納米纖維結構及其使用方法與流程
本申請根據35u.s.c.§119(e)要求2017年9月19日遞交的美國臨時專利申請號62/560,314的優先權。上述申請通過引用并入本文。
本發明是在政府支持下由美國國家衛生研究院(nih)授予的授權號r01gm123081做出的。政府對本發明具有一定的權利。
本發明涉及納米纖維和納米纖維結構領域。更具體地，本發明提供合成納米纖維結構的方法及其使用方法。
背景技術：
在整個說明書中引用了若干出版物和專利文獻，以便描述本發明所屬領域的技術狀態。這些引文的每一篇通過引用并入本文，如同完全闡述一樣。
電紡納米纖維的潛在應用包括能量儲存、醫療保健、生物技術、環境清潔、防御和安全(ramakrishna等人(2006)mater.today9:40-50；sridhar等人(2015)chem.soc.rev.,44:790-814；xie等人(2008)macromol.rapidcommun.,29:1775-1792)。由于能夠模擬細胞外基質(ecm)的結構和ecm中膠原原纖維的尺寸，電紡納米纖維已經廣泛用作組織修復和再生的支架材料(xie等人(2008)macromol.rapidcommun.,29:1775-1792；xie等人(2010)nanoscale2:35-44；xie等人(2010)nanoscale2:923-926；kennedy等人(2017)actabiomater.,50:41-55；liu等人(2012)adv.healthc.mater.,1:10-25)。常規電紡絲的一個限制因素是所生產的納米纖維墊完全由致密堆積的納米纖維組成，僅在片狀組裝的過程中提供表面多孔結構(mahjour等人(2016)j.biomed.mater.res.a,104:1479-1488；wu等人(2016)bioactivematerials1:56-64；sun等人(2012)nanoscale4:2134-2137)。用這種納米纖維墊孵育的細胞通常導致在其表面上形成細胞單層，而不是在整個墊中的三維(3d)細胞構建體(kang等人(2016)biofabrication8:025008)。差的細胞滲透歸因于納米纖維墊的孔隙率降低，并且纖維間孔的尺寸通常小于單個細胞的尺寸(mahjour等人(2016)j.biomed.mater.res.a,104:1479-1488)。此外，降低的孔隙率會限制氧和養分的運輸，進一步阻礙細胞浸潤(kim等人(2007)j.biomed.mater.res.bappl.biomater.,81:104-110)。因此，主要由于電紡技術的固有性質而導致的常規電紡納米纖維墊的不利特性限制了細胞在整個納米纖維墊中的浸潤和生長。顯然，需要改進的電紡墊。
技術實現要素：
根據本發明，提供了納米纖維/納米纖維結構。在一個特定的實施方案中，所述納米纖維/納米纖維結構包括包含多個納米纖維的膨脹納米纖維結構。在一個特定的實施方案中，納米纖維結構已通過暴露于亞臨界流體如亞臨界co2然后減壓(例如在容器內)而膨脹。所述納米纖維結構可以包含多個電紡納米纖維(例如，單軸對齊的、無規的、纏結的和/或電紡纖維)。所述納米纖維結構也可包括增強吸水性的材料，例如明膠、殼聚糖或膠原。在一個特定的實施方案中，所述納米纖維結構是交聯的。所述納米纖維結構還可以包含一種或多種藥劑或化合物，如劑。在一個特定的實施方案中，所述納米纖維結構包括多個孔(hole)，特別是孔陣列。在一個特定的實施方案中，所述納米纖維結構的孔包括細胞和/或組織。還提供了合成本發明的納米纖維結構的方法。
根據本發明的另一個方面，提供了使用所述納米纖維結構的方法。例如，所述納米纖維結構可用于增強傷口愈合、構建組織構建物、促進組織再生、減少、抑制、預防和/或消除感染、局部遞送藥物和/或抑制出血。
附圖說明
圖1a-1j顯示了對齊的納米纖維支架的膨脹和表征。圖1a:亞臨界co2流體第一次處理后的對齊的pcl納米纖維墊的照片(左)和原始pcl納米纖維墊的照片(右)。圖1b:第二次處理后的對齊的pcl納米纖維墊的照片(左)和原始pcl納米纖維墊的照片(右)。圖1c：在一次和兩次膨脹之后，對齊的pcl纖維墊的厚度。圖1d：在一次和兩次膨脹之后，對齊的pcl纖維墊的相應孔隙率。圖1e-1h：顯示在亞臨界co2流體中膨脹兩次之前(圖1e、1f)和膨脹之后(圖1g、1h)的對齊的pcl纖維墊的橫截面形態的sem圖像。比例尺為20μm。
圖2a-2d提供聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)納米纖維墊在亞臨界co2流體中膨脹之前(圖2a、2b)和膨脹之后(圖2c、2d)的照片。由于pvp納米纖維的高親水性，膨脹的pvp膜被保持在加蓋的管中以防止從周圍空氣冷凝的水溶解(圖2c)。在樣品溫度達到室溫后取出膨脹的膜(圖2d)。
圖3a-3c顯示負載有香豆素6的pcl納米纖維支架的膨脹。圖3a:顯示負載有香豆素6的nabh4膨脹的pcl纖維墊(nabh4)和負載有香豆素6的co2膨脹的pcl纖維墊(co2)的照片圖3b:負載有香豆素6的co2液體膨脹的pcl纖維墊(左上)、負載有香豆素6的nabh4膨脹的pcl纖維墊(左下)、負載有香豆素6的pcl纖維墊(右上)和原始的pcl纖維墊(右下)的俯視圖。插圖：每個樣品的熒光圖像。圖3c：通過imagej軟件量化的熒光強度。
圖4a-4b顯示了使用co2流體的負載有ll37的pcl納米纖維支架的膨脹。圖4a:ll37從膨脹和未膨脹的pcl纖維樣品中的體外釋放動力學(初始載藥量：5μg/mg)。圖4b:不同纖維樣品的抗菌性能。pcl：未膨脹的原始pcl納米纖維膜。pcl-ll37：負載有ll37的pcl納米纖維支架。圖4c提供了顯示在室溫下沖孔的納米纖維支架的sem圖像。左上：在納米纖維支架上的沖孔。右上：左上視圖的高放大倍數顯示了沖孔。左下：左上視圖的高放大倍數顯示了沖孔的壁。右下：左上視圖的高放大倍數顯示了沖孔的底部。沖孔周圍的區域顯示出缺少納米纖維形態。圖4d顯示了沖孔的pcl納米纖維支架的膨脹。左上：膨脹前沖孔的對齊的納米纖維支架的sem圖像。右上：顯示膨脹前沖孔的對齊的納米纖維支架的橫截面形態的sem圖像。插圖：膨脹前沖孔的對齊的納米纖維支架的橫截面積的高放大倍數。左下：顯示膨脹后沖孔的對齊的納米纖維支架的橫截面形態的sem圖像。右下：膨脹后沖孔的對齊的納米纖維支架的橫截面積的高放大倍數。
圖5a-5f顯示具有陣列孔的膨脹納米纖維支架和傳統納米纖維墊的體內響應。圖5a:h&e染。點表示細胞過濾區域的邊界。圖5b:masson三染法。箭頭指示膠原沉積。圖5c：圖5a的高度放大圖像。圖5d：圖5a的高度放大圖像。箭頭指示巨細胞。圖5e：每mm2的血管形成的定量。圖5f：每個植入物的巨細胞的定量。圖5g提供了在皮下植入大鼠后傳統納米纖維墊和周圍組織的代表性h&e染和masson三染圖像。
圖6a提供了具有陣列孔和周圍組織的3d膨脹納米纖維支架針對泛巨噬細胞的cd68-a表面標記物、m2期巨噬細胞的cd206-a表面標記物和m1期巨噬細胞的ccr7-a表面標記物的免疫組織學染。將納米纖維支架皮下植入大鼠中1周、2周和4周。圖6b提供了在皮下植入大鼠后傳統納米纖維墊和周圍組織的代表性免疫染圖像。
圖7a-7d顯示皮下植入后具有陣列孔的3d膨脹納米纖維支架和傳統納米纖維墊的免疫組織學分析的定量。顯示了cd68、ccr7(m1)、cd206(m2)免疫陽性細胞和cd163陽性細胞數(m2)/ccr7陽性細胞數(m1)的比率。通過對每個樣品以40×(物鏡)放大率測量六個掃描圖像獲得這些值。
圖8顯示了在皮下植入具有沖孔的3d膨脹納米纖維支架后的多核巨細胞。在手術后第1、2和4周處死大鼠。相對于泛巨噬細胞的cd68-a表面標記物、m2期巨噬細胞的cd206-a表面標記物和m1期巨噬細胞的ccr7-a表面標記物，對多核巨細胞進行染。箭頭指示多核巨細胞。
