植體誘導(dǎo)獲得的試管苗生長(zhǎng)狀況的照片，其中，a.川子半夏塊莖、b.總?cè)~柄、c.小葉柄、d.佛焰苞中部、e.佛焰苞下部、f.珠芽；圖2為本發(fā)明中不同培養(yǎng)基中塊莖誘導(dǎo)獲得的試管苗生長(zhǎng)狀況的照片，其中，a.bx
①
；b.bx
②
；c.bx
④
；圖3為本發(fā)明中不同培養(yǎng)基中總?cè)~柄誘導(dǎo)獲得的試管苗生長(zhǎng)狀況的照片，其中，a.bx
①
；b.bx
②
；c.bx
④
；圖4為本發(fā)明中不半夏同長(zhǎng)度總?cè)~柄誘導(dǎo)離體塊莖誘導(dǎo)情況的照片，其中，a.2cm；b.1cm；c.0.5cm；d.0.2cm；圖5 離體塊莖的二次成苗情況，其中，a.200 mg/l水解酪蛋白；b.500 mg/l水解酪蛋白；c.200mg/l谷氨酰胺；d 1/2ms液體培養(yǎng)基；圖6為本發(fā)明中人工種莖培育和播種生長(zhǎng)狀態(tài)的照片，其中，a.離體塊莖誘導(dǎo)；b.人工種莖；c.人工種莖播種。
具體實(shí)施方式
17.下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
18.一種半夏人工種莖的快速繁殖方法，包括如下步驟：步驟一、萌發(fā)：將三葉半夏的塊莖播于蛭石與草木灰1：1比例的營(yíng)養(yǎng)土中萌發(fā)得到半夏植株；步驟二、選擇外植體并消毒：將步驟一得到的半夏植株取總?cè)~柄和塊莖作為外植體，（1）將總?cè)~柄切成1-3cm小段，用75%乙醇處理10s，0.1%中加1滴吐溫80后處理5min，2%次氯酸鈉處理8min，無菌水沖洗3次；（2）將塊莖切成0.3-0.4cm厚的薄片，用清水洗凈后，用滅過菌的打孔器鉆取塊莖內(nèi)部，并切去兩端帶皮的部分，用75%乙醇處理10s，0.1%加1滴吐溫80后處理5min，無菌
水沖洗3次；步驟三、初代培養(yǎng)和誘導(dǎo)萌發(fā)：將步驟二得到的外植體分別平放到初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，初代培養(yǎng)基配方為1/2ms+0.1mg/l 6-ba+0.01mg/l naa+3wt%蔗糖+0.7wt%瓊脂，ph5.8，先在弱光條件下誘導(dǎo)總?cè)~柄的一端和塊莖薄片上產(chǎn)生小塊莖，弱光條件的光照時(shí)長(zhǎng)為12-16h/d，光強(qiáng)為500-1000lx，再將小塊莖置于中強(qiáng)光條件下誘導(dǎo)萌發(fā)得到試管苗，強(qiáng)光條件的光照時(shí)長(zhǎng)為12-16h/d，光強(qiáng)為2000-3000lx；步驟四、準(zhǔn)備繼代培養(yǎng)葉柄：取試管苗，剪下莖葉，取莖葉中的葉柄；步驟五、葉柄繼代培養(yǎng)：將得到的葉柄切成0.5-2cm的小段接種到繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)基配方為1/2ms+0.01mg/l 6-ba+0.001mg/l naa+3wt%蔗糖+0.7wt%瓊脂，ph5.8，先在弱光條件下誘導(dǎo)葉柄產(chǎn)生小塊莖，弱光條件的光照時(shí)長(zhǎng)為12-16h/d，光強(qiáng)為500-1000lx，再將小塊莖置于中強(qiáng)光條件下萌發(fā)得到試管苗，強(qiáng)光條件的光照時(shí)長(zhǎng)為12-16h/d，光強(qiáng)為2000-3000lx，剪下莖葉，取莖葉中的葉柄，保留小塊莖，取下的葉柄重復(fù)本步驟；步驟六、小塊莖二次成苗：向步驟五保留的小塊莖的培養(yǎng)瓶中添加液