地衣芽孢桿菌ZLP-81及其應(yīng)用
地衣芽孢桿菌zlp-81及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明涉及一種地衣芽孢桿菌zlp-81及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2.植物病蟲害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的損失，常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥防治不僅殺傷了大量 天敵和有益微生物、破壞了生態(tài)平衡，還使害蟲耐藥性急劇上升，對環(huán)境和人類 健康造成了極大的危害。為此，研究開發(fā)安全、高效、環(huán)境友好的產(chǎn)品及化肥農(nóng) 藥替代技術(shù)已成為保障糧食安全、食品安全和環(huán)境安全的戰(zhàn)略需求。
3.地衣芽孢桿菌是一類好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀細(xì)菌，該菌具有對人畜無毒無害、 環(huán)境友好、抗逆性強(qiáng)、繁殖速度快等特點(diǎn)，并能分泌多種活性物質(zhì)。研究表明， 該類微生物對立枯絲核菌、灰霉病菌、鐮刀病菌、枯萎病菌、早疫病菌、葉霉病 菌、黑斑病菌、病菌、霜霉病菌、黑星病菌、輪紋菌、小斑病等具有較強(qiáng)的 抑制作用，并能促進(jìn)作物生長。
4.但是，有關(guān)同時(shí)具有防病、殺蟲和促進(jìn)植物生長功能的菌株未見相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
5.本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)具有防病、殺蟲和促進(jìn)植物生長功能的地衣芽 孢桿菌zlp-81及其應(yīng)用。
6.本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
7.一種地衣芽孢桿菌(bacillus licheniformis)zlp-81，保藏編號為cgmcc no. 25028，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為： 中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為 2022年6月9日。
8.一種上述地衣芽孢桿菌zlp-81在防治鱗翅目害蟲、蜚蠊目害蟲、膜翅目害 蟲、蜈蚣目害蟲、半翅目害蟲、鞘翅目害蟲或直翅目害蟲中的應(yīng)用。
9.進(jìn)一步的，所述鱗翅目害蟲包括小菜蛾、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾和菜青蟲；所 述半翅目害蟲包括蚜蟲、白粉虱、斑衣蠟蟬；所述鞘翅目害蟲包括蠐螬、金針蟲 或擬地甲；所述直翅目害蟲包括蝗蟲、蟋蟀、螻蛄。
10.一種上述地衣芽孢桿菌zlp-81在防治植物病原菌、水產(chǎn)病原菌及金黃葡 萄球菌中的應(yīng)用。
11.進(jìn)一步的，所述植物病原菌包括：番茄葉霉病菌、番茄灰霉病菌、梨黑斑病 菌、鐮刀病菌、棉花枯萎病菌、黃瓜灰霉病菌、葡萄灰霉病菌、黃瓜病菌、 黃瓜霜霉病菌、黃瓜黑星病菌、蘋果輪紋菌、立枯絲核菌、玉米小斑病菌和番茄 早疫病菌。
12.進(jìn)一步的，所述水產(chǎn)病原菌包括：嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌和維氏氣 單胞菌。
13.一種上述地衣芽孢桿菌zlp-81在制備生防制劑、生物農(nóng)藥、土壤修復(fù)劑或 生物肥料中的應(yīng)用。
14.進(jìn)一步的，所述生物殺蟲劑、生物農(nóng)藥、生物肥料、生物種衣劑或土壤修復(fù) 劑中包
含地衣芽孢桿菌zlp-81菌體和/或發(fā)酵液；或是從發(fā)酵液中分離出的表面 活性素、伊枯草菌素、芬薺素或精子素。