圖9提供了說明在皮下植入后，在傳統納米纖維墊的表面上和在具有陣列孔的膨脹3d納米纖維支架內的m1巨噬細胞(淺灰)、m2巨噬細胞(灰)(上圖)和多核巨細胞(下圖)的細胞浸潤和時空分布的示意圖。細胞浸潤區域用深灰標記。
具體實施方式
已經嘗試了許多方法來克服抑制納米纖維墊在再生醫學中使用的障礙。為了增加電紡納米纖維支架的孔尺寸，一種簡單直接的方式是調節纖維直徑(sell等人(2008)j.biomed.mater.res.a,85:115-126；balguid等人(2009)tissueeng.parta,15:437-444；fong等人(2013)proc.natl.acad.sci.,110:6500-6505；pham等人(2006)biomacromolecules7:2796-2805)。研究表明，大于4μm的纖維直徑可導致大于20μm的孔尺寸(pham等人(2006)biomacromolecules7:2796-2805)。該方法的問題是，具有微米級尺寸的纖維缺乏仿生特性，并且微纖維和細胞之間的相互作用可能不同于納米纖維和細胞之間的相互作用。在電紡絲期間用改進的收集器操縱電場也用于產生3d棉狀蓬松納米纖維支架(blakeney等人(2011)biomaterials32:1583-1590)。這種方法限于產生由缺乏納米形貌線索的無規納米纖維制成的支架，并且難以控制孔隙率。替代地，加入到電紡溶液中的離子鹽可以操縱基材和沉積的納米纖維之間的靜電排斥，以制造海綿狀納米纖維基質(jin等人(2015)angew.chem.,54:7587-7591)。這種方法僅產生有限厚度的納米纖維基質，并且必須使用可能在組織再生期間引起副作用或安全問題的添加劑(例如離子鹽)。增加孔隙率的另一種策略是選擇性地去除犧牲纖維(baker等人(2008)biomaterials29:2348-2358；baker等人(2012)proc.natl.acad.sci.,109:14176-14181)。這種方法僅產生孔隙率的有限增加。基于相似的原理，使用冰晶作為犧牲模板來制備具有大的互連孔的3d電紡納米纖維支架(leong等人(2009)j.biomed.mater.res.a,91:231-240)。類似地，在電紡絲過程中引入電紡納米纖維支架的鹽顆粒導致在瀝濾后形成大孔≈100μm(nam等人(2007)tissueeng.,13:2249-2257)。這種策略需要涉及多個步驟的犧牲模板的去除。如上所述，這些方法與各種問題相關，包括難以控制厚度、局限于某些材料、限制無規取向的納米纖維、需要添加劑、加工耗時、需要水溶液、膨脹比不足和/或多個步驟。
利用由水溶液中的化學反應產生的氣泡，電紡納米纖維墊可以在第三維中膨脹成具有有序結構(jiang等人(2015)acsbiomater.sci.eng.,1:991-1001；jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003；joshi等人(2015)chem.eng.j.,275:79-88)。與先前的方法相比，這種方法克服了上述缺點中的一些，并且顯示了在產生3d電紡納米纖維支架方面的一些改進。盡管納米纖維墊的膨脹伴隨在整個支架中發生細胞浸潤和增殖(jiang等人(2015)acsbiomater.sci.eng.,1:991-1001；jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003)，但膨脹過程仍存在一些問題：i)它是多步驟、耗時的過程，包括在水溶液中的氣體產生過程，隨后進行冷凍干燥；ii)存在nabh4可與聚合物或包封的物質反應的風險；iii)包封在纖維中的生物活性物質可能有損失；iv)對于摻入纖維中的材料，可能存在生物活性的損失；和v)該方法限于水不溶性材料。
亞臨界co2流體已用于油和香料萃取以及用于聚合物材料的加工，因為它無毒、不易燃、廉價且環境友好(garland等人(2016)j.essentialoilres.,28:55-63；taraj等人(2013)asianj.chem.,25:7361-7364；rout等人(2008)j.supercriticalfluids45:200-205；bhamidipati等人(2013)mater.sci.eng.cmater.biol.appl.,33:4892-4899；wang等人(2007)cellularpolym.,26:11-35；yang等人(2005)j.vac.sci.tech.b,23:3202)。本文中，一種通過將纖維墊浸入亞臨界co2流體中然后減壓而將傳統的電紡聚(ε-己內酯)(pcl)納米纖維墊從2d加工至3d的簡單且新穎的方法。用co2膨脹的3d納米纖維支架可具有與在水溶液中使用生成氣體的化學反應產生的支架類似的結構。與先前的方法相比，由于低溫過程，用co2膨脹的3d納米纖維支架還可以更好地保持包封的生物活性材料的活性。此外，與傳統的2d納米纖維膜相比，具有陣列孔的co2膨脹的3d納米纖維支架促進細胞浸潤、新血管形成和陽性宿主應答。
根據本發明，提供了納米纖維結構(有時在本文中稱為支架或納米纖維)。本發明的納米纖維可以通過任何方法制造。在一個特定的實施方案中，所述納米纖維結構包含電紡納米纖維。在一個特定的實施方案中，納米纖維結構包括單軸對齊的纖維、無規纖維和/或纏結纖維。雖然本申請一般性地描述了納米纖維(直徑小于約1μm(例如，平均直徑)的纖維)結構和三維納米纖維結構的合成，但本發明還涵蓋微纖維(直徑大于約1μm(例如，平均直徑)的纖維)結構和三維微纖維結構的合成。在一個特定的實施方案中，使用亞臨界流體或液體，特別是亞臨界co2，來膨脹所述納米纖維結構。亞臨界流體或液體的實例包括但不限于co2、n2、n2o、烴和碳氟化合物。例如，可通過暴露于、接觸或置于(例如浸沒或浸入)亞臨界液體/流體(例如亞臨界co2)然后減壓而膨脹納米纖維結構(例如墊)。將所述納米纖維結構置于亞臨界co2中并減壓的循環可以進行一次或多次，例如至少兩次或三次。所述納米纖維結構可以(例如在膨脹之前)進行交聯。
可以設想，本發明的納米纖維支架可以形成和制造成各種形狀(例如圓形、正方形、矩形)、尺寸和厚度。例如，所述納米纖維結構可以在膨脹之前進行切割或成形。在一個實施方案中，所述膨脹的納米纖維支架為約1至約20mm厚。在另一個實施方案中，所述膨脹的納米纖維支架為約1至約10mm厚。在另一個實施方案中，所述膨脹的納米纖維支架為約1至約5mm厚。
本發明的納米纖維可以包含任何聚合物。在一個特定的實施方案中，所述聚合物是生物相容性的。所述聚合物可以是可生物降解的或不可生物降解的。在一個特定的實施方案中，所述聚合物為生物可降解聚合物。聚合物可以是疏水性的、親水性的或兩親性的。在一個特定的實施方案中，聚合物是疏水性的。在一個特定的實施方案中，聚合物是親水性的。聚合物可以是例如均聚物、無規共聚物、共混聚合物、共聚物或嵌段共聚物。嵌段共聚物最簡單地定義為至少兩種不同聚合物片段或嵌段的共軛物。聚合物可以是例如線性、星狀、接枝、支化、基于樹枝狀的或超支化的(例如至少兩個支化點)。本發明的聚合物可具有約2至約10,000、約2至約1000、約2至約500、約2至約250，或約2至約100個重復單元或單體。本發明的聚合物可以包含封端末端。
