一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選PGG抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法
一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明公開一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的關(guān)鍵通路與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選方法，涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種生物信息學(xué)手段結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)方法和體內(nèi)外藥效學(xué)探討驗(yàn)證pgg在胃癌中的應(yīng)用潛力。
背景技術(shù)：
2.胃癌是一種異質(zhì)性很強(qiáng)的疾病，是一個(gè)多因素參與、多步驟演變的復(fù)雜病理過程。國家和地區(qū)不同，胃癌的發(fā)生情況也不同，目前導(dǎo)致胃癌發(fā)生的主要因素包括環(huán)境、遺傳、幽門螺旋桿菌、飲食、社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位等。臨床研究表明，聯(lián)合對(duì)非轉(zhuǎn)移性胃癌和胃食管腺癌患者有效，圍手術(shù)期化療或術(shù)后化療加放化療被列為胃癌指南中的首選方法。以上方法雖然可以抑制胃癌的發(fā)展但是會(huì)產(chǎn)生很大的毒副作用在一定程度上影響患者的健康，因此臨床上一直尋新的方案。
3.1,2,3,4,6-o-五沒食子酰葡萄糖(pgg)，是一種來自于多種藥用植物如五倍子、牡丹、芍藥中的可水解多酚鞣酸單體化合物。文獻(xiàn)報(bào)道pgg具有抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗癌等多種生理活性。pgg可抑制肺癌、前列腺癌、黑素瘤、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，被認(rèn)為是潛在的抗腫瘤活性物質(zhì)。dong研究發(fā)現(xiàn)在hepg2、mcf-7和a549細(xì)胞中，pgg可以通過激活自噬上游信號(hào)mapk8/9/10引發(fā)細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)胞衰老發(fā)揮其抗癌活性然而其體內(nèi)抗胃癌作用及分子機(jī)制仍不明確。
4.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種借助于數(shù)據(jù)庫在分子水平上來預(yù)測(cè)藥物作用機(jī)制的一種方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以通過目標(biāo)分子所延伸出的分子網(wǎng)絡(luò)、網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)等信息揭示生物系統(tǒng)與藥物之間復(fù)雜的關(guān)系為生物活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、機(jī)理研究以及新藥的研發(fā)等領(lǐng)域提供了新的思路。前期許多藥物均通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示了其內(nèi)在關(guān)聯(lián)。因此，現(xiàn)有技術(shù)中需要一種采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究1,2,3,4,6-o-五沒食子酰葡萄糖胃癌的分子機(jī)制。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
5.本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種篩選pgg抗胃癌作用關(guān)鍵通路與關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證pgg抗胃癌作用機(jī)制，將體外藥效學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)以及相關(guān)通路進(jìn)行對(duì)應(yīng)，確定其潛在的分子機(jī)制，為后續(xù)的開發(fā)應(yīng)用提供參考。
6.本發(fā)明提供一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，包括以下步驟，且以下步驟順次進(jìn)行，
7.s1、胃癌及pgg靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)：
8.在genecard、omim和disgenet三個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫以“gastric cancer”為關(guān)鍵詞篩選得到胃癌相關(guān)靶點(diǎn)。以“pentagalloylglucose”為關(guān)鍵詞在swisstargetprediction和pharmmapper數(shù)據(jù)庫中篩選得到pgg相關(guān)靶點(diǎn)；兩者交集得到pgg抗胃癌的潛在靶點(diǎn)。
9.s2、pgg抗胃癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及hub基因的篩選：
10.將交集靶點(diǎn)輸入到string數(shù)據(jù)庫選擇物種為“homo sapiens”，最低關(guān)系分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.4，除去游離的蛋白得到蛋白互作圖，將其導(dǎo)入cytoscape3.7.1中利用cytohubba插件中的mcc計(jì)算方法篩選出排名前20的靶基因；
11.s3、hub基因的驗(yàn)證：
12.關(guān)鍵靶基因使用pdb數(shù)據(jù)庫獲取對(duì)應(yīng)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)保存為pdb格式，chem3d軟件將pgg二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成三維結(jié)構(gòu)保存為mol2格式，使用autodock vina將hub蛋白與pgg進(jìn)行分子對(duì)接；kaplan-meier生存曲線分析hub基因?qū)ξ赴┗颊叩念A(yù)后價(jià)值，黑折線代表基因在胃癌中低表達(dá)，紅折線代表基因在胃癌中高表達(dá)；