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)配方為1/2ms+3wt%蔗糖，ph5.8，小塊莖二次萌發(fā)得到試管苗；步驟七、人工種莖培育及播種：將步驟六得到的試管苗剪去莖葉，取莖葉中的葉柄，切成1.0cm小段，平放于種莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，種莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2ms+3wt%蔗糖+0.7wt%瓊脂，ph5.8，置于25℃、弱光條件的人工氣候箱中培養(yǎng)，弱光條件的光照時(shí)長(zhǎng)為12-16h/d，光強(qiáng)為500-1000lx，得到形態(tài)完整的小塊莖，經(jīng)萌發(fā)成苗后，剪下莖葉后將小塊莖從培養(yǎng)瓶中取出，于室溫下晾干塊莖的根和剩余葉柄，得到人工種莖，將人工種莖播種于蛭石中發(fā)芽成苗。
19.其中，步驟六中的試管苗重復(fù)步驟四至步驟七。
20.其中，步驟七中的小塊莖經(jīng)萌發(fā)成苗后，剪下莖葉，取莖葉中的葉柄，重復(fù)步驟五至步驟七。
21.試驗(yàn)材料：三葉半夏pinellia ternata（thunb.）breit.的塊莖采集于甘肅省清水縣。塊莖播于蛭石與草木灰1：1比例的營(yíng)養(yǎng)土中，以萌發(fā)后植株的葉柄、珠芽和佛焰苞作外植體。
22.試驗(yàn)方法：一、初代培養(yǎng)1、外植體消毒試驗(yàn)
將總?cè)~柄按表1中的三種方法消毒，將消毒后的總?cè)~柄切成1-1.5cm的小段，接種到1/2ms培養(yǎng)基中。將塊莖用清水洗凈，用滅過菌的打孔器鉆取塊莖內(nèi)部，切去兩端帶皮的部分，然后采用表1中塊莖的兩種方法消毒，將消毒后的塊莖切成0.3-0.4cm的小片接種在1/2ms+3%蔗糖+0.8%瓊脂，ph5.8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選適宜的消毒方法。
23.從表2可看出，葉柄消毒方法中y3處理的污染率最低為0，即葉柄以75%乙醇10s
→
0.1%5min(1滴吐溫80)
→
2%次氯酸鈉8min
→
無菌水沖洗3次為最佳消毒方法，塊莖誘導(dǎo)率為100%。處理y1和y2的污染率分別為66.67%和44.44%。由此說明，僅使用75%乙醇和消毒效果不理想，盡管消毒的時(shí)間較長(zhǎng)達(dá)10min。75%乙醇、配合使用雙氧水，污染率也很高。葉柄的消毒方法也適用于佛焰苞和葉片采用。在塊莖消毒預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，塊莖生長(zhǎng)于地下，表面帶菌量多，直接進(jìn)行消毒污染率為100%。采用打孔器鉆取內(nèi)部的組織，切去兩端表皮再進(jìn)行消毒，污染率為0。即塊莖以75%乙醇10s
→
0.1%5min(1滴吐溫80)
→
無菌水沖洗3次的消毒方式最佳，塊莖誘導(dǎo)率為100%。
24.注：同列內(nèi)不同字母表示經(jīng)新復(fù)極差法檢驗(yàn)在p《0.05水平差異顯著，下同。
25.2、外植體的篩選將消毒好的塊莖切成0.3-0.4cm厚的薄片，總?cè)~柄、小葉柄、佛焰苞中部、佛焰苞下部切成1-2cm的小段，接種到1/2ms+6-ba 0.1mg/l+naa 0.01mg/l+3%蔗糖+0.8%瓊脂培養(yǎng)基（bx
②
）培養(yǎng)，篩選適宜的外植體。
26.以bx
②