疏水性聚合物的實例包括但不限于：聚(甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(n-異丙基丙烯酰胺)、聚乳酸(pla(或pdla))、聚(丙交酯-co-乙交酯)(plg)、聚乳酸-co-乙醇酸)(plga)、聚乙交酯或聚乙醇酸(pga)、聚己內酯(pcl)、聚天冬氨酸、聚噁唑啉(例如丁基、丙基、戊基、壬基或苯基聚(2-噁唑啉))、聚氧丙烯、聚谷氨酸、聚富馬酸丙二醇酯(ppf)、聚碳酸三亞甲基酯、聚氰基丙烯酸酯、聚氨酯、聚原酸酯(poe)、聚酐、聚酯、聚環氧丙烷、聚己內酯富馬酸酯、聚1,2-環氧丁烷、聚正環氧丁烷、聚乙烯亞胺、聚四氫呋喃、乙基纖維素、聚二吡咯/二咔唑、淀粉、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚二惡烷酮(pdo)、聚醚聚氨酯脲(peuu)、醋酸纖維素、聚丙烯(pp)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)、尼龍(例如尼龍6)、聚己內酰胺、pla/pcl、聚(3-酯-co-3-羥基戊酸酯)(phbv)、pcl/碳酸鈣，和/或聚苯乙烯。
親水性聚合物的實例包括但不限于：聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇和聚環氧乙烷(peo)、殼聚糖、膠原、硫酸軟骨素、藻酸鈉、明膠、彈性蛋白、透明質酸、絲纖蛋白、藻酸鈉/peo、絲/peo、絲纖蛋白/殼聚糖、透明質酸/明膠、膠原/殼聚糖、硫酸軟骨素/膠原，和殼聚糖/peo。
兩親性共聚物或聚合物復合材料可包含來自上文列出的那些(例如明膠/聚乙烯醇(pva)、pcl/膠原、殼聚糖/pva、明膠/彈性蛋白/plga、pdo/彈性蛋白、phbv/膠原、pla/透明質酸、plga/透明質酸、pcl/透明質酸、pcl/膠原/透明質酸、明膠/硅氧烷、plla/mwnt/透明質酸)的親水性聚合物(例如片段)和疏水性聚合物(例如片段)。
xie等人提供了特別用于靜電紡絲的聚合物的實例(macromol.rapidcommun.(2008)29：1775-1792；通過引用并入本文；參見例如表1)。用于本發明的纖維，特別是用于電紡納米纖維的化合物或聚合物的實例包括但不限于：天然聚合物(例如殼聚糖、明膠、i型、ii型和/或iii型膠原、彈性蛋白、透明質酸、纖維素、絲纖蛋白、磷脂(卵磷脂)、纖維蛋白原、血紅蛋白、纖維小牛胸腺na-dna、病毒m13病毒)、合成聚合物(例如plga、pla、pcl、phbv、pdo、pga、plcl、plla-dla、peuu、醋酸纖維素、peg-b-pla、evoh、pva、peo、pvp)、共混的(例如pla/pcl、明膠/pva、pcl/明膠、pcl/膠原、藻酸鈉/peo、殼聚糖/peo、殼聚糖/pva、明膠/彈性蛋白/plga、絲/peo、絲纖蛋白/殼聚糖、pdo/彈性蛋白、phbv/膠原、透明質酸/明膠、膠原/硫酸軟骨素、膠原/殼聚糖)和復合材料(例如pdla/ha、pcl/caco3、pcl/ha、plla/ha、明膠/ha、pcl/膠原/ha、膠原/ha、明膠/硅氧烷、plla/mwnts/ha、plga/ha)。在一個特定的實施方案中，所述納米纖維包含聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基苯酚、聚氯乙烯、纖維素、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、plga、膠原、聚己內酯、聚氨酯、聚氟乙烯、聚酰胺、絲、尼龍、聚苯并咪唑(polybennzimidazole)、聚碳酸酯、聚丙烯腈、聚乙烯醇、聚乳酸、聚乙烯-co-乙酸乙烯酯、聚環氧乙烷、聚苯胺、聚苯乙烯、聚乙烯咔唑、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯酸-聚芘甲醇、聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)、聚醚酰亞胺、聚乙二醇、聚(乙烯-co-乙烯醇)、聚丙烯腈、聚乙烯吡咯烷酮、聚間苯二甲酰間苯二胺、明膠、殼聚糖、淀粉、果膠、纖維素、甲基纖維素、聚丙烯酸鈉、淀粉-丙烯腈共聚物，和/或兩種或多種聚合物的組合。在一個特定的實施方案中，所述聚合物包括聚已酸內酯(pcl)。在一個特定的實施方案中，所述聚合物包括聚己內酯(pcl)和明膠(例如比率為1:1)。
在一個特定的實施方案中，所述納米纖維結構包含增強所述納米纖維結構吸收流體的能力的材料，所述流體特別是水溶液(例如血液)。在一個特定的實施方案中，所述納米纖維包括聚合物和增強吸收性能的材料。在一個特定的實施方案中，所述納米纖維結構涂覆有增強吸收性能的材料。術語“涂層(coat)”是指在結構表面上的物質/材料層。涂層可以但不必也浸漬所述納米纖維結構。此外，雖然涂層可以覆蓋100％的所述納米纖維結構，但涂層也可以覆蓋小于100％的所述納米纖維結構的表面(例如，可以覆蓋至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或更多的表面)。增強所述膨脹的納米纖維結構的吸收性能的材料包括但不限于：明膠、藻酸鹽、殼聚糖、膠原、淀粉、果膠、纖維素、甲基纖維素、聚丙烯酸鈉、淀粉-丙烯腈共聚物、其他天然或合成水凝膠，及其衍生物(例如，delvalle等人,gels(2017)3:27)。在一個特定的實施方案中，所述材料為水凝膠(例如，能夠在溶脹狀態下保水，特別是大量的水的聚合物基質)。在一個特定的實施方案中，所述材料為明膠。在一個特定的實施方案中，所述膨脹的納米纖維結構涂覆有約0.05％至約10％的涂層材料(例如，明膠)，特別是約0.1％至約10％的涂層材料(例如，明膠)或約0.1％至約1％的涂層材料(例如，明膠)。在一個特定的實施方案中，所述材料(例如，水凝膠)是交聯的。
在一個特定的實施方案中，本發明的納米纖維結構是交聯的。例如，本發明的納米纖維結構可以用交聯劑交聯，所述交聯劑例如但不限于：甲醛、多聚甲醛、乙醛、戊二醛、光交聯劑、京尼平和天然酚類化合物(mazaki等人,sci.rep.(2014)4:4457；bigi等人,biomaterials(2002)23:4827-4832；zhang等人,biomacromolecules(2010)11:1125-1132；通過引入并入本文)。交聯劑可以是雙官能、三官能或多官能交聯劑。在一個特定的實施方案中，所述交聯劑是戊二醛。
如上文所述，本發明的納米纖維結構是膨脹的。電紡納米纖維通常沉積在基底上以形成納米纖維墊。然而，所述納米纖維墊通常是致密且密實包裝的。這些納米纖維墊可通過使用亞臨界流體，尤其是亞臨界co2，進行膨脹。雖然本發明一般地描述為使用亞臨界co2，但也可如所述使用其它亞臨界流體。在一個特定的實施方案中，可將所述納米纖維結構暴露于亞臨界co2、與其接觸或置于其中，然后減壓。可將所述納米纖維結構多于一次地與亞臨界co2接觸或置于其中，然后減壓。通常，使用膨脹方法的次數越多，所述納米纖維(或微纖維)結構的厚度和孔隙率增加。例如，暴露于亞臨界co2然后減壓的循環可以進行1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次，特別是1-10次、1-5次或1-3次。在一個特定的實施方案中，暴露于亞臨界co2然后減壓的循環進行至少2次(例如2-5次、2-4次或2-3次)。在一個特定的實施方案中，所述方法包括將納米纖維結構和干冰(固體co2)置于密封容器中，允許干冰轉變為液體co2，然后將該容器開封以允許減壓。
所述納米纖維結構和亞臨界流體(例如亞臨界co2；或固體形式的亞臨界流體(例如干冰))可包含在任何合適的容器(例如可耐高壓的容器)中。例如，亞臨界流體和納米纖維結構可包含在不限于：腔室、罐、反應器、腔室和管內。在一個特定的實施方案中，在本發明的方法中使用的設備或容器將具有允許控制亞臨界流體的減壓速率的特征或部件。亞臨界流體的減壓可使用多種方法來完成，包括但不限于手動打開容器以降低壓力或通過使用可調節反應容器的減壓速率的某種類型的設備。
所述納米纖維結構也可在模具(例如，由金屬、塑料或具有限定形狀和/或可經受亞臨界流體(例如亞臨界co2)和減壓的其它材料制成)內膨脹，使得膨脹的納米纖維結構形成所需形狀(例如墊、管、圓柱體、矩形盒、珠等)。在一個特定的實施方案中，模具通過3d打印機合成。所述模具可以包含允許在納米纖維結構中沖壓相應孔的孔。本發明的納米纖維結構也可在膨脹后進行處理以形成所需形狀(例如墊、管、珠等)。