13.s4、go、kegg分析：
14.將hub基因輸入到david數(shù)據(jù)庫中得到go和kegg結(jié)果，得到的結(jié)果使用rstudio進(jìn)行繪圖。
15.s5、胃癌體外模型的構(gòu)建：
16.取小鼠胃癌(mfc)細(xì)胞，37℃、5％ co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為補(bǔ)加10％滅活胎牛血清、100u/ml青霉素以及10mg/l鏈霉素；細(xì)胞貼壁后吸出培養(yǎng)基，用pbs清洗兩次，繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80％-90％用胰蛋白酶進(jìn)行消化，傳代，每1～2天傳代一次；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞備用；
17.s6、pgg抑制胃癌細(xì)胞的增殖、周期、線粒體膜電位、活性氧含量及凋亡：
18.將標(biāo)品pgg配制成不同濃度分別對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行處理，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)、線粒體膜電位檢測(cè)以及細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度檢測(cè)；
19.s7、胃癌體內(nèi)模型的構(gòu)建：
20.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：在湖北省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲取雌雄各半共40只6周齡的spf級(jí)balb/c小鼠(18
±
2g)在23℃室溫條件下飼養(yǎng)于武漢輕工大學(xué)動(dòng)物中心，光照循環(huán)，自由獲取水與食物，實(shí)驗(yàn)前正常飼養(yǎng)一周適應(yīng)環(huán)境；將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1
×
107cells/ml，取0.2ml的細(xì)胞懸液注射于小鼠腋下建立小鼠模型；
21.s8、pgg誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)胃癌的凋亡及抑制相關(guān)信號(hào)通路：
22.4天后隨機(jī)將小鼠分成5組每組8只，實(shí)驗(yàn)組分別使用15mg/kg和30mg/kg的pgg、20mg/kg的5-fu和pbs按照兩天一次的頻率進(jìn)行腹腔注射，隔天記錄小鼠體重與腫瘤大小，飼養(yǎng)至第14天使用乙醚對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，取血處死；收集小鼠肝、脾、腎與腫瘤分別置于4％的甲醛固定液與-80℃的冰箱中；所有實(shí)驗(yàn)流程均按照美國國立衛(wèi)生研究院的《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南》，并經(jīng)武漢輕工大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；對(duì)臟器進(jìn)行he切片染，初步觀察pgg體內(nèi)毒性；對(duì)小鼠腫瘤組織進(jìn)行tunel染觀察pgg體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤凋亡情況；在通路驗(yàn)證方面分為兩個(gè)層次—基因?qū)用孢M(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，蛋白層面則采用蛋白質(zhì)印跡法
23.步驟s4基因通路的驗(yàn)證主要是經(jīng)過go和kegg富集分析所得到的pi3k-akt、mapk信號(hào)通路。
24.步驟s6人源胃癌(hepg2)細(xì)胞進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)為，將標(biāo)品pgg分別溶于少量的二甲亞楓之中，用培養(yǎng)基稀釋成0μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm、200μm，對(duì)照組加入相同濃度、體積的五氟尿嘧啶；將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的鼠源胃癌(mfc)細(xì)胞接種于96孔板，每組五個(gè)復(fù)孔；培養(yǎng)24小時(shí)后將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸出，pbs清洗兩次，加等量不同濃度(0μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm、200μm)的pgg以及五氟尿嘧啶(陽性對(duì)照組)孵育24以及48小時(shí)，到時(shí)間后甩出孔板的含藥
培養(yǎng)基，pbs清洗后每孔加入10μl的cck-8溶液放置培養(yǎng)箱中孵育三個(gè)小時(shí)，將孔板置于酶標(biāo)儀讀取450nm處的吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。
25.步驟s6鼠源胃癌(mfc)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)為，使用dna含量檢測(cè)試劑盒(購自北京索萊寶科技有限公司)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hepg2細(xì)胞按照每孔1
×
106個(gè)接種于六孔板，每孔1ml的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育24h以后加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基分別處理24h和48h。到時(shí)間后用預(yù)冷的pbs洗滌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度在1
×
106個(gè)/ml，1500rmp，5min離心收集細(xì)胞(上清液合并一同離心)。離心過后除去上清液，細(xì)胞中加入預(yù)冷的70％的乙醇500μl固定兩小時(shí)至過夜。染前除去固定液加入100μl的rnasea溶液重懸，37℃水浴30min，加入400μl的pi染液4℃避光孵育30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