為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以塊莖、總?cè)~柄、小葉柄、佛焰苞中部、佛焰苞下部、珠芽為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生試管塊莖。由表3得知，塊莖、總?cè)~柄、小葉柄、佛焰苞下部之間試管塊莖誘導(dǎo)率不存在顯著性差異，其中總?cè)~柄和佛焰苞下部誘導(dǎo)率高達(dá)100%。總?cè)~柄、塊莖、佛焰苞下部與佛焰苞中部和珠芽間塊莖誘導(dǎo)率存在顯著性差異。從試管塊莖的誘導(dǎo)數(shù)量來看，總?cè)~柄最多，為8.50個(gè)，其次是塊莖7.58個(gè)，兩者間并無顯著性差異。結(jié)合誘導(dǎo)率和塊莖數(shù)量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)分析，塊莖和總?cè)~柄是最佳的外植體。總?cè)~柄和小葉柄誘導(dǎo)的試管塊莖萌發(fā)后的長(zhǎng)勢(shì)健壯，塊莖的長(zhǎng)勢(shì)一般（見圖1）。塊莖和總?cè)~柄均可作為半夏組織培養(yǎng)適宜的外植體來源。
27.注：同列內(nèi)不同字母表示經(jīng)新復(fù)極差法檢驗(yàn)在p《0.05水平差異顯著，下同。
28.3、初代培養(yǎng)基的篩選以總?cè)~柄和塊莖為外植體，接種到ms+6-ba 2.0mg/l+naa 0.1mg/l+3%蔗糖+0.8%瓊脂培養(yǎng)基（bx
①
）；bx
②
；ms+6-ba 0.5mg/l+iaa 0.5mg/l+5%蔗糖+0.8%瓊脂（bx
④
）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選適宜的初代培養(yǎng)基。
29.選用塊莖和小葉柄為外植體，比較bx
①
、bx
②
、bx
④
培養(yǎng)基間誘導(dǎo)產(chǎn)生試管塊莖的情況（見圖2和3）。從表4可以看出，綜合塊莖誘導(dǎo)率、塊莖個(gè)數(shù)及生長(zhǎng)勢(shì)各指標(biāo)，對(duì)比分析三種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果，不同培養(yǎng)基對(duì)半夏試管塊莖誘導(dǎo)率有顯著性差異。培養(yǎng)基bx
①
和bx
②
中塊莖、總?cè)~柄和小葉柄誘導(dǎo)效果顯著優(yōu)于bx
④
培養(yǎng)基。雖然bx
①
與bx
②
激素濃度差異很大，但誘導(dǎo)效果差異不顯著，其原因可能是激素配比對(duì)誘導(dǎo)試管塊莖的影響很大。從再生植株的遺傳穩(wěn)定性和生產(chǎn)成本考慮，以低濃度激素配比培養(yǎng)基1/2ms+6-ba 0.1mg/l+naa 0.01mg/l+3%蔗糖+0.8%瓊脂（bx
②
）為宜。高濃度激素處試管塊莖數(shù)量多但個(gè)頭小，形態(tài)不完整連成一體，伴隨產(chǎn)生很多芽突，可能造成試管塊莖遺傳不穩(wěn)定及形態(tài)發(fā)生能力的降低甚至喪失。
30.二、繼代培養(yǎng)：1、不同長(zhǎng)度的總?cè)~柄對(duì)半夏試管塊莖誘導(dǎo)的影響試驗(yàn)將總?cè)~柄切成2cm、1cm、0.5cm、0.2cm四個(gè)長(zhǎng)度的小段，接種到1/2ms+3%蔗糖+0.8%瓊脂，ph5.8培養(yǎng)基中篩選適宜的外植體大小。
