一種AFA衍生物的制備方法及其應(yīng)用與流程
一種afa衍生物的制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種afa衍生物的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2.癌癥嚴(yán)重威脅人類健康，其誘發(fā)因素往往源于信號(hào)通路中激酶的異常活化。另外，自身免疫病、神經(jīng)退行病等常見高發(fā)慢性病也與激酶異常密切相關(guān)。2001年，第一個(gè)激酶抑制劑類藥物格列衛(wèi)(gleevec)在美獲批上市，開啟了癌癥靶向新時(shí)代，療效顯著優(yōu)于化療。截至2019年底，fda共批準(zhǔn)了52個(gè)激酶抑制劑。雖然數(shù)量較多，但由于癌癥種類繁多、涉及的異常激酶眾多且變異類型多樣、以及使用后耐藥等因素，癌癥在臨床上仍存在重大未滿足的需求。另外，這些上市藥物僅靶向大約25個(gè)激酶，僅占人體518個(gè)激酶中的5％，尚有大量激酶暫未成藥。因此，這類藥物研發(fā)空間巨大。
3.抗腫瘤新藥主要來源于天然產(chǎn)物類似物。因此，有效合成天然產(chǎn)物類似物的創(chuàng)新技術(shù)對(duì)于新藥發(fā)現(xiàn)來說至關(guān)重要。天然產(chǎn)物往往結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有多個(gè)手性中心。相對(duì)于化學(xué)合成，因具有嚴(yán)格的區(qū)域和立體選擇性，生物合成更有優(yōu)勢(shì)。尤其是合成生物學(xué)原理與技術(shù)的日益成熟，使得天然產(chǎn)物類似物的有效合成易于實(shí)現(xiàn)。
4.雙吲哚生物堿是一類含有兩個(gè)吲哚基團(tuán)的天然產(chǎn)物，代表化合物為具有抗腫瘤活性的蝴蝶霉素(rebeccamycin)。蝴蝶霉素是一種來源于放線菌的天然產(chǎn)物，具有強(qiáng)效的拓?fù)洚悩?gòu)酶和激酶抑制活性。開發(fā)雙吲哚生物堿類似物的有效合成技術(shù)，是促成這類化合物廣泛成藥的關(guān)鍵因素。
5.蝴蝶霉素的生物合成基因簇dna序列在2002年被測(cè)定，天然合成酶系被初步識(shí)別。隨后，多個(gè)天然合成酶如rebo、rebd、rebp、rebc等的催化活性在體外生化實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，基于已鑒定的蝴蝶霉素的生物合成途徑酶系，研究人員在異源宿主白鏈霉菌(streptomyces albus)體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了多個(gè)雙吲哚生物堿類似物(蝴蝶霉素合成中間體)的生物合成，例如，以氨酸為起始使用酶組合rebo，rebd，rebp和rebc實(shí)現(xiàn)了arcyriaflavin a(afa)的合成。
6.afa作為一種重要的藥物中間體，其本身也具有激酶抑制活性，也具有較多的激酶作用靶點(diǎn)，然而關(guān)于激酶靶點(diǎn)，本領(lǐng)域有兩個(gè)方面亟待研究進(jìn)步：第一方面，人體包含518個(gè)激酶，其中大部分激酶還缺失有效的活性抑制劑，因此有必要開發(fā)新的激酶抑制劑。第二方面，本領(lǐng)域公知，靶點(diǎn)越多，其毒性往往越強(qiáng)，而且基于目前藥物領(lǐng)域逐漸趨于特異性作用的研究趨勢(shì)，如何篩選出只針對(duì)一種或兩種激酶作用的抑制劑，將對(duì)于制備特異性好、毒性小的抗癌藥物具有重要的意義。
7.為解決這一問題，本發(fā)明首次提出從afa的衍生物入手，提供一種快速、方便、低成本合成afa的衍生物的方法，并從這些衍生物中篩選得到具有新的激酶靶點(diǎn)，或激酶抑制特異性好(1-2個(gè)靶點(diǎn))的化合物來作為藥物合成中間體，對(duì)于新型、特異性好、毒性小的抗癌藥物的篩選和研發(fā)而言具有重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
8.針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種afa衍生物的制備方法及其應(yīng)用。
9.為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
10.第一方面，本發(fā)明提供一種afa衍生物的制備方法，所述afa衍生物的結(jié)構(gòu)為
11.所述r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8各自獨(dú)立地選自h、ch3、oh、och3、f、cl、br、nh2、cn或no2中的任意一種，且其中至少一種不為h；
12.所述制備方法包括：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到重組大腸桿菌，活化后，將菌株、培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑與原料化合物混合，誘導(dǎo)培養(yǎng)，得發(fā)酵液，萃取，即得所述afa衍生物；