26.步驟s6鼠源胃癌(mfc)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)為，梯度濃度的pgg孵育小鼠胃癌mfc細(xì)胞48h，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。2-8℃，1000rpm/min離心5min收集懸浮細(xì)胞。預(yù)冷pbs洗滌細(xì)胞兩次，加入400μl 1
×
annexin v結(jié)合液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度至1
×
106cells/ml。在細(xì)胞懸浮液中加入5μl annexin v-fitc染液，輕輕混勻后于2-8℃避光條件下孵育15分鐘。加入5-10μl pi染液后輕輕混勻于2-8℃避光條件下孵育2-5分鐘立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
27.步驟s6鼠源胃癌(mfc)細(xì)胞進(jìn)行線粒體膜電位實(shí)驗(yàn)為，取六孔板每孔接種1
×
106個(gè)細(xì)胞，12h后用含有梯度濃度的pgg處理細(xì)胞48h；吸出含藥培養(yǎng)基，pbs清洗兩遍后加入胰酶消化液收集細(xì)胞于1.5ml離心中；調(diào)整細(xì)胞濃度為1
×
106cells/ml，取0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；加入0.5ml的jc-1染工作液，顛倒混勻，37℃孵育20min；加入1ml jc-1染工作液，充分混勻；細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20min，孵育結(jié)束后吸除上清，用jc-1染緩沖液(1
×
)洗滌2次；加入0.5ml jc-1染緩沖液重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
28.步驟s6鼠源胃癌(mfc)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活性氧含量變化實(shí)驗(yàn)為，取六孔板每孔接種1
×
106個(gè)細(xì)胞，12h后用含有梯度濃度的pgg處理細(xì)胞48h。胰酶消化收集細(xì)胞，用1ml pbs洗滌兩次，1000rpm/min收集細(xì)胞沉淀。加入用無血清培養(yǎng)液稀釋的dcfh-da(終濃度為10μm)熒光探針重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1
×
106cells/ml。取一份不加探針，只加入培養(yǎng)基的細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照管。取一份已加入探針的細(xì)胞，同時(shí)加入活性氧供氫體誘導(dǎo)細(xì)胞設(shè)為陽性對(duì)照管。37℃孵育細(xì)胞1h，1000rpm/min收集細(xì)胞，pbs洗滌后重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
29.步驟s8鼠源胃癌(mfc)細(xì)胞進(jìn)行he染為，將組織從固定液中取出修繕平整后進(jìn)行脫水與石蠟包埋，并于石蠟切片機(jī)上切成4μm厚的切片，切片脫蠟至水，蘇木素-伊紅對(duì)切片染，染結(jié)束脫水使用中性樹膠進(jìn)行封片；取新石蠟切片脫蠟至水，使用蛋白酶k工作液進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，加試劑tdt，dutp，37℃水浴孵育2h，切片放入3％雙氧水溶液，室溫避光孵育15min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，切片加適量試劑converter-pod覆蓋組織，清洗后加入dab顯并使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，脫水封片。
30.步驟s8鼠源胃癌(mfc)細(xì)胞進(jìn)行tunel染為，hepg2細(xì)胞與pgg共同孵育48h,加入1ml的pbs洗2次，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管內(nèi)。加入100μl細(xì)胞裂解液(10mm tris-cl ph 8.0，1mm edta，20％sds，5mmdtt，10mm pmsf)于冰上裂解30min，超聲10次每次2s。12000rpm、4℃離心5min，收集上清，用bca蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量。蛋白樣品加入1/4樣品體積的蛋白上樣緩沖液，95℃變性5min，待冷卻至室溫后12000rpm、4℃離心5min。蛋白樣品在10％ sds-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，待蛋白maker跑開后切膠，在100v、90min、冰浴條件下轉(zhuǎn)
膜。pvdf膜用tbst(5％脫脂牛奶)的室溫封閉1h，加入一抗4℃孵育夜。用tbst洗三次，每次5min。加入二抗，室溫孵育約1h。tbst洗滌三次，每次持續(xù)5min。加入ecl發(fā)光底物用凝膠成像儀掃描分析。
31.步驟s8鼠源胃癌(mfc)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)為，取腫瘤組織30mg置于含有trizol的勻漿管中冷凍勻漿，勻漿結(jié)束后轉(zhuǎn)移勻漿管上清至2ml ep管中；管中加入200μl氯仿，劇烈震蕩，4℃，12000rpm/min，離心15min，將最上層清液約300μl轉(zhuǎn)移至新ep管，加入600μl的異丙醇上下顛倒后，離心得到rna沉淀，使用75％的乙醇清洗沉淀，清洗結(jié)束離心晾干沉淀，加入50μl的depc水溶解沉淀；紫外分光光度計(jì)測(cè)定rna的濃度。使用試劑盒除將rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna加入設(shè)計(jì)好的引物，以β-actin作為內(nèi)參基因按照兩步法程序(95℃(30s)，5℃(5s)，60℃(30s)，40個(gè)循環(huán))進(jìn)行定量分析。
32.步驟s8鼠源胃癌(mfc)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)western blot實(shí)驗(yàn)為，腫瘤組織從-80℃取出解凍，剪碎后放入盛有組織蛋白提取試劑的勻漿管中低溫勻漿，勻漿完成后冰浴30min使其裂解徹底，4℃，12000rpm/min離心15min收集上清總蛋白，使用bca蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清總蛋白的濃度，根據(jù)蛋白的濃度確定樣品蛋白上樣量為40μg，并在蛋白樣品中加入5
