一種真菌DA模板高效制備方法與流程
一種真菌dna模板高效制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種真菌dna模板高效制備方法。
背景技術(shù)：
2.目前dna模板制備方法主要包括試劑盒提取法、經(jīng)典的酚氯仿抽提法、蛋白酶k消化裂解法等，但這些方法在使用過程中都存在一定的缺點(diǎn)。試劑盒提取法需要購(gòu)買商品化試劑盒，提取過程需要冰浴、消化、過柱、洗滌、離心等，操作要求高，程序復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，且不同試劑盒提取的模板質(zhì)量不同，不適用于大量樣本的提取；蛋白酶k消化裂解法屬于酶解法的一種，適用于所有樣本的消化處理，但所需的各類溶液配制相當(dāng)繁瑣，消化處理后雜質(zhì)較多，需要配合有機(jī)試劑抽提或離心去除雜質(zhì)提高純度，同時(shí)蛋白酶k本身就是一種蛋白雜質(zhì)，經(jīng)過消化處理的樣品還需高溫滅活蛋白酶k，操作步驟多，耗時(shí)長(zhǎng)，技術(shù)要求較高，有機(jī)試劑的使用對(duì)操作者危害較大。
3.cn109811034a公開了一種高純度dna模板的制備方法，其技術(shù)方案是：將培養(yǎng)的菌株置于加入無(wú)菌去離子水的pcr管中形成混合菌液，將混合菌液置于pcr儀中高溫裂解，后降溫冷卻；然后在離心機(jī)上經(jīng)12000-15000rpm離心，吸取上清液，棄除沉淀物，即獲得高純度dna模板；依據(jù)需求將獲得的高純度dna模板直接或經(jīng)稀釋后加入pcr體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增。該方法對(duì)于真菌dna模板的制備所得濃度較低，需要進(jìn)一步純化提高pcr產(chǎn)物的濃度。
4.cn111304289a公開了一種dna模板制備液，包括以下成分：?jiǎn)蝺r(jià)陽(yáng)離子鹽、乙醇，溶劑為水；其中所述單價(jià)陽(yáng)離子的終濃度為0.1-0.8m，所述乙醇的終濃度為0.5-30％；還公開了一種dna模板的制備方法，包括以下步驟：(1)將抗凝血液和dna模板制備液以體積比1:1-200混合；(2)將步驟(1)得到的混合液直接離心或靜置5min后離心，上清液即為dna模板。該方法主要適用于血細(xì)胞dna的提取。
5.由以上論述可知，目前dna模板的制備方法仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
6.本發(fā)明主要目的在于提供一種真菌dna模板高效制備方法，本發(fā)明所述方法可以使菌體dna充分釋放，無(wú)需dna的提取，采用所得上清液即可進(jìn)行pcr；并且本發(fā)明所述方法操作簡(jiǎn)單，用時(shí)較短，適用于大批量操作。
7.為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
8.本發(fā)明提供一種真菌dna模板高效制備方法，所述方法包括以下步驟：將樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)基富集；離心，棄上清液后加入te緩沖液，震蕩均勻后進(jìn)行煮沸、冷凍；融化、震蕩搖勻，進(jìn)行超聲處理，離心取上清即得。
9.進(jìn)一步地，平板培養(yǎng)至長(zhǎng)出肉眼可見菌落時(shí)，挑取菌落至ep管內(nèi)，加入0.1-2ml液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)5-48h。
10.進(jìn)一步地，棄上清液后加入50-500μl1 x te緩沖液。
11.進(jìn)一步地，冷凍后取出在50-100℃條件下進(jìn)行融化、震蕩搖勻。
12.進(jìn)一步地，在20-50hz頻率條件下超聲1-10min。
13.與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)：
14.本發(fā)明所述方法可以使菌體dna充分釋放，制備全程無(wú)需進(jìn)行對(duì)ep管進(jìn)行開蓋操作，避免了其它dna的污染。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，用時(shí)較短，適用于大批量操作。
15.本發(fā)明方法可高效、穩(wěn)定地應(yīng)用于真菌dna模板的制備。
附圖說明
16.圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所述方法制備得到的基因組dna模板pcr結(jié)果圖：m，dna分子量標(biāo)準(zhǔn)marker(100-2000)；n，陰性對(duì)照；1-2，5-8光滑念珠菌；3-4白念珠菌；
17.圖2為本發(fā)明對(duì)比例1-5所述方法制備得到的基因組dna模板pcr結(jié)果圖：m，dna分子量標(biāo)準(zhǔn)marker(100-2000)；n，陰性對(duì)照；1-3，對(duì)比例1制備得到的模板；4-6：對(duì)比例2制備得到的模板；7-9：對(duì)比例3制備得到的模板；10-13，對(duì)比例4制備得到的模板；14-15：對(duì)比例5制備得到的模板。
具體實(shí)施方式
18.應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是示例性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。