15.一種殺蟲劑，其包括如下重量份的組分：地衣芽孢桿菌zlp-81菌株原粉 23.45～76.3份、粘結(jié)劑15.0～20.0份、分散劑1.0～1.5份、崩解劑2.5～3.0份、潤 濕劑0.9～1.4份以及增效劑0.55～2.15份。
16.進(jìn)一步的，所述地衣芽孢桿菌zlp-81菌株原粉通過如下方法制備：向地衣 芽孢桿菌zlp-81的發(fā)酵液中添加發(fā)酵液質(zhì)量7～13％的β-環(huán)糊精、5～13％的 caco3以及1.5～5.5％的mgso4后進(jìn)行噴霧干燥。
17.進(jìn)一步的，其還包括輔料0～52份。
18.其中，所述粘結(jié)劑選自可溶性淀粉、羧甲基纖維素、糊精。
19.其中，所述分散劑選自木質(zhì)素磺酸鈉、三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉。
20.其中，所述崩解劑選自硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、聚山梨酯80。
21.其中，所述潤濕劑選自大豆卵磷脂、磺化油、炔二醇。
22.其中，所用增效劑為：硅氧烷共聚物及多元醇混合物、聚醚改性三硅氧烷、 乙氧基改性聚三硅氧烷等有機(jī)硅類，增效醚、順丁烯二酸二乙酯、磷酸三苯酯等 解毒酶抑制劑類、松節(jié)油、茶皂素、天然陳皮精油、玉米胚芽油、油菜籽油、大 豆油、青皮桔油、松油、苦楝油、蓖麻油、薄荷油、百里香油、桉葉油、芝麻油、 橄欖油等植物油類、大豆軟磷脂非離子表面活性混合劑、聚天冬氨酸、烷基多糖 苷、d-檸檬烯、蜂蜜、丙酮、肉桂醛、松油烯-4-醇、川楝素、彈指間、倍 創(chuàng)、滲展寶、一可佳中的任意的1種以上。
23.進(jìn)一步的，其還包括1.10～1.70重量份的化學(xué)殺蟲劑、生物殺蟲劑或植物殺 蟲劑。
24.化學(xué)殺蟲劑包括：丙氨酸甲酯、苯醚甲環(huán)性、速克靈、進(jìn)口甲托、苯并咪唑 44號、密霉胺、福美霜、進(jìn)口藍(lán)粉、氯蟲苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯、乙基多 殺菌素、滅幼脲氯氰菊酯、吡蟲啉、、赤霉酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、 烯腺嘌呤、羥烯腺嘌呤、芐氨基嘌呤、24-表蕓苔素內(nèi)酯、22,23,24-表蕓苔素內(nèi) 酯、28-表高蕓苔素內(nèi)酯、28-高蕓苔素內(nèi)酯、14-羥基蕓苔素甾醇、三十烷醇、s
??
誘抗素、抗壞血酸、糠氨基嘌呤、二氫卟吩鐵、尿囊素、超敏蛋白、極細(xì)鏈格孢 激活蛋白、氨基寡糖素、香菇多糖、幾丁聚糖、葡聚烯糖、低聚糖素、β-羽扇豆 球蛋白多肽、膽鈣化醇、米爾貝霉素、二化螟性誘劑、斜紋夜蛾誘集性信息素、 綠盲蝽性信息素、梨小性迷向素、蘋果蠹蛾性信息素中的任意1種以上。
25.生物殺蟲劑包括：地衣芽孢桿菌、短穩(wěn)桿菌、多粘類芽孢桿菌、蘇云金芽孢 桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、海洋芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、蠟 質(zhì)芽孢桿菌、熒光假單胞桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌、短穩(wěn)桿菌、地衣芽孢桿菌、地 衣芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌、嗜硫小紅卵菌、白僵菌、球孢白僵菌、金龜子綠 僵菌、哈茨木霉菌、木霉菌、淡紫擬青霉、厚孢輪枝菌、耳霉菌、盾殼霉、小盾 殼霉、寡雄腐霉菌、蟑螂病毒、多角體病毒、顆粒體病毒、多殺霉素、阿維菌素、 蝗蟲微孢子蟲中的任意1種以上。
26.植物殺蟲劑包括：印楝素、苦參堿、、煙堿、魚藤酮、除蟲菊素、苦 皮藤素、桉油精、八角茴香油、狼毒素、雷公藤甲素、莪術(shù)醇、蛇床子素、丁子 香酚、大黃素甲醚、香芹酚、小檗堿、甾烯醇、茶皂素、螺威、大蒜素、d-檸檬 烯、萜烯醇、異硫氰酸烯丙酯、十五烯苯酚酸、十三烷苯酚酸、苯丙烯菌酮中的 任意1種以上。