×
蛋白上樣緩沖液，95-100℃沸水浴5min；配置分離膠與濃縮膠，取出上樣梳將樣品按照設(shè)計(jì)加入至上樣孔。預(yù)先使用甲醇活化pvdf膜，按照按照正負(fù)極方位擺放轉(zhuǎn)膜所需的三層結(jié)構(gòu)，在100v的恒壓下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后加入封閉液封閉1h，封閉完成加入預(yù)先稀釋的一抗，4℃孵育過夜，回收抗體，并加入tbst清洗，加入預(yù)先稀釋好的二抗，室溫孵育30min，tbst清洗四次后檢測(cè)，滴加新鮮預(yù)混的ecl溶液至蛋白側(cè)，暗室曝光，膠片掃描存檔，用image j分析軟件進(jìn)行灰度分析。
33.通過上述設(shè)計(jì)方案，本發(fā)明可以帶來如下有益效果：一種分析pgg抗胃癌作用機(jī)制的方法，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證pgg抗胃癌作用機(jī)制，將體內(nèi)外藥效學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)以及相關(guān)通路進(jìn)行對(duì)應(yīng)，確定其潛在的分子機(jī)制，為后續(xù)的開發(fā)應(yīng)用提供參考。
34.進(jìn)一步的，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘出pgg抗癌靶點(diǎn)328個(gè)，進(jìn)一步篩選驗(yàn)證獲得20個(gè)hub基因，通過對(duì)hub基因進(jìn)行g(shù)o、kegg分析推測(cè)pgg抗胃癌的作用機(jī)制可能與pi3k-akt信號(hào)通路、mapk信號(hào)通路有關(guān)。
35.pgg在體外可以顯著抑制mfc細(xì)胞的增殖及克隆。隨著pgg濃度由0μm梯度升至200μm小鼠mfc細(xì)胞凋亡率及活性氧含量也逐漸增加，線粒體膜電位逐漸降低，細(xì)胞生長(zhǎng)被阻滯在s期。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可知pgg通過影響細(xì)胞周期，降低線粒體膜電位釋放活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤的作用。
36.pgg在體內(nèi)顯著抑制小鼠胃癌異位移植瘤的生長(zhǎng)，對(duì)小鼠臟器無顯著毒性且其能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，能激活小鼠體內(nèi)的免疫系統(tǒng)。qrt-pcr、western blot對(duì)預(yù)測(cè)通路進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)pgg通過阻礙pi3k/akt信號(hào)通路和mapk-p38信號(hào)通路激活線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生內(nèi)源性凋亡發(fā)揮抗胃癌作用。
37.本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。
附圖說明
38.通過結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明示例性實(shí)施方式進(jìn)行更詳細(xì)的描述，本發(fā)明的上述以及其
它目的、特征和優(yōu)勢(shì)將變得更加明顯。
39.圖1為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲取pgg-靶-胃癌網(wǎng)絡(luò)圖。
40.圖2為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)關(guān)鍵靶點(diǎn)hub基因網(wǎng)絡(luò)圖。
41.圖3為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)go功能富集示意圖。
42.圖4為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)kegg功能富集示意圖。
43.圖5為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法體外藥效學(xué)考察pgg對(duì)鼠源胃癌(mfc)細(xì)胞增殖抑制的影響。
44.圖6為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法體外藥效學(xué)考察pgg對(duì)mfc細(xì)胞周期的影響。
45.圖7為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法體外藥效學(xué)分析pgg對(duì)mfc細(xì)胞凋亡的影響。
46.圖8為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法體外藥效學(xué)分析pgg對(duì)mfc細(xì)胞線粒體膜電位的影響。
47.圖9為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法體外藥效學(xué)分析pgg對(duì)mfc細(xì)胞活性氧含量的影響。
48.圖10為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法體內(nèi)藥效學(xué)考察pgg對(duì)小鼠抑瘤率的影響。
49.圖11為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析pgg對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。
50.圖12為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法分析pgg抗胃癌信號(hào)通路基因mrna變化。
51.圖13為本發(fā)明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法分析pgg抗胃癌信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白變化。
具體實(shí)施方式