31.由表5可知，總?cè)~柄的長(zhǎng)度對(duì)試管塊莖誘導(dǎo)影響顯著。2cm、1cm和0.5cm長(zhǎng)總?cè)~柄半夏塊莖的誘導(dǎo)率均為100%。總?cè)~柄長(zhǎng)0.2cm時(shí)，僅在葉柄表面產(chǎn)生很多米粒狀突起，試管塊莖的誘導(dǎo)率和塊莖數(shù)量均為0。從誘導(dǎo)產(chǎn)生的塊莖數(shù)量來看，2cm、1cm和0.5cm長(zhǎng)總?cè)~柄間無顯著性差異，但從誘導(dǎo)產(chǎn)生的塊莖的大小上來說，2cm和1cm總?cè)~柄誘導(dǎo)產(chǎn)生的直徑大于0.4cm的塊莖數(shù)量最多，平均為0.92個(gè)，0.5cm葉柄僅有0.33個(gè)；2cm長(zhǎng)度誘導(dǎo)產(chǎn)生的0.3～0.4cm塊莖有1.75個(gè)，1cm葉柄有1.25個(gè)，此外，1cm葉柄還誘導(dǎo)產(chǎn)生0.2～0.3cm塊莖1個(gè)。因此，1cm總?cè)~柄誘導(dǎo)產(chǎn)生塊莖的數(shù)量最多，平均為3.17個(gè)，個(gè)頭較大，與2cm葉柄誘導(dǎo)效果差異不顯著。為了提高繼代擴(kuò)繁的增殖倍數(shù)，接種用總?cè)~柄的長(zhǎng)度應(yīng)為1cm。由表5可知，在
0.5cm～2cm范圍內(nèi)，雖然塊莖誘導(dǎo)率都高達(dá)100%，但隨著葉柄長(zhǎng)度的增加，誘導(dǎo)產(chǎn)生的大塊莖的數(shù)量增多，其原因可能是外植體越大，內(nèi)源激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量越多，越有利于產(chǎn)生更多的大塊莖，總?cè)~柄太短時(shí)外植體失去形態(tài)發(fā)生能力（見圖4）。因此，為了提高繁殖效率，宜選用1cm長(zhǎng)葉柄作繁殖材料。
32.2、不同激素濃度配比對(duì)繼代增殖的影響試驗(yàn)：以初代培養(yǎng)獲得的試管苗的小葉柄為外植體，接種在1/2ms基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的ba和naa，添加3%蔗糖和0.8%瓊脂，ph5.8，篩選適宜的繼代培養(yǎng)基（見表6和表7）。濃度的ba和naa，添加3%蔗糖和0.8%瓊脂，ph5.8，篩選適宜的繼代培養(yǎng)基（見表6和表7）。
33.以半夏總?cè)~柄1cm小段為外植體，將其接種在添加6種不同濃度ba和naa配比的1/2ms培養(yǎng)基上，篩選適宜的繼代培養(yǎng)基。由表7可以看出，ba0.01mg/l和naa0.001mg/l激素組合的試管苗生長(zhǎng)健壯，塊莖誘導(dǎo)率最高達(dá)100%，增殖倍數(shù)最高，與其它處理差異顯著。因此，在半夏繼代擴(kuò)繁時(shí)選用ba0.01mg/l和naa0.001mg/l激素濃度配較佳。
34.3、二次成苗對(duì)繼代增殖速率的影響：將表7中的最佳處理的試管苗地上部分全部剪掉（只剩小塊莖），在培養(yǎng)瓶中直接添加1/2ms液體培養(yǎng)基或1/2ms液體培養(yǎng)基附加50、200、500、1000mg/l水解酪蛋白或?qū)⒃嚬軌K莖轉(zhuǎn)接到新的1/2ms培養(yǎng)基固體、并定期觀察成苗情況。由表9可知，葉柄粗和平均葉柄長(zhǎng)各處理之間差異不顯著，說明二次成苗的植株均較健壯，植株高矮相當(dāng)，但每塊莖葉柄數(shù)和增殖倍數(shù)以轉(zhuǎn)接至含3%蔗糖的1/2ms固體培養(yǎng)基上最高，直接向原培養(yǎng)瓶中添加含3%蔗糖的1/2ms液體培養(yǎng)基與其無顯著性差異，添加培養(yǎng)液約4d后塊莖開始長(zhǎng)出新芽，15d后成苗（見表8）。向原有培養(yǎng)基中添加含3%蔗糖的1/2ms液體培養(yǎng)基可減少轉(zhuǎn)接過程，減少污染，和瓊脂用量，節(jié)約成本。因此，二次成苗的最佳方法是在原有培養(yǎng)基中添加含有3%蔗糖的1/
2ms的液體培養(yǎng)基。此外，二次成苗的植株明顯較一次成苗的植株生長(zhǎng)健壯，可用來誘導(dǎo)獲得飽滿的人工種莖。得飽滿的人工種莖。