19.需要注意的是，這里所使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作以及它們的組合。
20.為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
21.本發(fā)明所述te緩沖液可采用市售產(chǎn)品，也可采用以下所述方法制備：
22.mtris-hcl(ph8.0)50ml的配制：稱取tris堿606g，加超純水40ml溶解，滴加濃hci約21ml調(diào)ph至8.0，定容至50ml。
23.0.5medta(ph8.0)50ml的配制：稱取edta-na2·
2h2o 9306g，加超純水35ml，劇烈攪拌，用約1qnaoh顆粒調(diào)ph至8.0定容至50ml。(edta二鈉鹽需加入naoh將ph調(diào)至接近8.0時(shí)，才會(huì)溶解。)
24.1.3、1xte(10mmtris-hcl，ph8.0；1mmedta ph8.0)的配制:
25.1mtris-hci(ph8.0)1ml
26.0.5medta(ph8.0)0.2ml
27.超純水至100ml。
28.實(shí)施例1
29.一種真菌dna模板高效制備方法，所述方法包括以下步驟：將樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)，平板培養(yǎng)至長(zhǎng)出肉眼可見菌落時(shí)，挑取菌落至ep管內(nèi)，加入1ml液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)24h；12000r/min離心1min，棄上清液后加入300μl 1 x te緩沖液，震蕩均勻后進(jìn)行煮沸，煮沸3min，立即于-20℃條件下冷凍8min；在65℃條件下進(jìn)行融化并震蕩搖勻。40hz頻率條件
下超聲5min，12000r/min離心2min，取上清液作為dna模板。
30.實(shí)施例2
31.一種真菌dna模板高效制備方法，所述方法包括以下步驟：將樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)，平板培養(yǎng)至長(zhǎng)出肉眼可見菌落時(shí)，挑取菌落至ep管內(nèi)，加入0.1ml液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)5h；15000r/min離心1min，棄上清液后加入50μl 1 x te緩沖液，震蕩均勻后進(jìn)行煮沸，煮沸5min，立即于-20℃條件下冷凍10min；在50℃條件下進(jìn)行融化并震蕩搖勻。20hz頻率條件下超聲10min，15000r/min離心5min，取上清液作為dna模板。
32.實(shí)施例3
33.一種真菌dna模板高效制備方法，所述方法包括以下步驟：將樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)，平板培養(yǎng)至長(zhǎng)出肉眼可見菌落時(shí)，挑取菌落至ep管內(nèi)，加入2ml液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)48h；12000r/min離心5min，棄上清液后加入500μl 1 x te緩沖液，震蕩均勻后進(jìn)行煮沸，煮沸5min，立即于-80℃條件下冷凍7min；在100℃條件下進(jìn)行融化并震蕩搖勻。50hz頻率條件下超聲1min，12000r/min離心1min，取上清液作為dna模板。
34.對(duì)比例1
35.一種dna模板制備方法：將樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)，平板培養(yǎng)至長(zhǎng)出肉眼可見菌落時(shí)，挑取菌落至ep管內(nèi)，加入1ml液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)24h；12000r/min離心1min，棄上清后加入20μl 1 x te緩沖液，震蕩均勻后進(jìn)行煮沸，煮沸3min，立即于-20℃條件下冷凍8min；12000r/min離心5min，取上清液作為dna模板。
36.對(duì)比例2
37.一種dna模板制備方法：將樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)，平板培養(yǎng)至長(zhǎng)出肉眼可見菌落時(shí)，挑取菌落至ep管內(nèi)，加入1ml液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)24h；12000r/min離心1min，棄上清后加入20μl 1 x te緩沖液，震蕩均勻后進(jìn)行煮沸，煮沸3min，立即于-20℃條件下冷凍8min；再重復(fù)一次以上煮沸、冷凍步驟；12000r/min離心5min，取上清液作為dna模板。
38.對(duì)比例3
39.一種dna模板制備方法：將樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)，平板培養(yǎng)至長(zhǎng)出肉眼可見菌落時(shí)，挑取菌落至ep管內(nèi)，加入1ml液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)24h；12000r/min離心1min，棄上清后加20μl 1 x te緩沖液，加入高壓滅菌的石英砂，煮沸5min，然后立即于-20℃條件下冷凍8min；再重復(fù)一次以上煮沸、冷凍步驟；渦旋5min，12000r/min離心5min，取上清液作為dna模板。