52.下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。雖然以下描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，然而應(yīng)該理解，可以以各種形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明而不應(yīng)被這里闡述的實(shí)施方式所限制。
53.實(shí)施例
54.本實(shí)施例用于說明一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，包括網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，體內(nèi)外藥效學(xué)分析：
55.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析
56.genecard、omim和disgenet三個(gè)數(shù)據(jù)庫篩選得到胃癌相關(guān)基因11842個(gè)，獲得胃癌相關(guān)靶基因11961個(gè)。pubchem數(shù)據(jù)庫中獲取pgg的二維結(jié)構(gòu)，將化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入pharmmapper、swisstargetprediction數(shù)據(jù)庫共得到pgg靶基因372個(gè)。胃癌基因與pgg基因取交集得到328個(gè)交叉靶基因，為進(jìn)一步展現(xiàn)靶基因與胃癌關(guān)系，使用cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建了一個(gè)“pgg-gc-靶”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。
57.交叉基因?qū)雜tring數(shù)據(jù)庫中得到含有328個(gè)節(jié)點(diǎn)，3442條邊，平均節(jié)點(diǎn)自由度為21的蛋白互作圖，把蛋白互作圖導(dǎo)出為tsv格式輸入到cytoscap-e3.7.1中，使用cytohubba插件將蛋白互作圖計(jì)算篩選前20的hub基因，它們分別是：src、hras、akt1、rhoa、hsp90aa1、cdc42、mapk14、mapk8、egfr、igf1、mmp9、casp3、esr1、tp53、vegfa、igf1r、mmp2、alb、ar、fgf2，見圖2。
58.autodock vina對(duì)接結(jié)果顯示hub基因與pgg的結(jié)合自由能均小于0其中10個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合自由能小于等于-9.0kcal/mol，說明大部分靶點(diǎn)與五沒食子酰葡萄糖的結(jié)合能力較好。將hub基因輸入kaplan-meier plotter數(shù)據(jù)庫中，得出hub基因與疾病預(yù)后p值均小于0.05。綜上證明hub基因與疾病和藥物密切相關(guān)，見圖3、4。
59.為了闡明pgg對(duì)胃癌的作用機(jī)制，通過r包和david數(shù)據(jù)庫對(duì)20個(gè)hub基因進(jìn)行g(shù)o和kegg分析，go結(jié)果表明在生物過程方面與凋亡過程的負(fù)調(diào)控、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路等有關(guān)，kegg結(jié)果顯示的ras、rap1、neurotrophin、erbb信號(hào)通路主要下游mapk及pi3k/akt信號(hào)通路有關(guān)，推測(cè)pgg抗胃癌的潛在分子機(jī)制主要是通過阻滯pi3k/akt信號(hào)通路與mapk信號(hào)通路激活內(nèi)源性凋亡。
60.體外藥效學(xué)分析
61.pgg抑制胃癌細(xì)胞(mfc)的增殖實(shí)驗(yàn)：藥物處理24h后pgg濃度為50μm時(shí)mfc細(xì)胞生長(zhǎng)被顯著抑制(p《0.05)，小鼠胃癌mfc細(xì)胞存活率隨著藥物濃度的升高而降低。藥物處理48h后pgg濃度為25μm時(shí)mfc細(xì)胞生長(zhǎng)被顯著抑制(p《0.01)，pgg與5-fu沒有顯著差異。pgg孵育24h的ic50為239.88μm效果優(yōu)于5-fu 288.40μm；5-fu處理48h的ic50為22.38μm效果優(yōu)于pgg ic50 51.64μm，結(jié)果表明24h之內(nèi)pgg效果優(yōu)于5-fu，見圖5。
62.用含有pgg和5-fu的含藥培養(yǎng)基處理細(xì)胞10天結(jié)果，藥物處理下的mfc細(xì)胞克隆能力受到顯著抑制，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞克隆能力越弱。25μm與50μm藥物條件下5-fu效果好于pgg(p《0.01)，隨著藥物濃度升高至100μm和200μm兩者抑制細(xì)胞克隆效果無顯著差異。
63.pgg對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響：pgg處理小鼠胃癌mfc細(xì)胞48h后與空白對(duì)照組相比各個(gè)濃度下的細(xì)胞周期均出現(xiàn)不同變化，藥物濃度在25μm以下g0/g1期無明顯變化，s期數(shù)量增加(p《0.01)，g2/m期比例降低(p《0.05)。藥物濃度升高至50-200μm后g0/g1期、g2/m期比例顯著降低(p《0.001)，s期比例顯著升高(p《0.001)，g2/m期比例顯著降低(p《0.001)，見圖6。以上結(jié)果說明pgg將細(xì)胞阻滯s期抑制小鼠胃癌mfc細(xì)胞的生長(zhǎng)。
64.pgg對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響：隨著pgg濃度的上升，小鼠胃癌mfc細(xì)胞的凋亡比例也不斷增加，當(dāng)pgg濃度達(dá)到200μm時(shí)與對(duì)照組相比晚期凋亡比例增加了25.53％，早期凋亡比例增加了31.38％與證明了pgg可以誘導(dǎo)小鼠胃癌mfc細(xì)胞的凋亡，見圖7。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)細(xì)胞凋亡流式分析結(jié)果表明隨著pgg濃度升高細(xì)胞凋亡率也不斷上升。
65.pgg對(duì)胃癌細(xì)胞線粒體的膜電位影響：采用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(jc-1)檢測(cè)癌細(xì)胞的線粒體膜電位情況。不同濃度的pgg對(duì)小鼠胃癌細(xì)胞處理48h，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞的線粒體膜電位發(fā)生了變化，且隨著濃度升高線粒體膜電位不斷的降低，表明pgg導(dǎo)致胃癌細(xì)胞線粒體膜電位的降低誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，見圖8。