27.一種殺菌劑，包括地衣芽孢桿菌zlp-81菌體或發(fā)酵液。
28.進(jìn)一步的，所述殺菌劑包括體積比為500∶1的地衣芽孢桿菌zlp-81的發(fā) 酵液和多菌靈溶液；所述多菌靈溶液為1g多菌靈與600～1000ml的水混合而成。
29.一種殺菌劑，包括從地衣芽孢桿菌zlp-81發(fā)酵液中分離出的表面活性素、 伊枯草菌素，芬薺素或精子素。
30.本發(fā)明的有益效果在于：
31.本發(fā)明的地衣芽孢桿菌zlp-81是一類好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀微生物，具有環(huán) 境友好、抗逆性強(qiáng)、繁殖速度快等特點(diǎn)，并能分泌多種活性物質(zhì)促進(jìn)植物生長。
32.本發(fā)明的地衣芽孢桿菌zlp-81具有較強(qiáng)的殺蟲活性，可以有效殺滅小菜蛾、 甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、菜青蟲等鱗翅目害蟲，蚜蟲、白粉虱、斑衣蠟蟬等半翅目 害蟲，蠐螬、金針蟲、擬地甲等鞘翅目害蟲，蝗蟲、蟋蟀、螻蛄等直翅目害蟲及 蜚蠊目的蟑螂、膜翅目螞蟻和蜈蚣目的蜈蚣。同時(shí)具有廣譜抗菌性，對灰霉病、 鐮刀病、枯萎病、早疫病、葉霉病、黑斑病、病、霜霉病、黑星病、輪紋病、 小斑病等多種植物病原菌均具有明顯的抑制效果，在開發(fā)為殺蟲或防病等功能微 生物制劑等方面具有良好的應(yīng)用前景。
附圖說明
33.圖1為地衣芽孢桿菌zlp-81菌落圖。
34.圖2為地衣芽孢桿菌zlp-81菌株圖。
具體實(shí)施方式
35.以下結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地闡述。以下實(shí)施例僅僅 用于說明和解釋本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明技術(shù)方案的限制。
36.實(shí)施例1地衣芽孢桿菌zlp-81的分離與篩選
37.(1)取土樣：從中國西藏昌都采集土壤樣品，每份50～100g；裝入已滅過 菌的牛皮紙袋內(nèi)，封好袋口，并記錄取樣地點(diǎn)、環(huán)境及日期。
38.(2)芽孢桿菌分離和純化：在pb培養(yǎng)基上用平板稀釋法對土壤樣品進(jìn)行 分離。具體操作如下：準(zhǔn)確稱取10g土壤樣品，加入到裝有玻璃珠的90ml 0.9％ 生理鹽水錐形瓶中，180r/min搖床振蕩30min，使土樣分布均勻制成土壤懸液， 濃度為10-1
；依次稀釋到濃度為10-5
、10-6
、10-7
。分別在80℃恒溫水浴30min， 各取100μl稀釋液涂布pb平板，平板于30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48h。挑取 不同形態(tài)的單菌落，用芽孢染進(jìn)行鑒定，芽孢桿菌用劃線法純化后轉(zhuǎn)接至pb 培養(yǎng)基試管斜面，30℃培養(yǎng)48h后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>39.(3)殺蟲防病作用菌株的篩選
40.殺蟲作用菌株的篩選：以蚜蟲為靶標(biāo)生物，將純化后的微生物進(jìn)行液體搖瓶 發(fā)酵培養(yǎng)后，發(fā)酵液以轉(zhuǎn)速12000r/min離心10min去菌體，上清液用0.22μm無 菌濾膜過濾制備無菌發(fā)酵濾液，發(fā)酵濾液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。取適量長度的蠶豆莖葉 放入錐形瓶中。對活蚜蟲及所在莖葉噴施適量稀釋液后放入錐形瓶內(nèi)，瓶口用薄 紗布覆蓋并用橡皮筋固定。2d后，對蚜蟲進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)，篩選出殺蟲效果較好 的菌株。