如上文所述，本發明的納米纖維結構也可以包含孔或洞。所述洞/孔可在納米纖維支架膨脹之前或之后在納米纖維支架中制成。在一個特定的實施方案中，在膨脹前插入所述納米纖維結構的孔。在一個特定的實施方案中，在插入或沖孔之前，所述納米纖維結構被冷凍(例如在液氮中)。所述納米纖維結構的孔可以是任何形狀(例如，正方形、圓形)。所述納米纖維結構的孔可以是任何尺寸。在一個特定的實施方案中，孔/洞具有約0.1至約5mm，特別是約0.5至約3mm或約1.0mm的長度/維度或直徑。所述孔可以以陣列(例如正方形陣列)組織在納米纖維結構內。在一個特定的實施方案中，所述納米纖維結構的孔通常彼此等距。所述納米纖維結構的孔/洞可以全部是相同的尺寸或者可以是不同尺寸。可在納米纖維支架中制備任何數量的洞。在一個實施方案中，洞的數目在約1和約200之間。可以使用多種方法制備洞。在一個實施方案中，使用具有預設孔的模具作為模板以在納米纖維支架中沖出洞/孔。所述模板可以使用各種技術來制造，包括但不限于3d打印。
在膨脹之后，納米纖維結構可以在水和/或期望的載體或緩沖液(例如，藥學或生物學可接受的載體)中洗滌或漂洗。可以通過對納米纖維結構施加真空來去除捕獲的氣泡。例如，膨脹的納米纖維結構可以浸沒或浸入在液體(例如水和/或期望的載體或緩沖液)中，并且可以施加真空以快速除去氣泡。在膨脹之后(例如，在漂洗和去除捕獲的氣體之后)，所述納米纖維結構可以儲存在冷溶液中、被凍干和/或冷凍干燥。
本發明的納米纖維結構液還可以是經過滅菌的。例如，可使用各種方法(例如通過用環氧乙烷氣體、γ輻射或70％乙醇處理)將所述納米纖維結構滅菌。
本發明的納米纖維結構的孔/洞可以包含細胞或組織。在一個特定的實施方案中，所述細胞對于待用納米纖維結構的受試者是自體的。任何細胞類型可以加入到孔/洞中。在一個特定的實施方案中，所述細胞包括干細胞。在一個特定的實施方案中，所述細胞包括真皮成纖細胞。在一個特定的實施方案中，所述孔/洞含有細胞球體。在一個特定的實施方案中，所述孔/洞包含組織樣本(例如組織糜)，諸如皮膚組織樣本或骨樣本。在一個特定的實施方案中，所述組織樣品具有約0.1至約5mm，特別是約0.5至約3mm或約1.0mm的長度/維度或直徑。所述細胞或組織可在納米纖維結構的孔/洞中培養(例如，所述細胞或組織可培養足夠的時間以允許浸潤到所述納米纖維結構中)。例如，可將所述細胞或組織在納米纖維結構中培養1天、2天、3天、4天、5天或更久。
本發明的納米纖維結構可包含或包封至少一種藥劑，特別是生物活性劑，例如藥物或劑(例如，鎮痛劑、生長因子、抗炎劑、信號分子、細胞因子、抗微生物劑(例如，抗細菌劑、抗生素、抗病毒劑和/或抗真菌劑)、凝血的藥劑、因子或蛋白質等)。在一個特定的實施方案中，所述藥劑是親水性的。所述藥劑可以在合成期間和/或合成之后添加到所述納米纖維結構。所述藥劑可以與納米纖維結構和/或涂層材料結合，被納米纖維結構包封，和/或涂覆在納米纖維結構上(例如，與增強納米纖維結構吸收流體的能力的涂層一起、在該涂層下面、和/或在該涂層上面)。在一個特定的實施方案中，所述藥劑不直接與所述納米纖維結構結合(例如包封的)。在一個特定的實施方案中，所述藥劑與所述納米纖維結構結合或連接(例如表面結合或涂層)。在一個特定的實施方案中，所述藥劑與所述膨脹納米纖維結構一起施用但不摻入所述膨脹的納米纖維結構中。
在一個特定的實施方案中，所述藥劑增強組織再生、組織生長和傷口愈合(例如生長因子)。在一個特定的實施方案中，所述藥劑/預防感染(例如抗微生物劑，如抗細菌劑、抗病毒劑和/或抗真菌劑)。在一個特定的實施方案中，所述藥劑為抗微生物劑，特別是抗細菌劑。在一個特定的實施方案中，所述藥劑增強傷口愈合和/或增強組織再生(例如，骨、肌腱、軟骨、皮膚、神經和/或血管)。例如，這樣的藥劑包括生長因子、細胞因子、趨化因子、免疫調節化合物和小分子。生長因子包括但不限于：血小板衍生生長因子(pdgf)、血管內皮生長因子(vegf)、表皮生長因子(egf)、成纖維細胞生長因子(fgf，多種同種型；例如堿性成纖維細胞生長因子(bfgf))、胰島素樣生長因子(igf-1和/或igf-2)、骨形態發生蛋白(例如bmp-2、bmp-7、bmp-12、bmp-9)、轉化生長因子(例如tgfβ、tgfβ3)、神經生長因子(ngf)、神經營養因子、基質衍生因子-1(sdf-1)、神經膠質細胞衍生的神經營養因子(gdnf)和/或角質形成細胞生長因子(kgf)。小分子包括但不限于辛伐他丁、kartogenin、維甲酸、紫杉醇、維生素d3等。
根據本發明的另一個方面，提供了合成所述納米纖維結構的方法。在一個特定的實施方案中，所述方法包括通過使納米纖維結構或墊接觸(例如浸沒或浸入)亞臨界co2(例如在密封容器中)并減壓來使納米纖維結構或墊膨脹。與亞臨界co2接觸和減壓可以重復一次以上。在一個特定的實施方案中，所述方法還包括在膨脹之前電紡所述納米纖維結構或墊。在一個特定的實施方案中，所述方法包括使所述納米纖維結構或墊交聯(例如在膨脹之前或之后)。在一個特定的實施方案中，所述方法還包括冷凍(例如用液氮)所述納米纖維結構或墊(例如在膨脹之前或之后)。在一個特定的實施方案中，所述方法還包括在納米纖維結構中插入孔或沖孔(例如在膨脹之前或之后)。在一個特定的實施方案中，所述方法還包括將所述膨脹的納米纖維結構洗滌和/或滅菌。在一個特定的實施方案中，所述方法還包括將細胞和/或組織接種到所述膨脹的納米纖維結構的孔或洞中。在一個特定的實施方案中，所述方法還包括在膨脹之前對所述納米纖維墊或結構進行等離子體處理。在一個特定的實施方案中，在氣體膨脹后在納米纖維結構中沖孔。在一個特定的實施方案中，所述方法還包括在納米纖維結構內培養細胞(例如使細胞從孔/洞浸潤納米纖維結構)。
本發明的納米纖維結構可用于產生用于各種應用的復雜組織結構，包括但不限于：傷口愈合、組織工程、組織生長、組織修復、組織再生和工程化3d體外組織模型。所述納米纖維結構還可以與各種水凝膠或生物基質/線索組合以形成可釋放生物功能分子的3d雜化支架。所述組織構建體可以用于許多組織缺陷(例如皮膚、骨)的再生和各種傷口(例如損傷、糖尿病傷口、靜脈潰瘍、壓力性潰瘍、燒傷)的愈合。所述納米纖維結構可以離體地用于產生組織或組織構建體/模型。所述納米纖維結構也可在患者(例如人或動物)體內用于各種疾病、病癥和傷口。在一個特定的實施方案中，當體內應用時，所述納米纖維結構刺激現有組織的生長和/或傷口或缺陷的修復。所述納米纖維支架可用于各種組織的工程化、生長和/或再生，包括但不限于皮膚、骨、軟骨、肌肉、神經組織和器官(或其部分)。
根據本發明，納米纖維結構可用于誘導和/或改善/增強傷口愈合，以及誘導和/或改善/增強組織再生。本發明的納米纖維結構可用于、抑制和/或預防任何損傷或傷口。例如，所述納米纖維結構可用于誘導、改善或增強與手術相關的傷口愈合(包括非選擇性(例如，緊急)外科手術或選擇性外科手術)。選擇性外科手術包括但不限于：肝切除術、腎部分切除術、膽囊切除術、血管縫合線加固和神經外科手術。非選擇性外科手術包括但不限于：嚴重的鼻出血、脾損傷、肝破裂、空腔傷口、輕微切口、刺傷、傷和彈片傷口。本發明的納米纖維結構還可以結合到輸送裝置(例如，注射器)中，所述輸送裝置使得其直接注射/輸送到所需部位(例如傷口，如傷)。所述納米纖維結構也可使用加壓插管直接遞送到腔室(例如腹膜腔)中。
根據本發明，還提供了用于誘導和/或改善/增強受試者的傷口愈合的方法。本發明還包括誘導和/或改善/增強受試者的組織再生(例如，血管生長、神經組織再生和骨再生)的方法。本發明的方法包括向受試者施用或應用本發明的納米纖維結構(例如在傷口處或傷口內)。在一個特定的實施方案中，該方法包括施用包含如上所述的藥劑的納米纖維結構。在一個特定的實施方案中，該方法包括向受試者施用納米纖維結構和如上文所述的藥劑(即，該藥劑不包含在納米纖維結構內)。當單獨施用時，納米纖維結構可以與藥劑同時和/或依序施用。該方法可包括施用一種或更多種納米纖維結構。當施用多于一種納米纖維結構時，納米纖維結構可以同時和/或依序施用。