66.pgg對(duì)胃癌細(xì)胞內(nèi)活性氧含量影響：使用200μm pgg處理小鼠胃癌mfc細(xì)胞48h后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化發(fā)現(xiàn)與空白組相比給藥組細(xì)胞內(nèi)活性氧含量顯著增加(p《0.001)，
說明細(xì)胞凋亡伴隨著活性氧的增加，見圖9。
67.pgg對(duì)體內(nèi)胃癌的影響：在體內(nèi)通過腋下注射mfc細(xì)胞建立小鼠胃癌模型檢測(cè)pgg在體內(nèi)的效果。給藥完成后將小鼠處死，對(duì)腫瘤及各臟器進(jìn)行稱重，與模型組相比pgg及5-fu給藥組的腫瘤重量均小于模型組，不同濃度的pgg對(duì)小鼠胃癌移植瘤均有抑制作用，pgg高劑量組抑瘤率為54.71％，效果優(yōu)于5-fu，見圖10。
68.pgg對(duì)體腫瘤細(xì)胞凋亡的影響：對(duì)小鼠胃癌組織進(jìn)行he染，染結(jié)果顯示小鼠腫瘤組織與模型組相比出現(xiàn)大面積的核壞死及核碎裂。tunel染結(jié)果顯示pgg高劑量組出現(xiàn)大面積的棕黃，表明高劑量能顯著誘導(dǎo)小鼠胃癌腫瘤細(xì)胞凋亡，見圖11。
69.pgg抗胃癌信號(hào)通路基因及蛋白表達(dá)影響：小鼠預(yù)測(cè)通路mrna結(jié)果顯示與模型組相比，akt、pi3k、mtor比對(duì)照組表達(dá)水平顯著降低(p《0.05)，egfr表達(dá)水平升高(p《0.05)，p38表達(dá)水平降低(p《0.05)，erk和jnk相比對(duì)照組無明顯變化，見圖12。蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，bax、cyto c、caspase3、caspase9相比對(duì)照組表達(dá)量顯著升高(p《0.05)，bcl2表達(dá)量顯著降低(p《0.001)，p-akt、p38、bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)(p《0.05)，c-caspase-3、bax表達(dá)上調(diào)(p《0.05)，見圖13。
70.以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實(shí)施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實(shí)施例。在不偏離所說明的各實(shí)施例的范圍和精神的情況下，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。
技術(shù)特征：
1.一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，其特征在于，包括以下步驟：s1、胃癌及pgg靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)：在genecard、omim和disgenet三個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫以“gastric cancer”為關(guān)鍵詞篩選得到胃癌相關(guān)靶點(diǎn)；以“pentagalloylglucose”為關(guān)鍵詞在swisstargetprediction和pharmmapper數(shù)據(jù)庫中篩選得到pgg相關(guān)靶點(diǎn)；兩者交集得到pgg抗胃癌的潛在靶點(diǎn)；s2、pgg抗胃癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及hub基因的篩選：將交集靶點(diǎn)輸入到string數(shù)據(jù)庫選擇物種為“homo sapiens”，最低關(guān)系分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.4，除去游離的蛋白得到蛋白互作圖，將其導(dǎo)入cytoscape3.7.1中利用cytohubba插件中的mcc計(jì)算方法篩選出排名前20的靶基因；s3、hub基因的驗(yàn)證：關(guān)鍵靶基因使用pdb數(shù)據(jù)庫獲取對(duì)應(yīng)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)保存為pdb格式，chem3d軟件將pgg二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成三維結(jié)構(gòu)保存為mol2格式，使用autodock vina將hub蛋白與pgg進(jìn)行分子對(duì)接；kaplan-meier生存曲線分析hub基因?qū)ξ赴┗颊叩念A(yù)后價(jià)值，黑折線代表基因在胃癌中低表達(dá)，紅折線代表基因在胃癌中高表達(dá)；s4、go、kegg分析：將hub基因輸入到david數(shù)據(jù)庫中得到go和kegg結(jié)果，得到的結(jié)果使用rstudio進(jìn)行繪圖；s5、胃癌體外模型的構(gòu)建：取鼠源胃癌(mfc)細(xì)胞，37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)基為補(bǔ)加10％滅活胎牛血清、100u/ml青霉素以及10mg/l鏈霉素；細(xì)胞貼壁后吸出培養(yǎng)基，用pbs清洗兩次，繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80％-90％用胰蛋白酶進(jìn)行消化，傳代，每1～2天傳代一次；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞備用；s6、pgg抑制胃癌細(xì)胞的增殖、周期、線粒體膜電位、活性氧含量及凋亡：將標(biāo)品pgg配制成不同濃度分別對(duì)小鼠胃癌細(xì)胞進(jìn)行處理，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)、線粒體膜電位檢測(cè)以及細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)；s7、胃癌體內(nèi)模型的構(gòu)建：取雌雄各半共40只6周齡的spf級(jí)balb/c小鼠在23℃室溫條件下飼養(yǎng)于武漢輕工大學(xué)動(dòng)物中心，光照循環(huán)，自由獲取水與食物，實(shí)驗(yàn)前正常飼養(yǎng)一周適應(yīng)環(huán)境；將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1