41.具有防病作用菌株的篩選：以黃瓜灰霉病為指示菌，采用平板對峙法進(jìn)行初 篩。在無菌操作室將pda培養(yǎng)基上長好的灰霉病原菌用打孔器制成d＝5mm菌 餅，然后將菌餅轉(zhuǎn)
接至pda培養(yǎng)基平板中央，再將初篩得到的各拮抗菌的無菌 濾液分別接至距病原菌2.5cm處，設(shè)3個重復(fù)，同時(shí)以只放病原菌菌餅的平板為 對照，26℃恒溫培養(yǎng)，待培養(yǎng)至ck長滿培養(yǎng)基時(shí)，開始測量菌落直徑并計(jì)算平 均抑制率。篩選出對病原菌拮抗作用強(qiáng)的菌株。將殺蟲防病效果較強(qiáng)的菌株進(jìn)行 了-80℃冷凍保藏。
42.(4)殺蟲防病作用菌株的鑒定
43.依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的實(shí)驗(yàn)方法，對篩選得到的殺蟲防病效果 較強(qiáng)的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定。將菌株在pb培養(yǎng)基平板上于32
±
1℃培 養(yǎng)14～16h，觀察到編號為zlp-81的菌落呈不規(guī)則圓形，顏呈白，無光澤， 表面粗糙，該菌體呈桿狀(如圖1～圖2所示)，芽孢呈橢圓形。其生理生化鑒 定指標(biāo)如表1所示。
44.表1菌株zlp-81的生理生化特性
[0045][0046]
注：“+”為陽性；“－”為陰性。
[0047]
通過形態(tài)學(xué)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)，確定編號為zlp-81的菌株為芽孢桿菌屬。 接著進(jìn)行分子生物學(xué)分類鑒定，采用16s rdna序列分析，提取菌株的總基因組 dna為模板擴(kuò)增其16s rdna序列。采用通用引物27f/1492r擴(kuò)增目的片段， 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用雙向測序方法進(jìn)行基因測序。測序 結(jié)果通過genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast序列同源性比對后將編號為zlp-81的菌 株鑒定為地衣芽孢桿菌(bacillus licheniformis)，命名為地衣芽孢桿菌zlp-81。
[0048]
地衣芽孢桿菌zlp-81送至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 進(jìn)行保藏，地址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研 究所，保藏編號為cgmcc no.25028，保藏日期為2022年6月9日。
[0049]
實(shí)施例2地衣芽孢桿菌zlp-81對鱗翅目害蟲、蜚蠊目蟑螂、膜翅目螞蟻 及蜈蚣目蜈蚣幼蟲的殺滅效果
[0050]
將地衣芽孢桿菌zlp-81進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。使用nb液體培養(yǎng)基，配方為：牛 肉膏5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 5g/l、葡萄糖10g/l，ph7.0。按照5％的接種量 接種于培養(yǎng)基后置于
180r/min、32℃的震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，獲得發(fā)酵液。
[0051]
將地衣芽孢桿菌zlp-81的發(fā)酵液稀釋成10倍、50倍、100倍，以清水處 理作對照。配置藥土，以清水配制藥土作為對照。并加入適量等量的食料拌勻。 采用藥土法，選取蟲體大小一致的鱗翅目的小菜蛾、斜紋夜蛾、甜菜夜蛾及菜青 蟲、蜚蠊目的蟑螂、膜翅目的螞蟻及蜈蚣目的蜈蚣幼蟲，在溫度為25℃～28℃的 環(huán)境中保持24h后。每處理試蟲數(shù)量為45頭，每個處理3個平行。接蟲后置于 室內(nèi)常溫培養(yǎng)，56h后統(tǒng)計(jì)死亡率，如表2所示。