定義
單數形式“一(a或an)”和“所述(the)”包括復數的所指對象，除非上下文中另外有明確說明。
如本文所使用的，術語“電紡絲”是指使用流體動力學和帶電表面之間的相互作用從溶液或熔體制造纖維(即電紡纖維)，特別是微米或納米尺寸的纖維(例如，通過響應于電場使溶液或熔體流動通過孔)。電紡納米纖維的形式包括但不限于支化納米纖維、管、帶和分裂納米纖維、納米纖維紗、表面涂覆的納米纖維(例如，用碳、金屬等涂覆)、在真空中產生的納米纖維等。電紡纖維的生產描述于例如gibson等人(1999)alchej.，45:190-195中。
“藥學上可接受的”表示由聯邦或州政府的管理機構批準或在美國藥典或其它公認的藥典中列出的用于動物，更特別是用于人。
“載體”是指與本發明的活性劑一起施用的例如稀釋劑、佐劑、防腐劑(例如，thimersol、芐醇)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、增溶劑(例如聚山梨酯80)、乳化劑、緩沖劑(例如，trishcl、乙酸鹽、磷酸鹽)、水、水溶液、油、膨脹物質(例如乳糖、甘露醇)、賦形劑、助劑或媒介物。合適的藥物載體描述在e.w.martin的“remington'spharmaceuticalsciences”(mackpublishingco.,easton,pa)；gennaro,a.r.,remington:thescienceandpracticeofpharmacy,(lippincott,williamsandwilkins)；liberman等人,編輯,pharmaceuticaldosageforms,marceldecker,newyork,n.y.；andkibbe等人,編輯,handbookofpharmaceuticalexcipients(第3版),americanpharmaceuticalassociation,washington。
如本文所用，術語“聚合物”表示由兩個或更多個重復單元或單體化學連接形成的分子。術語“嵌段共聚物”最簡單地是指至少兩種不同聚合物片段的共軛物，其中每個聚合物片段包含兩個或更多個相同類型的相鄰單元。
“疏水性”表示優選非極性環境(例如，相對于水，疏水性物質或結構部分更容易溶解在非極性溶劑例如烴中，或被其潤濕)。在一個特定的實施方案中，疏水性聚合物可具有在37℃下小于約1重量％的水溶解度。在一個特定的實施方案中，在雙蒸水中的1％溶液中具有低于約37℃，特別是低于約34℃的濁點的聚合物可以被認為是疏水性的。
如本文所用，術語“親水性”是指溶于水的能力。在一個特定的實施方案中，在雙蒸水中的1％溶液中具有高于約37℃，特別是高于約40℃的濁點的聚合物可以被認為是親水性的。
如本文所用，術語“兩親性”是指既溶于水又溶于脂質/非極性環境中的能力。通常，兩親性化合物包含親水性部分和疏水性部分。
如本文所用的術語“抗微生物劑”表示殺死或抑制微生物如細菌、真菌、病毒或原生動物生長的物質。
如本文所用，術語“抗病毒劑”是指破壞病毒和/或抑制病毒復制(繁殖)的物質。例如，抗病毒劑可以抑制和/或預防：病毒顆粒的產生、病毒顆粒的成熟、病毒附著、病毒攝入細胞、病毒組裝、病毒釋放/出芽、病毒整合等。
如本文所用，術語“抗生素”是指用于哺乳動物，特別是人類的的抗細菌劑。抗生素包括但不限于β-內酰胺類(例如青霉素、氨芐青霉素、苯唑西林、氯唑西林、甲氧西林和頭孢菌素)、碳頭孢烯、頭霉素、碳青霉烯、單酰胺菌素、氨基糖苷類(例如慶大霉素、妥布霉素)、糖肽類(例如萬古霉素)、喹諾酮類(例如環丙沙星)、默諾霉素、四環素類、大環內酯類(例如紅霉素)、氟喹諾酮類、噁唑烷酮類(例如利奈唑胺)、脂肽類(例如達托霉素)、氨基香豆素(例如新生霉素)、復方新諾明(例如甲氧芐氨嘧啶和磺胺甲惡唑)、林可酰胺類(例如，克林霉素和林可霉素)、多肽類(例如，粘菌素)，及其衍生物。
如本文所用，“抗炎劑”是指用于或抑制炎癥的化合物。抗炎劑包括但不限于非甾體抗炎藥(nsaid；例如阿司匹林、布洛芬、萘普生、水楊酸甲酯、二氟尼柳、吲哚美辛、舒林酸、雙氯芬酸、酮洛芬、酮咯酸、卡洛芬、非諾洛芬、甲芬那酸、吡羅昔康、美洛昔康、甲氨蝶呤、塞來昔布、伐地考昔、帕瑞考昔、依托考昔和尼美舒利)、皮質類固醇(例如潑尼松、倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、潑尼松龍、曲安西龍和氟替卡松)、雷帕霉素、對乙酰氨基酚、糖皮質激素、類固醇、β-激動劑、抗膽堿藥、甲基黃嘌呤、金注射劑(例如金硫蘋果酸鈉)、柳氮磺胺吡啶和氨苯砜。
如本文所用，術語“受試者”是指動物，特別是哺乳動物，特別是人。
如本文所用，術語“預防”是指對處于患病風險的受試者進行預防性，導致受試者患病的可能性降低。
本文所用的術語“”是指對患有疾病的患者有益的任何類型的，包括改善患者的病情(例如，有一種或多種癥狀)、延緩病情的進展等。
如本文所用，術語“鎮痛劑”是指減少、緩和、減輕、緩解或消除受試者的身體局部疼痛的藥劑(即，具有減輕或消除疼痛和/或疼痛知覺的能力的鎮痛劑)。
如本文所用，術語“小分子”是指具有相對低分子量(例如小于2,000)的物質或化合物。通常，小分子是有機的，但不是蛋白質、多肽或核酸。
術語“水凝膠”是指遇水可溶脹的不溶性聚合物基質(例如親水性聚合物)，其包含可吸收水以形成凝膠的任選交聯的大分子網絡。
術語“交聯”是指連接在兩個不同分子之間并連接兩個不同分子(例如聚合物鏈)的鍵或原子鏈。術語“交聯劑”是指能夠在化合物之間形成共價鍵的分子。“光交聯劑”是指在光誘導(例如暴露于可見和近可見范圍內的電磁輻射)之后能夠在化合物之間形成共價鍵的分子。交聯劑在本領域中是公知的(例如甲醛、多聚甲醛、乙醛、戊二醛等)。交聯劑可以是雙官能、三官能或多官能交聯劑。
以下實施例是為了舉例說明本發明的某些實施方案。其并非意在以任何方式限制本發明。
實施例
材料和方法
2d納米纖維膜的制造
利用標準電紡絲(jiang等人(2015)acsbiomater.sci.eng.,1:991-1001；jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003)生產pcl納米纖維墊。簡言之，將pcl(mw＝80kda)以10％(w/v)的濃度溶解在由具有4:1(v/v)比率的二氯甲烷(dcm)和n,n-二甲基甲酰胺(dmf)組成的溶劑混合物中。使用注射泵以0.8ml/h的流速泵送pcl溶液。用在pcl溶液中的50μg/ml香豆素6制備負載有香豆素6的pcl纖維。通過同軸電紡絲將ll37負載到pcl纖維中(xie,j.等人(2012)actabiomater.,8:811-819)。芯部溶液由100mg/ml普朗尼克f-127和5mg/mlll37的水溶液組成。流速設定為0.08ml/h。鞘部溶液是與上述相同的pcl溶液。在噴絲頭(22號針)和位于離噴絲頭20cm處的接地收集器之間施加15kv的電勢。在轉速為2000rpm的鼓上收集對齊的納米纖維墊。制成的pcl納米纖維墊和負載有香豆素6的pcl納米纖維墊為約1mm厚。負載有ll37的pcl納米纖維墊為約100μm厚。在液氮中通過0.5mm直徑的沖孔機對原始pcl纖維墊進行沖孔以產生陣列孔。
3d電紡納米纖維支架的制造
首先，在液氮中將pcl納米纖維墊、負載有香豆素6的pcl納米纖維墊、負載有ll37的pcl納米纖維墊和具有陣列孔的pcl納米纖維墊切割成1cm×1cm的正方形，以避免邊緣上變形。接著，將～1g干冰和一片納米纖維墊放入30mloakridge離心管中。在干冰變成co2流體之后，迅速松開蓋，并從管中移出膨化的納米纖維支架。重復該膨脹過程，直到達到所需厚度。在與細菌孵育之前，通過環氧乙烷對納米纖維支架進行滅菌。