35.4、蔗糖濃度對(duì)塊莖誘導(dǎo)和成苗的影響：將葉柄段接種在含有1%、3%、5%、7%和9%的不同濃度蔗糖的1/2ms培養(yǎng)基中，先進(jìn)行遮光培養(yǎng)，待塊莖成熟后（可見明顯莖尖）在進(jìn)行光照培養(yǎng)。定期觀察試管塊莖的形成及成苗情況。
36.葉柄接種4d后，一端開始輕微膨大；接種6后明顯膨大；接種14d后形成小圓球；接種19d后開始形成芽點(diǎn)，接種25d后有莖尖長(zhǎng)出；接種40d后葉片開始生長(zhǎng)；60d后塊莖長(zhǎng)成組培苗。不同蔗糖濃度生長(zhǎng)狀況以及變化的葉柄數(shù)如表10所示。由表10和11可以看出含1%蔗糖的培養(yǎng)基中塊莖形成較為緩慢，但其成苗速度快，且平均每個(gè)塊莖抽出的葉柄數(shù)最多，為3.47個(gè)，較其他處理具有明顯差異，但1%蔗糖于3%蔗糖的葉柄長(zhǎng)度不存在顯著差異，且均較其它處理葉柄長(zhǎng)度大。由每月增殖倍數(shù)來看，1%蔗糖增殖倍數(shù)最高，為7.38，顯著高于其它蔗糖濃度，因此，在半夏組織培養(yǎng)快速繁殖時(shí)，最佳的蔗糖濃度為1%。
37.5、繼代增殖倍數(shù)繼代培養(yǎng)由葉柄誘導(dǎo)產(chǎn)生塊莖及試管苗，約需45d時(shí)間，二次成苗需15d時(shí)間，即60d葉柄繼代的增殖倍數(shù)為24.4，平均每個(gè)月的增殖倍數(shù)達(dá)12.19，能夠達(dá)到植物快速繁殖的標(biāo)準(zhǔn)。
38.三、人工種莖培育及播種試驗(yàn)將二次成苗的健壯葉柄切成1.0cm的小段，平放于接種在1/2ms+3% 蔗糖+0.7%瓊脂，ph5.8培養(yǎng)基上，置于為25℃，光照時(shí)間12h/d，光強(qiáng)為500lx的人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)約35d左右小葉柄下端產(chǎn)生了一個(gè)獨(dú)立完整的試管塊莖。增加光強(qiáng)至2000lx培養(yǎng)萌發(fā)成苗后，剪去莖葉，從培養(yǎng)瓶中取出，于室溫下晾干塊莖的根和剩余葉柄，即得成熟飽滿人工種莖。試驗(yàn)所得的試管塊莖無需煉苗，直接播種于蛭石中，萌發(fā)率高達(dá)100%，小苗生長(zhǎng)健壯。
技術(shù)特征：
1.一種半夏人工種莖的快速繁殖方法，其特征在于包括如下步驟：步驟一、萌發(fā)：將三葉半夏的塊莖播于蛭石與草木灰1：1比例的營(yíng)養(yǎng)土中萌發(fā)得到半夏植株；步驟二、選擇外植體并消毒：將步驟一得到的半夏植株取總?cè)~柄和塊莖作為外植體；（1）將總?cè)~柄切成1-2cm小段，用75%乙醇處理10s，0.1%中加1滴吐溫80后處理5min，2%次氯酸鈉處理8min，無菌水沖洗3次；（2）將塊莖切成0.3-0.4cm厚的薄片，用清水洗凈后，用滅過菌的打孔器鉆取塊莖內(nèi)部，并切去兩端帶皮的部分，用75%乙醇處理10s，0.1%加1滴吐溫80后處理5min，無菌水沖洗3次；步驟三、初代培養(yǎng)和誘導(dǎo)萌發(fā)：將步驟二得到的外植體分別平放到初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，先在弱光條件下誘導(dǎo)總?cè)~柄的一端和塊莖薄片上產(chǎn)生小塊莖，再將小塊莖置于中強(qiáng)光條件下誘導(dǎo)萌發(fā)得到試管苗；步驟四、準(zhǔn)備繼代培養(yǎng)葉柄：取試管苗，剪下莖葉，取莖葉中的葉柄；步驟五、葉柄繼代培養(yǎng)：將得到的葉柄切成0.5-2cm的小段接種到繼代培養(yǎng)基中，先在弱光條件下誘導(dǎo)葉柄產(chǎn)生小塊莖，再將小塊莖置于中強(qiáng)光條件下萌發(