[0052]
表2地衣芽孢桿菌zlp-81對鱗翅目害蟲及蜚蠊目蟑螂的滅殺作用
[0053][0054]
實(shí)施例3地衣芽孢桿菌zlp-81對蚜蟲等半翅目害蟲的殺蟲效果
[0055]
將地衣芽孢桿菌zlp-81進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)(同實(shí)施例2)。
[0056]
將發(fā)酵液稀釋成10倍、50倍、100倍，以清水處理作對照。豆蚜殺蟲實(shí)驗(yàn) 使用的食物為蠶豆幼莖、棉蚜殺蟲實(shí)驗(yàn)使用的食物為棉花幼莖、甘藍(lán)蚜殺蟲實(shí)驗(yàn) 使用的食物為甘藍(lán)嫩葉、白粉虱殺蟲實(shí)驗(yàn)使用的食物為番茄葉片，斑衣蠟蟬殺蟲 實(shí)驗(yàn)使用的食物為槐花，這五種食物均浸泡在上述藥液10min后用濾紙吸干水分， 取出放在墊有濾紙的廣口瓶后，加入2ml去離子水保濕，再將廣口瓶用保鮮膜 覆蓋，扎孔，每12h加1ml水。每個濃度下供試害蟲50頭，3次重復(fù)，挑50 頭年齡大小相近的害蟲放在準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿上饑餓4h，再分別加入上述藥液處 理過的蠶豆幼莖、棉花幼莖、甘藍(lán)嫩葉、番茄嫩葉及槐花，每12h更換一次，于 25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，記錄害蟲的死亡頭數(shù)，計(jì)算不同稀釋倍數(shù)下蚜蟲的死亡率。
[0057]
死亡率＝(死亡蟲數(shù)
÷
供試蟲數(shù))
×
100％
[0058]
死亡率測定：害蟲處理過夜后，用毛筆頭觸碰害蟲，若蟲不動則視為死亡， 統(tǒng)計(jì)并記錄死亡的害蟲頭數(shù)。由表3實(shí)施數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，地衣芽孢桿菌 zlp-81對半翅目昆蟲有良好的防治作用。
[0059]
表3地衣芽孢桿菌zlp-81對蚜蟲等半翅目昆蟲的殺蟲效果
[0060][0061]
實(shí)施例4地衣芽孢桿菌zlp-81對鞘翅目幼蟲的殺滅效果
[0062]
將地衣芽孢桿菌zlp-81進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)(同實(shí)施例2)。
[0063]
將地衣芽孢桿菌zlp-81的發(fā)酵液稀釋成10倍、50倍、100倍，以清水處 理作對照。配置藥土，以清水配制藥土作為對照。并加入適量等量的食料拌勻。 采用藥土法，選取蟲體大小一致的白星花金龜、金針蟲、擬地甲、桑天牛的三齡 幼蟲，在溫度為25℃～28℃的環(huán)境中保持24h后。每處理試蟲數(shù)量為15頭，每 個處理3個平行，重復(fù)3次。接蟲后置于室內(nèi)常溫培養(yǎng)，56h后統(tǒng)計(jì)死亡率，如 表4所示。
[0064]
表4地衣芽孢桿菌zlp-81對蠐螬等鞘翅目幼蟲的殺滅效果
[0065][0066]
實(shí)施例5地衣芽孢桿菌zlp-81對蝗蟲、蟋蟀、螻蛄等直翅目害蟲的殺蟲 效果
[0067]
將地衣芽孢桿菌zlp-81進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)(同實(shí)施例2)。
[0068]
將發(fā)酵液稀釋成10倍、50倍、100倍，以清水處理作對照。蝗蟲殺蟲實(shí)驗(yàn) 使用的食物為小麥、蟋蟀殺蟲實(shí)驗(yàn)使用的食物為毛豆、螻蛄殺蟲實(shí)驗(yàn)使用的食物 為白菜葉子，這三種食物均浸泡在上述藥液10min后用濾紙吸干水分，取出放在 墊有濾紙的廣口瓶后，加入2ml去離子水保濕，再將廣口瓶用保鮮膜覆蓋，扎 孔，每12h加1ml水。每個濃度下供試害蟲30頭，3次重復(fù)，挑30頭體重大 小相近的害蟲放在準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿上饑餓4h，再分別加入上述藥液處理過的小 麥、毛豆和白菜葉子，每12h更換一次，于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，記錄害蟲的 死亡頭數(shù)，計(jì)算不同稀釋倍數(shù)下害蟲的死亡率。