3d納米纖維支架的表征
基于納米纖維支架的體積變化，使用以下等式估計孔隙率：ε＝(v-v0)/v×100％，其中ε是孔隙率，v＝l(長度)×w(寬度)×t(厚度)是pcl納米纖維支架的體積，v0＝m0/ρ0是散裝pcl材料的計算體積，m0是散裝pcl材料的質量，ρ0是散裝pcl材料的密度(jiang等人(2015)acsbiomater.sci.eng，1:991-1001)。將膨脹前后的pcl納米纖維墊嵌入去離子水中并在-20℃冷凍。通過低溫恒溫器獲得納米纖維支架的橫截面并接著冷凍干燥。使用掃描電子顯微鏡(sem)(fei，quanta200，oregon)來表征納米纖維支架的橫截面形態。為了避免帶電，將納米纖維樣品固定在具有雙面導電帶的金屬柱上并在10ma的電流強度下在真空下使用濺射涂覆機用鉑涂覆4分鐘。在30kv的加速電壓下獲取sem圖像。使用imagej軟件基于sem圖像測量在膨脹一次和兩次之后納米纖維支架的間隙距離和層厚度。分析了至少250個間隙或層。
負載有香豆素6的3d納米纖維支架
為了比較，將負載有香豆素6的pcl納米纖維墊在1mnabh4中膨脹1小時。如所述那樣實施所述程序(jiang等人(2015)acsbiomater.sci.eng.,1:991-1001；jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003)。通過熒光顯微鏡，在488nm激發波長和530±20nm發射波長下觀察co2膨脹的負載有香豆素6的納米纖維支架、nabh4膨脹的負載有香豆素6的納米纖維支架、原始的負載有香豆素6的納米纖維墊和原始pcl纖維墊的上表面，并通過ccd照相機以相同的曝光時間拍攝圖像。實驗進行至少三次。使用imagej軟件定量所述熒光強度。
負載有ll-37的3d納米纖維支架
通過在37℃下將5mg纖維樣品浸入5mlpbs中來評價ll37在膨脹前后從納米纖維膜的體外釋放動力學。在每個時間點收集上清液，并用新鮮的pbs溶液替換。通過ll37elisa試劑盒根據制造商的說明書測定所有收集的樣品的ll37濃度。
使用銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)評價在膨脹前后負載有ll37的纖維膜的抗菌活性。簡要地說，銅綠假單胞菌在液體luria-bertani(lb)培養基中在37℃下以220rpm在振蕩孵育器中培養過夜。然后，將20μl懸浮細菌轉移到4ml新鮮lb培養基中，并在37℃以220rpm再孵育2小時。將細菌懸浮液以12000rpm離心10分鐘。除去上清液后，將細胞丸粒重新懸浮于1mlpbs中。該程序重復一次。用nanodrop(thermoscientific，wilmington，de)測定細菌懸浮液的od660值。od660值約等于1.0×108cfu細菌。用pbs將細胞稀釋到1.0×105、1.0×106和1.0×107cfu細菌中，并將5mgpcl纖維、未膨脹的負載有ll37的pcl纖維和膨脹的負載有ll37的pcl纖維加入到5ml含有細菌的培養基中，然后將培養物置于搖床上，在37℃和220rpm培養1小時。然后，將培養物鋪展在lb瓊脂平板上。在37℃下孵育12小時后，計數菌落的數目。用三個lb瓊脂平板重復計數并取平均值。
具有陣列孔的3d納米纖維支架的制造和皮下植入
電紡納米纖維膜首先在低于玻璃化轉變溫度的溫度下冷凍(例如浸入液氮中)以使它們變脆，并且通過頭產生穿過納米纖維膜的正方形陣列的孔。在環氧乙烷氣體滅菌后，用0.5％明膠涂覆具有陣列孔(10mm×10mm×10mm)的膨脹pcl納米纖維支架并交聯以防止塌陷，然后切成1mm厚并浸泡在鹽水中，接著皮下植入9周齡的spraguedawley(sd)大鼠(250-300g)中。簡言之，使用4％異氟烷在氧氣中麻醉大鼠約2分鐘。將大鼠置于加熱墊上以維持其體溫。將每只動物背部上8×4cm2的面積剃毛，并將聚維酮碘溶液在暴露的皮膚上施用三次。每只大鼠接受4個植入物；通過在背部4個脊柱上部位的1.5cm切口制造皮下袋。將每個植入物輕輕地插入皮膚下的皮下袋中以避免壓縮，然后用縫合器閉合皮膚切口。在植入后1、2和4周，用co2對大鼠實施安樂死。將每個具有周圍組織的外植體輕輕地從其皮下袋中切開，然后在組織學分析前浸入福爾馬林中至少3天。
組織學和免疫組織化學分析
將固定的樣品在梯度乙醇系列(70％-100％)中脫水，包埋在石蠟中，然后切片(4μm)。樣品用蘇木精和曙紅(h&e)或馬森三染法進行。進行免疫組織化學染以表征響應于具有陣列孔的膨脹的納米纖維支架的巨噬細胞表型。將載玻片脫蠟，隨后在加熱的檸檬酸鹽緩沖液中抗原修復10分鐘(10mm檸檬酸鹽，95-100℃下ph6.0)。通過在3％h2o2中孵育切片5分鐘封閉過氧化物酶。用封閉溶液(2％正常山羊血清，0.1％tritonx-100的pbs溶液；室溫下1小時)防止非特異性抗體結合。將切片輕輕倒出，并與在封閉溶液中1:200稀釋的第一抗體一起在4℃下孵育過夜。使用針對泛巨噬細胞標記物cd68、m1巨噬細胞標記物ccr7和m2巨噬細胞標記物cd206的第一抗體。
組織形態和巨噬細胞表型定量
h&e染、masson三染和cd68、ccr7和cd206的免疫組織化學染的顯微圖像都是用ventana公司的coreoautm幻燈片掃描儀獲得的，并用ventana圖像觀察器v3.1.3編輯。將放大率設定為4×、10×和40×，然后在各樣品上的三個隨機位置處拍攝快照。使用ventaina圖像觀察器測量血管的數量。將血管的數量轉換成每mm2的計數。通過masson三染圖像定量每個樣本中的所有異物巨細胞。從三個獨立實驗獲得體內實驗數據。圖像用ventana的coreoautm載玻片掃描儀捕獲。對每個植入物評價三個切片。在每個組織切片上隨機收集40×放大率的cd68、ccr7和cd163陽性免疫組織化學染圖像的總共6個快照。定量每個快照中陽性細胞的數量。
統計分析
每個數據點代表三次重復的平均值。對從至少三個獨立實驗獲得的數據的平均值進行統計分析。所有結果作為平均值給出，并使用方差分析(anova)進行比較，然后進行lsd事后評估，以評價統計學個體內和個體間差異，顯著性設置為p＜0.05。
結果
3d電紡納米纖維支架的制造和表征
對于制造方法，產生電紡pcl納米纖維墊，并將該墊切成所需尺寸(例如1cm×1cm)(jiang等人(2015)acsbiomater.sci.eng.,1:991-1001；jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003)。然后，在室溫下將納米纖維膜置于干冰存在下的離心管中，并將蓋子擰緊。在干冰變成液體之后，將co2流體快速減壓，導致3d納米纖維支架的形成(圖1a)。基于計算(redlich-kwong方程)，co2液體處于亞臨界狀態。可以通過增加co2流體處理次數來定制3d納米纖維支架的厚度(圖1b)。在用亞臨界co2流體進行第一次處理和第二次處理之后，納米纖維墊的厚度從1mm增加到2.5mm，并進一步增加到10mm。