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107cells/ml，取0.2ml的細(xì)胞懸液注射于小鼠腋下建立小鼠模型；s8、pgg誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)胃癌的凋亡及抑制相關(guān)信號(hào)通路：4天后隨機(jī)將小鼠分成5組每組8只，實(shí)驗(yàn)組分別使用15mg/kg和30mg/kg的pgg、20mg/kg的5-fu和pbs按照兩天一次的頻率進(jìn)行腹腔注射，隔天記錄小鼠體重與腫瘤大小，飼養(yǎng)至第14天使用乙醚對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，取血處死；收集小鼠肝、脾、腎與腫瘤分別置于4％的甲醛固定液與-80℃的冰箱中；對(duì)臟器進(jìn)行he切片染，初步觀察pgg體內(nèi)毒性；對(duì)小鼠腫瘤組織進(jìn)行tunel染觀察pgg體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤凋亡情況；在通路驗(yàn)證方面分為兩個(gè)層次—基因?qū)用孢M(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，蛋白層面則采用蛋白質(zhì)印跡法。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，其特征在于，所述s4基因通路的驗(yàn)證主要是經(jīng)過go和kegg富集分析所得到的pi3k-akt、mapk信號(hào)
通路。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，其特征在于，步驟s6鼠源胃癌mfc細(xì)胞進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)為，將標(biāo)品pgg分別溶于少量的二甲亞楓之中，用培養(yǎng)基稀釋成0μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm、200μm，對(duì)照組加入相同濃度、體積的五氟尿嘧啶；將s5對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的鼠源胃癌mfc細(xì)胞接種于96孔板，每組五個(gè)復(fù)孔；培養(yǎng)24小時(shí)后將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸出，pbs清洗兩次，加等量0μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm、200μm的pgg以及陽性對(duì)照組五氟尿嘧啶孵育24小時(shí)以及48小時(shí)，到時(shí)間后甩出孔板的含藥培養(yǎng)基，pbs清洗后每孔加入10μl的cck-8溶液放置培養(yǎng)箱中孵育三個(gè)小時(shí)，將孔板置于酶標(biāo)儀讀取450nm處的吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，其特征在于，梯度濃度的pgg孵育小鼠胃癌mfc細(xì)胞48h，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，并收集細(xì)胞；pbs洗滌六孔板中的胃癌mfc細(xì)胞2次，胰酶消化1500rpm/min，5min離心收集孔板中細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1
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106cells/ml，取1ml細(xì)胞懸液離心除去上清后，加入500μl的70％預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞2h至過夜，染前使用pbs清洗細(xì)胞，把100μl rnase a溶液加入至清洗好的細(xì)胞沉淀中重懸細(xì)胞，37℃水浴30min，加入400μl pi染液混勻，4℃避光孵育30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，其特征在于，步驟s6鼠源胃癌mfc細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)為，梯度濃度的pgg孵育小鼠胃癌mfc細(xì)胞48h，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組；2-8℃，1000rpm/min離心5min收集懸浮細(xì)胞；預(yù)冷pbs洗滌細(xì)胞兩次，加入400μl 1
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annexin v結(jié)合液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度至1
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106cells/ml；在細(xì)胞懸浮液中加入5μl annexin v-fitc染液，輕輕混勻后于2-8℃避光條件下孵育15分鐘，加入5-10μl pi染液后輕輕混勻于2-8℃避光條件下孵育2-5分鐘立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，其特征在于，步驟s6鼠源胃癌mfc細(xì)胞進(jìn)行線粒體膜電位實(shí)驗(yàn)為，取六孔板每孔接種1
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106個(gè)細(xì)胞，12h后用含有梯度濃度的pgg處理細(xì)胞48h；吸出含藥培養(yǎng)基，pbs清洗兩遍后加入胰酶消化液收集細(xì)胞于1.5ml離心中；調(diào)整細(xì)胞濃度為1
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106cells/ml，取0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；加入0.5ml的jc-1染工作液，顛倒混勻，37℃孵育20min；加入1ml jc-1染工作液，充分混勻；細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20min，孵育結(jié)束后吸除上清，用jc-1 1
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染緩沖液洗滌2次；加入0.5ml jc-1染緩沖液重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，其特征在于，步驟s6鼠源胃癌mfc細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活性氧含量變化實(shí)驗(yàn)為，取六孔板每孔接種1