[0069]
死亡率＝(死亡蟲數(shù)
÷
供試蟲數(shù))
×
100％
[0070]
由表5實(shí)施數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，地衣芽孢桿菌zlp-81對蝗蟲、蟋蟀及螻蛄 等直翅目昆蟲有良好的防治作用。
[0071]
表5地衣芽孢桿菌zlp-81對蝗蟲等直翅目昆蟲的防治效果
[0072][0073]
實(shí)施例6地衣芽孢桿菌zlp-81的抑菌譜測定
[0074]
選取常見病原菌如：番茄葉霉病菌、番茄灰霉病菌、梨黑斑病菌、鐮刀病菌、 棉花枯萎病菌、黃瓜灰霉病菌、葡萄灰霉病菌、黃瓜病菌、黃瓜霜霉病菌、 黃瓜黑星病菌、蘋果輪紋菌、立枯絲核菌、玉米小斑病菌、番茄早疫病菌等多種 植物病原菌；嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、維氏氣單胞菌等水產(chǎn)病原菌及金 黃葡萄球菌為靶標(biāo)，采用平板對峙法測定菌株zlp-81的抑菌譜，確定zlp-81 菌株對病原菌生長的抑制能力。
[0075]
根據(jù)表6的實(shí)施結(jié)果可見，菌株zlp-81對所試18種病原菌均有較強(qiáng)的拮 抗作用，其中對番茄葉霉病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑可達(dá)25.20mm。說明 以地衣芽孢桿菌zlp-81的發(fā)酵液為活性成分的殺菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有良好的應(yīng) 用價(jià)值。
[0076]
表6地衣芽孢桿菌zlp-81對不同植物病原菌的抑制效果
[0077][0078][0079]
實(shí)施例7地衣芽孢桿菌zlp-81殺蟲劑(水分散粒劑)的制備
[0080]
(1)制備地衣芽孢桿菌zlp-81菌株原粉
[0081]
培養(yǎng)地衣芽孢桿菌zlp-81使用nb液體培養(yǎng)基，配方為：牛肉膏5g/l、蛋 白胨10g/l、nacl 5g/l、葡萄糖10g/l，ph7.0。按照5％的接種量接種于nb培 養(yǎng)基后置于180r/min、32℃的震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。將培養(yǎng)好的地衣芽孢桿菌 zlp-81的發(fā)酵菌液，進(jìn)行噴霧干燥，填料選11％的β-環(huán)糊精，9％的caco3，3％ 的mgso4，進(jìn)口溫度180℃，設(shè)置料液溫度為常溫22℃，風(fēng)速為30m3/h，入料 流量是15ml/min，噴霧干燥后獲得地衣芽孢桿菌zlp-81菌株原粉。
[0082]
(2)殺蟲劑的制作流程
[0083]
配方1的制備方法：將26.7％的地衣芽孢桿菌zlp-81菌粉與52.5％的輔料 (碳酸鈣)、15％的粘結(jié)劑可溶性淀粉、1.3％的分散劑木質(zhì)素磺酸鈉、2.9％的崩 解劑硫酸鈉、0.8％的潤濕劑大豆卵磷脂及0.8％的增效劑大豆油充分混合，通過 氣流粉碎機(jī)粉碎再混勻，然后加入蒸餾水捏合成塊，再通過造粒機(jī)進(jìn)行擠壓造粒， 得到的樣品放置烘箱中進(jìn)行45-50℃烘干，過40目振動篩得到地衣芽孢桿菌 zlp-81殺蟲劑。
[0084]
配方2的制備方法：將24％的地衣芽孢桿菌zlp-81菌株原粉與51.5％的輔 料(碳
酸鈣)、17.2％的粘結(jié)劑羧甲基纖維素、1.6％的分散劑三聚磷酸鈉、2.3％ 的崩解劑十二烷基硫酸鈉、1.5％的潤濕劑磺化油及1.9％的增效劑聚醚改性三硅 氧烷充分混合，通過氣流粉碎機(jī)粉碎再混勻，然后加入蒸餾水捏合成塊，再通過 造粒機(jī)進(jìn)行擠壓造粒，得到的樣品放置烘箱中進(jìn)行45-50℃烘干，過40目振動篩 得到地衣芽孢桿菌zlp-81殺蟲劑。