對齊的pcl納米纖維支架的孔隙率隨著加工次數的增加而增加，這與厚度的增加相對應(圖1c)。在用亞臨界co2流體進行第一次處理和第二次處理之后，納米纖維支架的孔隙率從原始納米纖維墊的78.5％增加到92.1％和99.0％(圖1d)。為了在膨脹后保持納米纖維支架的完整性，將支架包埋在冰水中的冰中，并通過切片機切片以暴露x-y、y-z平面，然后使用凍干機冷凍干燥。為了揭示詳細的結構，通過掃描電子顯微鏡(sem)檢測切片的樣品。在膨脹之前，對齊的電紡pcl納米纖維墊由致密填充的原纖維結構構成(圖1e和1f)(jiang等人(2015)acsbiomater.sci.eng.,1:991-1001)。相比之下，通過亞臨界co2流體膨脹的納米纖維支架顯示具有由對齊的納米纖維提供的保留的納米形貌線索的層狀結構(圖1g和1h)，其對于腱、肌肉和神經組織的再生是關鍵的，并且類似于在nabh4溶液中膨脹的納米纖維支架(jiang等人(2015)acsbiomater.sci.eng.,1:991-1001；jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003)。證實了通過亞臨界co2流體膨脹的3d納米纖維支架具有與在水溶液中使用生成氣體的化學反應產生的那些類似的結構(jiang等人(2015)acsbiomater.sci.eng.,1:991-1001；jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003)。此外，似乎層厚度隨著處理時間的增加而降低，而在膨脹一次和兩次后，對于支架的間隙距離分布沒有觀察到顯著差異。此外，證明了由水溶性聚合物(例如聚乙烯基吡咯烷酮(pvp))制成的納米纖維膜的膨脹(圖2)，這使用以前的方法(jiang等人(2015)acsbiomater.sci.eng.,1:991-1001；jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003；joshi,etal.(2015)chem.eng.j.,275:79-88；sheikh等人(2015)nanomedicine:nbm,11:681-691；lee等人(2011)tissueeng.parta,17:2695-2702)不能實現。
亞臨界co2處理對包封分子的影響
3d支架不僅提供了用于細胞附著和生長的基底，而且提供了用于在植入后遞送劑以調節細胞應答或宿主免疫應答的局部裝置。為了證明當前制造方法的優點，將疏水性和親水性分子包封在納米纖維支架中。選擇疏水性熒光染料小分子香豆素6作為模型藥物，其中已檢驗了許多小分子用于組織再生(ding等人(2005)curr.top.med.chem.,5:383-395；lu等人(2014)drugdiscoverytoday19:801-808).將香豆素6包封到pcl納米纖維墊中(xie等人(2006)pharm.res.,23:1817-1826)。使用1m的nabh4溶液或亞臨界co2流體將納米纖維墊從2d膨脹成3d。由于nabh4的高還原性，香豆素6的綠在1m的nabh4溶液處理后褪(圖3)。對比之下，通過亞臨界co2流體膨脹的支架仍然是綠的(圖3)。每個樣品的俯視圖也通過熒光顯微鏡成像(圖3)。原始pcl纖維樣品在488nm沒有顯示出熒光(圖3，右下)。然而，負載有香豆素6的pcl纖維墊顯示最強的熒光(圖3，右上)。nabh4溶液膨脹的樣品的熒光強度遠低于亞臨界co2流體膨脹的樣品。使用imagej軟件對熒光強度進行的定量分析顯示pcl納米纖維顯示出非常低的熒光強度(圖3)。亞臨界co2流體膨脹的樣品的熒光強度顯著高于nabh4溶液膨脹的樣品的熒光強度。負載有香豆素6的pcl納米纖維墊與亞臨界co2流體膨脹的納米纖維墊之間的熒光強度的略微差異可能是由于結構差異(例如不同的纖維密度)。
至于另一種模型藥物，選擇稱為ll-37的抗微生物肽。它是一種親水性分子，已用于感染、促進傷口愈合、增強血管生成和調節免疫應答(fumakia等人(2016)mol.pharm.,13:2318-2331；chereddy等人(2014)j.controlledrel.,194:138-147；durr等人(2006)biochim.biophys.acta,1758:1408-1425)。使用同軸電紡絲將ll37和pluronicf127(表面活性劑)包封在ll37/普朗尼克f127-pcl芯-鞘纖維的芯中(xie等人(2012)actabiomater.，8:811-819)。使用亞臨界co2流體膨脹所得的負載有ll37的納米纖維墊。初始載藥量為5μgll37/1mgpcl納米纖維。使用ll37elisa試劑盒測定ll37在亞臨界co2流體中膨脹前后從兩種納米纖維墊的體外釋放動力學(圖4a)。在第1周內，分別從原始的和膨脹的纖維樣品中釋放約75％和80％的ll37。膨脹的纖維支架的釋放速率略高于未膨脹的樣品，這可能是由于較高的孔隙率。
為了測試包封的ll-37在膨脹后的生物活性的保留，測量膨脹前后負載有ll-37的納米纖維墊的抗菌性能(圖4b)。使用原始pcl纖維墊作為對照，將1mg未膨脹的負載有ll37的pcl纖維墊和膨脹的3d的負載有ll37的pcl纖維支架與1.0×105、1.0×106和1.0×107cfu銅綠假單胞菌在1mlpbs中共同孵育1小時。如所預期的，原始pcl纖維墊沒有顯示出殺菌效果。膨脹和未膨脹的負載有ll37的pcl纖維膜都顯示出相似水平的殺菌效果(圖4b)，這表明亞臨界co2處理對包封的抗微生物肽的生物活性沒有影響。因此，證實了通過亞臨界co2流體膨脹的3d納米纖維支架與以前的方法(jiang等人(2015)acsbiomater.sci.eng.,1:991-1001；jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003)相比更好地保持了包封的生物活性材料的活性。
具有陣列孔的膨脹3d納米纖維支架的制造
電紡納米纖維膜從2d到3d的轉變增加了納米纖維支架的厚度和孔隙率；然而，細胞浸潤只能從側面發生，而不能從膨脹支架的頂面和底面發生(jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003)。盡管跨層血管化對于組織再生不是必需的(mahjour等人(2016)j.biomed.mater.res.a,104:1479-1488)，穿過不同層的細胞浸潤可以有利于新組織形成及其整合到周圍組織中。為了克服這種限制，將pcl納米纖維膜浸入液氮中使它們變脆，并在低溫條件下使用頭產生通過膜的陣列孔。這種方法顯示，與激光燒結或室溫沖孔(walthers等人(2014)biomaterials35:5129-5137；bonvallet等人(2014)tissueeng.parta,20:2434-2445)不同，在沖孔表面的納米纖維形態沒有損傷或變形(圖4c)。使用亞臨界co2流體將沖孔的納米纖維膜膨脹成3d支架(圖4d)。保持了層狀結構，并且孔的表面表明纖維形態保持完整(圖4d)。該方法進一步增加了膨脹的3d納米纖維支架的孔隙率。
具有陣列孔的膨脹3d納米纖維支架的體內應答
為了進一步測試膨脹和沖孔對體內應答的影響，將具有陣列孔的3d膨脹的納米纖維支架分別皮下植入大鼠中1周、2周和4周。似乎細胞生長到沖孔中，然后滲透到膨脹的納米纖維支架內的薄納米纖維層之間的空間中(圖5)。masson三染顯示，綠箭頭指示膠原從浸潤的細胞沉積在沖孔中和薄納米纖維層之間的間隙中(圖5b)。在薄納米纖維層之間的孔或間隙中新形成的組織內也形成許多血管(圖5c)。還存在多核巨細胞(圖5d)。在第1、2和4周，每mm2的血管數分別為39、66和17左右(圖5e)。在第2周形成的更多血管可歸因于早期炎癥反應。相反，在傳統納米纖維墊內未觀察到新形成的血管(jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003)。對于具有陣列孔的膨脹的3d納米纖維支架，每個植入物的多核巨細胞數目在第1、2和4周時分別為16、60和129(圖5f)。為了比較，對于傳統納米纖維墊，每個植入物的多核巨細胞的數目接近16，但在第2周和第4周減少到9和6(jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003)。