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106個(gè)細(xì)胞，12h后用含有梯度濃度的pgg處理細(xì)胞48h；胰酶消化收集細(xì)胞，用1ml pbs洗滌兩次，1000rpm/min收集細(xì)胞沉淀；加入用無血清培養(yǎng)液稀釋的終濃度為10μm的dcfh-da熒光探針重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1
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106cells/ml；取一份不加探針，只加入培養(yǎng)基的細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照管；取一份已加入探針的細(xì)胞，同時(shí)加入活性氧供氫體誘導(dǎo)細(xì)胞設(shè)為陽性對(duì)照管；37℃孵育細(xì)胞1h，1000rpm/min收集細(xì)胞，pbs洗滌后重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，其特征在于，步驟s8鼠源胃癌mfc細(xì)胞進(jìn)行he染為，將組織從固定液中取出修繕平整后進(jìn)行脫水與石蠟包埋，并于石蠟切片機(jī)上切成4μm厚的切片，切片脫蠟至水，蘇木素-伊紅對(duì)切片染
，染結(jié)束脫水使用中性樹膠進(jìn)行封片；取新石蠟切片脫蠟至水，使用蛋白酶k工作液進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，加試劑tdt，dutp，37℃水浴孵育2h，切片放入3％雙氧水溶液，室溫避光孵育15min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，切片加適量試劑converter-pod覆蓋組織，清洗后加入dab顯并使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，脫水封片。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，其特征在于，步驟s8鼠源胃癌mfc細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)為，取腫瘤組織30mg置于含有trizol的勻漿管中冷凍勻漿，勻漿結(jié)束后轉(zhuǎn)移勻漿管上清至2ml ep管中；管中加入200μl氯仿，劇烈震蕩，4℃，12000rpm/min，離心15min，將最上層清液約300μl轉(zhuǎn)移至新ep管，加入600μl的異丙醇上下顛倒后，離心得到rna沉淀，使用75％的乙醇清洗沉淀，清洗結(jié)束離心晾干沉淀，加入50μl的depc水溶解沉淀；紫外分光光度計(jì)測(cè)定rna的濃度；使用試劑盒除將rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna加入設(shè)計(jì)好的引物，以β-actin作為內(nèi)參基因按照兩步法程序進(jìn)行定量分析。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選pgg抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，其特征在于，鼠源胃癌mfc細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)western blot實(shí)驗(yàn)為，腫瘤組織從-80℃取出解凍，剪碎后放入盛有組織蛋白提取試劑的勻漿管中低溫勻漿，勻漿完成后冰浴30min使其裂解徹底，4℃，12000rpm/min離心15min收集上清總蛋白，使用bca蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清總蛋白的濃度，根據(jù)蛋白的濃度確定樣品蛋白上樣量為40μg，并在蛋白樣品中加入5
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蛋白上樣緩沖液，95-100℃沸水浴5min；配制分離膠與濃縮膠，取出上樣梳將樣品按照設(shè)計(jì)加入至上樣孔；預(yù)先使用甲醇活化pvdf膜，按照按照正負(fù)極方位擺放轉(zhuǎn)膜所需的三層結(jié)構(gòu)，在100v的恒壓下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后加入封閉液封閉1h，封閉完成加入預(yù)先稀釋的一抗，4℃孵育過夜，回收抗體，并加入tbst清洗，加入預(yù)先稀釋好的二抗，室溫孵育30min，tbst清洗四次后檢測(cè)，滴加新鮮預(yù)混的ecl溶液至蛋白側(cè)，暗室曝光，膠片掃描存檔，用image j分析軟件進(jìn)行灰度分析。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選PGG抗胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的方法，并采用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討驗(yàn)證。包括以下步驟：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)PGG可能通過PI3K-AKT、MAPK信號(hào)通路抑制胃癌生長(zhǎng)；CCK-8法和平板克隆實(shí)驗(yàn)分別用于檢測(cè)細(xì)胞活力與細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡、線粒體膜電位變化以及細(xì)胞內(nèi)活性氧含量變化，HE切片檢測(cè)小鼠腫瘤病變，TUEL染檢測(cè)小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡；實(shí)時(shí)熒光定量以及免疫印記法檢測(cè)PI3K-AKT、MAPK信號(hào)通路相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)。通過對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的通路驗(yàn)證表明PGG可通過調(diào)控PI3K-AKT和MAPK-P38信號(hào)通路促腫瘤凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，PGG被證明是胃癌的一種潛在藥物。癌的一種潛在藥物。癌的一種潛在藥物。