[0085]
配方3的制備方法：將25.35％的地衣芽孢桿菌zlp-81菌株原粉與50.5％的 輔料(碳酸鈣)、18.5％的粘結(jié)劑糊精、1％的分散劑焦磷酸鈉、2.5％的崩解劑聚 山梨酯80、1.2％的潤濕劑炔二醇及0.95％的增效劑乙氧基改性聚三硅氧烷充分 混合，通過氣流粉碎機(jī)粉碎再混勻，然后加入蒸餾水捏合成塊，再通過造粒機(jī)進(jìn) 行擠壓造粒，得到的樣品放置烘箱中進(jìn)行45-50℃烘干，過40目振動篩得到地衣 芽孢桿菌zlp-81殺蟲劑。
[0086]
配方1、配方2和配方3對小菜蛾的矯正殺蟲率為73％、74％和74％；對豆 蚜的矯正殺蟲率為66％、66％和67％；對蟋蟀的矯正殺蟲率為65％、66％和68％。
[0087]
實(shí)施例8地衣芽孢桿菌zlp-81殺菌劑(粉劑)的制備方法
[0088]
將地衣芽孢桿菌zlp-81的發(fā)酵菌液(同實(shí)施例2)和多菌靈溶液(1g多菌 靈溶于800ml水)按照500∶1的體積比均勻混合，然后進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干 燥后獲得地衣芽孢桿菌zlp-81殺菌劑的粉劑。
[0089]
實(shí)施例9地衣芽孢桿菌zlp-81殺菌劑的促生效果
[0090]
選用黃瓜為試驗(yàn)作物，室內(nèi)盆栽黃瓜種苗20株/盆，設(shè)3個平行，處理組施 用地衣芽孢桿菌zlp-81殺菌劑(實(shí)施例8)，對照組不施用任何促生產(chǎn)品。而 后隨機(jī)選10株28日齡黃瓜幼苗，用直尺測量幼苗的株高，游標(biāo)卡尺測量莖粗。 105℃殺青15min，75℃烘干至恒重，測定地上部和地下部干質(zhì)量，采用乙醇丙 酮浸提法測定葉綠素含量，用便攜式光合測定系統(tǒng)進(jìn)行光合參數(shù)的測定。從表7 可知，地衣芽孢桿菌zlp-81殺菌劑在對黃瓜幼苗的株高、莖粗、單株地上部鮮 質(zhì)量、單株地上部干質(zhì)量、葉面積、單株根鮮質(zhì)量、單株根干質(zhì)量、單株總根體 積、葉綠素總量和凈光合速率方面較ck提高了3.68％、10.99％、18.687％、15.41％、 0.49％、77.33％、8.51％、119.57％、63.54％和89.03％，且除株高、葉面積和單 株根干質(zhì)量外，都達(dá)到了差異顯著的水平。表明，本發(fā)明地衣芽孢桿菌zlp-81 殺菌劑對黃瓜幼苗有顯著的促生效果。
[0091]
表7地衣芽孢桿菌zlp-81殺菌劑對黃瓜幼苗的促生效果
[0092][0093]
注：同行相同字母代表p＞0.05，差異不顯著，不同字母代表p＜0.05，差 異顯著。
[0094]
實(shí)施例10地衣芽孢桿菌zlp-81殺蟲劑(包含其他殺蟲劑)的制備
[0095]
按照質(zhì)量比(見表8)，制作包含化學(xué)殺蟲劑、生物殺蟲劑、植物殺蟲劑的 地衣芽孢桿菌zlp-81殺蟲劑配方。其中菌粉為實(shí)施例7的步驟(1)所得到的 地衣芽孢桿菌zlp-81菌株原粉。
[0096]
制備方法：將地衣芽孢桿菌zlp-81菌株原粉與輔料混合后，再與粘結(jié)劑、 分散劑、崩解劑、潤濕劑、殺蟲劑及增效劑充分混合，通過氣流粉碎機(jī)粉碎再混 勻，然后加入蒸餾水捏合成塊，再通過造粒機(jī)進(jìn)行擠壓造粒，得到的樣品放置烘 箱中進(jìn)行45～50℃烘干，過40目振動篩得到地衣芽孢桿菌zlp-81殺蟲劑。
[0097]
所用輔料為碳酸鈣。
[0098]
所用粘結(jié)劑為：(1)可溶性淀粉、(2)羧甲基纖維素鈉、(3)糊精。
[0099]
所用分散劑為：(a)木質(zhì)素磺酸鈉、(b)三聚磷酸鈉、(c)焦磷酸鈉。
[0100]
所用崩解劑為：(a)硫酸鈉、(b)十二烷基硫酸鈉、(e)聚山梨酯80。
[0101]
所用潤濕劑為：(α)大豆卵磷脂、(β)磺化油、(γ)炔二醇。
[0102]