40.對(duì)比例4
41.一種dna模板制備方法：將樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)，平板培養(yǎng)至長(zhǎng)出肉眼可見菌落時(shí)，挑取菌落至ep管內(nèi)，加入1ml對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基，富集培養(yǎng)24h后，加入適量ripe裂解液，12000r/min離心5min，取上清液作為dna模板。
42.對(duì)比例5
43.一種dna模板制備方法：將樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)，平板培養(yǎng)至長(zhǎng)出肉眼可見菌落時(shí)，挑取菌落至ep管內(nèi)，加入1ml液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)24h；12000r/min離心1min，棄上清液后用500ul裂解液重懸，超聲處理30s；12000r/min離心5min后棄上清，用500ul裂解液重懸，超聲處理30s；12000r/min離心5min，取上清液作為dna模板。
44.所用裂解液為：0.5mol/ledta，1mol/l tris-hcl，0.3％sds；ph8.0。
45.以光滑念珠菌、白念珠菌為例，采用實(shí)施例1、對(duì)比例1-5所述方法進(jìn)行基因組dna模板制備。
46.采用its的通用引物(its1/its4：5
’?
tccgtaggtgaacctgcgg-3
’5’?
tcctccgcttattgatatgc-3’)，根據(jù)不同菌種目的片段大小在500-750bp之間，部分真菌在1000bp左右。
47.各組取3μldna至20μl體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：
48.①
98℃預(yù)變性2min；
49.②
94℃變性10sec；
50.③
55℃退火15sec；
51.④
72℃延伸45sec；
52.⑤
重復(fù)步驟
②?④
30次；
⑥
72℃延伸1min。
53.所得結(jié)果如圖1、圖2所示。
54.由圖1、圖2可知：與圖2相比，圖1中條帶更為明亮，無(wú)雜帶和引物二聚體，表明本發(fā)明實(shí)施例1所述方法針對(duì)真菌dna模板制備效果更好，能夠使真菌dna充分釋放。對(duì)光滑念珠菌、白念珠菌兩株真菌進(jìn)行dna模板的制備，圖1中所有模板均有條帶，而圖2中有的相應(yīng)孔道幾乎為空白，由此可見本發(fā)明方法效果穩(wěn)定，重復(fù)度高。
55.由以上可知，本發(fā)明方法效果穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)單方便、大大簡(jiǎn)化了dna模板制備過程，可應(yīng)用于人體常見真菌。不借助于其他試劑以及復(fù)雜儀器，無(wú)需進(jìn)行開蓋加試劑操作，可確保生物安全。
56.上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
技術(shù)特征：
1.一種真菌dna模板高效制備方法，其特征在于，將樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)基富集；離心，棄上清液后加入te緩沖液，震蕩均勻后進(jìn)行煮沸、冷凍；融化、震蕩搖勻，進(jìn)行超聲處理，離心取上清即得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述真菌dna模板高效制備方法，其特征在于，平板培養(yǎng)至長(zhǎng)出肉眼可見菌落時(shí)，挑取菌落至ep管內(nèi)，加入0.1-2ml液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)5-48h。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述真菌dna模板高效制備方法，其特征在于，加入50-500μl 1xte緩沖液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述真菌dna模板高效制備方法，其特征在于，冷凍后取出在50-100℃條件下進(jìn)行融化、震蕩搖勻。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述真菌dna模板高效制備方法，其特征在于，在20-50hz頻率條件下超聲1-10min。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種真菌DA模板高效制備方法。所述方法包括以下步驟：將樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)基富集；離心，棄上清液后加入TE緩沖液，震蕩均勻后進(jìn)行煮沸、冷凍；融化、震蕩搖勻，進(jìn)行超聲處理，離心取上清即得。本發(fā)明所述方法可以使菌體DA充分釋放，無(wú)需DA的提取，采用所得上清液即可進(jìn)行PCR；并且本發(fā)明所述方法操作簡(jiǎn)單，用時(shí)較短，適用于大批量操作。適用于大批量操作。適用于大批量操作。