對具有陣列孔的3d納米纖維支架和周圍組織進行免疫組織染，以便用不同的表面標記鑒定浸潤的巨噬細胞(圖6)。結果表明，ccr7陽性細胞(m1期巨噬細胞，其促進炎癥)的數量減少，而cd206(m2期巨噬細胞，其減少炎癥并促進組織修復)和cd68(泛巨噬細胞)陽性細胞的數量隨植入時間的增加而增加。具有不同表面標記的巨噬細胞的定量的數據示于圖7，表明在植入后第4周m2/m1比率顯著增加。對比之下，對于傳統納米纖維墊，m2/m1比率從第1周至第4周保持恒定(jiang等人(2016)adv.healthcaremater.,5:2993-3003)。為了揭示多核巨細胞的表達標記和時空分布，用不同的表面標記分析高度放大的免疫染圖像(圖8)，表明多核巨細胞不均勻地表達ccr7、cd206和/或cd68標記，這對于新血管形成和組織再生可能是重要的(barbeck等人(2016)j.biomed.mater.res.parta,104:413-418)。因此，證實了具有陣列孔的亞臨界co2流體膨脹的3d納米纖維支架促進細胞浸潤、新血管形成和陽性宿主應答。
由于仿生特性，電紡納米纖維已經被廣泛地用作再生醫學的支架(xie等人(2008)macromol.rapidcommun.,29:1775-1792)。然而，傳統的電紡絲通常產生具有較小孔徑和緊密結構的納米纖維膜/墊，由于其固有性質而限制了細胞浸潤(jiang等人(2015)acsbiomater.sci.eng.,1:991-1001)。已經開發了3d電紡納米纖維支架，其利用犧牲模板(例如親水性纖維、冰和鹽)、電場操作(例如定制的收集劑和離子鹽的添加劑)、套索/編織、熔噴書寫/印刷和改進的氣體發泡(xie等人(2012)adv.healthcaremater.,1:674-678；hochleitner等人(2015)biofabrication7:035002)。這些方法與各種問題有關(例如耗時、厚度有限，并且必須使用水溶液)。在該研究中，證實了通過亞臨界co2流體的減壓產生3d納米纖維支架的簡單且新穎的方法。基于co2相圖(mazzoldi等人(2008)int.j.greenh.gascon.,2:210-218)，當壓力快速降低時，co2液相變為氣相。滲透纖維基質的co2液體變成co2氣泡，使纖維基質大大膨脹。在排出co2氣體之后，可以容易地形成所述膨脹的納米纖維支架而無需冷凍干燥。對于該膨脹過程，還免除了等離子體處理程序，因為co2流體容易滲透pcl納米纖維膜，這可能是由于其非極性性質。重要的是，該方法允許納米纖維膜在數分鐘內膨脹。與先前的方法相比，本文所述的方法節省時間，免除了水溶液和冷凍干燥過程的使用，是環境友好的，使用低溫處理，并且保持了對齊的納米形貌。重要的是，由水溶性聚合物(例如pvp)制成的納米纖維膜可使用亞臨界co2流體膨脹成3d支架(圖2)，這在之前的研究中是不可能的。此外，該co2膨脹過程可保持包封分子的生物活性，這是很關鍵的，因為3d納米纖維支架經常與生長因子或其它生物活性分子組合用于再生醫學。
使用改進的氣體發泡技術，在水溶液中膨脹電紡納米纖維膜。所得3d支架可促進細胞浸潤通過納米纖維層之間的間隙。在本工作中，由亞臨界co2流體產生的3d納米纖維支架顯示出與在nabh4水溶液中膨脹的支架相似的結構。在冷凍條件下在整個支架上產生陣列孔以增強細胞浸潤。實際上，細胞不僅從側面而且從孔滲透支架(圖5a)。基于免疫染結果，確定了植入1、2和4周后支架內的m1巨噬細胞、m2巨噬細胞和多核巨細胞的細胞浸潤和時空分布，其示意性地示于圖9中。對于傳統的納米纖維墊，細胞通常留在邊緣滲透的納米纖維墊的表面上并形成膠原被膜(圖9a)。對于co2膨脹的具有陣列孔的3d納米纖維支架，細胞在1周內浸潤到沖孔中，并通過納米纖維層之間的間隙繼續滲透到支架中。巨噬細胞的浸潤顯示類似的趨勢。在第1周和第2周有更多的m1巨噬細胞，但在第4周有更多的m2巨噬細胞。在第1周，多核巨細胞大部分位于沖孔的表面上。在第2周，在沖孔的表面上或在浸潤的纖維層內形成一些巨細胞。在第4周，多核巨細胞相對均勻地分布在整個浸潤的區域。此外，多核巨細胞顯示出異質表型，具有包括ccr7、cd208和cd68的不同標記物陽性染(圖6)，表明其對于組織再生的重要性。本文所述的co2膨脹的納米纖維支架可用于特定組織的再生，特別是具有各向異性性質的那些組織，例如神經、肌肉和肌腱。
總之，使用亞臨界co2流體已經證明了電紡納米纖維膜從2d到3d的轉變。該方法提供了優于先前方法的若干優點，例如縮短了加工時間，免除了水溶液和冷凍干燥程序的使用，并且避免了包封的生物制品的損失。最重要的是，這種方法在更大程度上保持了包封分子的生物活性。此外，在冷凍條件下，可通過孔產生穿過納米纖維膜的孔，以進一步促進細胞滲透和新血管形成。這些轉化的3d納米纖維支架可用于組織修復/再生、工程化3d組織模型、傷口敷料、止血和局部藥物遞送。
雖然上面已經描述和具體例示了本發明的某些優選實施方案，但是并不意味著本發明限于這樣的實施方案。在不脫離如所附權利要求中闡述的本發明的范圍和精神的情況下，可以對其進行各種修改。
技術特征：
1.一種用于制備具有增加的孔隙率和厚度的納米纖維結構或微纖維結構的方法，所述方法包括將納米纖維結構或微纖維結構暴露于亞臨界流體并減壓，其中所述減壓增加納米纖維結構或微纖維結構的孔隙率和厚度。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述亞臨界流體包含co2、n2、n2o、烴或碳氟化合物。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述亞臨界流體是亞臨界co2。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述暴露包括將所述納米纖維結構或微纖維結構浸入所述亞臨界流體中。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述納米纖維結構或微纖維結構包括電紡纖維。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述納米纖維結構或微纖維結構包括多個單軸對齊的納米纖維或微纖維、無規納米纖維或微纖維和/或纏結的納米纖維或微纖維。
7.根據權利要求1所述的方法，其還包括在所述暴露于亞臨界流體之前制備包括多個納米纖維或微纖維的所述納米纖維結構或微纖維結構。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述納米纖維或微纖維包括親水性聚合物。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述納米纖維或微纖維包括疏水性聚合物。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述疏水性聚合物是聚己內酯。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述納米纖維結構或微纖維結構包括活性劑。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述活性劑選自由劑、生長因子、信號分子、細胞因子、止血劑、抗微生物劑和抗生素組成的組。
13.根據權利要求11所述的方法，其中在所述暴露于亞臨界流體之后將所述活性劑加入到納米纖維結構或微纖維結構中。
14.根據權利要求11所述的方法，其中在所述暴露于亞臨界流體之前將所述活性劑加入到納米纖維結構或微纖維結構中。
15.根據權利要求1所述的方法，其中i)將納米纖維結構或微纖維結構暴露于亞臨界流體和ii)減壓的步驟進行多于一次。
16.根據權利要求15所述的方法，其中i)將納米纖維結構或微纖維結構暴露于亞臨界流體和ii)減壓的步驟重復1至5次。
17.根據權利要求1所述的方法，其中所述納米纖維結構或微纖維結構包括孔或洞。
18.根據權利要求1所述的方法，其還包括將所述納米纖維結構或微纖維結構交聯。
19.通過根據權利要求1-18中任一項所述的方法生產的納米纖維結構或微纖維結構。
技術總結
本申請提供了膨脹的納米纖維結構及其使用方法和制造方法。