所用增效劑為：(1)硅氧烷共聚物、(2)聚醚改性三硅氧烷、(3)乙氧 基改性聚三硅氧烷等有機(jī)硅類，(4)增效醚、(5)順丁烯二酸二乙酯、(6) 磷酸三苯酯等解毒酶抑制劑類，(7)松節(jié)油、(8)茶皂素、(9)天然陳皮精 油、(10)玉米胚芽油、(11)油菜籽油、(12)大豆油、(13)青皮桔油、(14) 松油、(15)苦楝油、(16)蓖麻油、(17)薄荷油、(18)百里香油、(19) 桉葉油、(20)芝麻油、(21)橄欖油等植物油類，(22)大豆軟磷脂非離子表 面活性混合劑、(23)聚天冬氨酸、(24)烷基多糖苷、(25)d－檸檬烯、(26) 蜂蜜、(27)丙酮、(28)肉桂醛、(29)松油烯-4-醇、(30)川楝素、(31) 彈指間、(32)倍創(chuàng)、(33)滲展寶、(34)一可佳中任意的1種或2種以上。
[0103]
化學(xué)殺蟲劑包括：(1)丙氨酸甲酯、(2)苯醚甲環(huán)性、(3)速克靈、(4) 進(jìn)口甲托、(5)苯并咪唑44號、(6)密霉胺、(7)福美霜、(8)進(jìn)口藍(lán)粉、 (9)氯蟲苯甲酰胺、(10)高效氯氟氰
菊酯、(11)乙基多殺菌素、(12)滅 幼脲氯氰菊酯、(13)吡蟲啉、(14)、(15)赤霉酸、(16)吲哚乙 酸、(17)吲哚丁酸、(18)烯腺嘌呤、(19)羥烯腺嘌呤、(20)芐氨基嘌呤、(21)24-表蕓苔素內(nèi)酯、(22)22,23,24-表蕓苔素內(nèi)酯、(23)28-表高蕓苔素 內(nèi)酯、(24)28-高蕓苔素內(nèi)酯、(25)14-羥基蕓苔素甾醇、(26)三十烷醇、 (27)s-誘抗素、(28)抗壞血酸、(29)糠氨基嘌呤、(30)二氫卟吩鐵、(31) 尿囊素、(32)超敏蛋白、(33)極細(xì)鏈格孢激活蛋白、(34)氨基寡糖素、(35) 香菇多糖、(36)幾丁聚糖、(37)葡聚烯糖、(38)低聚糖素、(39)β-羽扇 豆球蛋白多肽、(40)膽鈣化醇、(41)米爾貝霉素、(42)括二化螟性誘劑、 (43)斜紋夜蛾誘集性信息素、(44)綠盲蝽性信息素、(45)梨小性迷向素、 (46)蘋果蠹蛾性信息素中的任意1種或2種以上。
[0104]
生物殺蟲劑包括：(1)枯草芽孢桿菌、(2)短穩(wěn)桿菌、(3)多粘類芽孢 桿菌、(4)蘇云金芽孢桿菌、(5)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、(6)海洋芽孢桿菌、 (7)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、(8)球形芽孢桿菌、(9)蠟質(zhì)芽孢桿菌、(10)熒光假 單胞桿菌、(11)側(cè)孢短芽孢桿菌、(12)短穩(wěn)桿菌、(13)地衣芽孢桿菌、(14) 解淀粉芽孢桿菌、(15)沼澤紅假單胞菌、(16)嗜硫小紅卵菌、(17)白僵菌、 (18)球孢白僵菌、(19)金龜子綠僵菌、(20)哈茨木霉菌、(21)木霉菌、 (22)淡紫擬青霉、(23)厚孢輪枝菌、(24)耳霉菌、(25)盾殼霉、(26) 小盾殼霉、(27)寡雄腐霉菌、(28)蟑螂病毒、(29)多角體病毒、(30)顆 粒體病毒、(31)多殺霉素、(32)阿維菌素、(33)蝗蟲微孢子蟲中的任意1 種或2種以上。
[0105]
植物殺蟲劑包括：(1)印楝素、(2)苦參堿、(3)、(4)煙堿、 (5)魚藤酮、(6)除蟲菊素、(7)苦皮藤素、(8)桉油精、(9)八角茴香 油、(10)狼毒素、(11)雷公藤甲素、(12)莪術(shù)醇、(13)蛇床子素、(14) 丁子香酚、(15)大黃素甲醚、(16)香芹酚、(17)小檗堿、(18)甾烯醇、 (19)茶皂素、(20)螺威、(21)大蒜素、(22)d-檸檬烯、(23)萜烯醇、 (24)異硫氰酸烯丙酯、(25)十五烯苯酚酸、(26)十三烷苯酚酸、(27)苯 丙烯菌酮中的任意1種或2種以上。
[0106]
表8地衣芽孢桿菌zlp-81殺蟲劑配方
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112][0113]
以上所述的實(shí)施例和方法是本發(fā)明的最佳實(shí)施方案，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原 理的前提下，還可以做出部分改變、修飾、替代、組合，都包含在本發(fā)明的保護(hù) 范圍之內(nèi)。