fā)得到試管苗，剪下莖葉，取莖葉中的葉柄，保留小塊莖，取下的葉柄重復(fù)本步驟；步驟六、小塊莖二次成苗：向步驟五保留的小塊莖的培養(yǎng)瓶中添加液體培養(yǎng)基，小塊莖二次萌發(fā)得到試管苗；步驟七、人工種莖培育及播種：將步驟六得到的試管苗剪去莖葉，取莖葉中的葉柄，切成1.0cm小段，平放于種莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25℃、弱光條件的人工氣候箱中培養(yǎng)，得到形態(tài)完整的小塊莖，經(jīng)萌發(fā)成苗后，剪下莖葉后將小塊莖從培養(yǎng)瓶中取出，于室溫下晾干塊莖的根和剩余葉柄，得到人工種莖，將人工種莖播種于蛭石中發(fā)芽成苗。2.如權(quán)利要求1所述半夏人工種莖的快速繁殖方法，其特征在于：步驟三、步驟五和步驟七中所述弱光條件的光照時(shí)長(zhǎng)為12-16h/d，光強(qiáng)為500-1000lx。3.如權(quán)利要求1所述半夏人工種莖的快速繁殖方法，其特征在于：步驟三和步驟五中所述中強(qiáng)光條件的光照時(shí)長(zhǎng)為12-16h/d，光強(qiáng)為2000-3000lx。4.如權(quán)利要求1所述半夏人工種莖的快速繁殖方法，其特征在于：步驟六中所述的試管苗重復(fù)步驟四至步驟七。5.如權(quán)利要求1所述半夏人工種莖的快速繁殖方法，其特征在于：步驟七中所述的小塊莖經(jīng)萌發(fā)成苗后，剪下莖葉，取莖葉中的葉柄，重復(fù)步驟五至步驟七。6.如權(quán)利要求1所述半夏人工種莖的快速繁殖方法，其特征在于：步驟三中所述初代培養(yǎng)基配方為1/2ms+0.1mg/l 6-ba+0.01mg/l naa+3wt%蔗糖+0.8wt%瓊脂，ph5.8。7.如權(quán)利要求1所述半夏人工種莖的快速繁殖方法，其特征在于：步驟五中所述繼代培養(yǎng)基配方為1/2ms+0.01mg/l 6-ba+0.001mg/l naa+3wt%蔗糖+0.8wt%瓊脂，ph5.8。8.如權(quán)利要求1所述半夏人工種莖的快速繁殖方法，其特征在于：步驟六中所述的液體
培養(yǎng)配方為1/2ms+3wt%蔗糖，ph5.8。9.如權(quán)利要求1所述半夏人工種莖的快速繁殖方法，其特征在于：步驟七中所述種莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2ms+3wt%蔗糖+0.8wt%瓊脂，ph5.8。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種半夏人工種莖的快速繁殖方法，包括萌發(fā)、選擇外植體并消毒、初代培養(yǎng)和誘導(dǎo)萌發(fā)、準(zhǔn)備繼代培養(yǎng)葉柄、葉柄繼代培養(yǎng)、小塊莖二次成苗和人工種莖培育及播種。本發(fā)明設(shè)計(jì)的植株再生的途徑是在低激素濃度下誘導(dǎo)葉柄一端直接產(chǎn)生形態(tài)完整的小塊莖，塊莖發(fā)生不經(jīng)過愈傷組織階段，遺傳穩(wěn)定性高，能夠保持優(yōu)良品種的特征特性，是半夏離體快速繁殖的最佳途徑。經(jīng)二次成苗的健壯葉柄，可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生形態(tài)完整的小塊莖，再次萌發(fā)成苗后，塊莖明顯長(zhǎng)大，由此獲得成熟飽滿人工種莖，直接播種可以在土壤中萌發(fā)形成小植株。本發(fā)明建立了增殖倍數(shù)高，遺傳穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低的半夏快速繁殖技術(shù)體系，可為半夏工廠化育苗提供技術(shù)支撐。撐。