13.所述重組質(zhì)粒攜帶編碼l-氨酸氧化酶vioa、cpa合成酶viob、單加氧酶rebp和單加氧酶rebc的核苷酸序列；
14.所述原料化合物的結(jié)構(gòu)為
15.所述r9、r
10
、r
11
和r
12
各自獨(dú)立地選自h、ch3、oh、och3、f、cl、br、nh2、cn或no2中的任意一種，且其中至少一種不為h。
16.特別說明，本技術(shù)采用所述方法對(duì)于具有上述結(jié)構(gòu)的afa衍生物都成功合成了，由于暫未進(jìn)行激酶抑制活性的測(cè)試或測(cè)試結(jié)果不理想，因此未展示所有化合物的具體結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，采用本技術(shù)提供的方法對(duì)于具有上述結(jié)構(gòu)的afa衍生物來說均適用。
17.優(yōu)選地，所述afa衍生物選自4f-afa、4,4'f-afa、5f-afa、5,5'f-afa、5br-afa、5,5’br-afa、7cl-afa或7,7’cl-afa中的任意一種，分別依次對(duì)應(yīng)如下結(jié)構(gòu)：
[0018][0019]
所述原料化合物具有任意一種如下結(jié)構(gòu)：
[0020][0021]
優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒包括petduet系列、pacycduet系列、prsfduet系列、pcoladuet或pcdfduet系列表達(dá)載體中的任意一種。
[0022]
優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒包括pcdfduet-1_vioaviobrebprebc。
[0023]
優(yōu)選地，所述大腸桿菌包括大腸桿菌bl21(de3)。
[0024]
優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基包括m9培養(yǎng)基。
[0025]
選擇m9培養(yǎng)基是因?yàn)槠渲兄胁缓彼?，可避免afa的產(chǎn)生。
[0026]
優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)劑包括iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)。
[0027]
優(yōu)選地，所述iptg的加入量為0.3-0.5mm，例如0.3mm、0.32mm、0.35mm、0.37mm、0.4mm、0.42mm、0.45mm、0.47mm、0.5mm等。
[0028]
優(yōu)選地，所述原料化合物的加入量為3-5mm，例如3mm、3.2mm、3.5mm、3.7mm、4mm、4.2mm、4.5mm、4.7mm、5mm等。
[0029]
優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為15-25℃，例如15℃、17℃、20℃、22℃、25℃等，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為36-48h，例如36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h等。
[0030]
優(yōu)選地，所述活化包括：將重組大腸桿菌接種至lb培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)。
[0031]
優(yōu)選地，所述活化培養(yǎng)的溫度為33-40℃，例如33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
[0032]
優(yōu)選地，所述萃取中使用的萃取試劑包括乙酸乙酯。
[0033]
優(yōu)選地，所述萃取在15-40℃下進(jìn)行，例如15℃、17℃、20℃、22℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃等。
[0034]
優(yōu)選地，所述萃取前還包括對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行加熱，所述加熱的溫度為80-90℃，例如80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃等，所述加熱的時(shí)間為10-20min，例如10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min等。
[0035]
第二方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的afa衍生物的制備方法或由所述制備方法得到的afa衍生物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
[0036]
第三方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的afa衍生物的制備方法或由所述制備方法得到的afa衍生物在制備激酶抑制劑中的應(yīng)用。
[0037]
優(yōu)選地，所述激酶抑制劑包括flt3itd抑制劑、pim1抑制劑、pim3抑制劑、map4k3抑制劑、irak4抑制劑、pak1抑制劑或cdk7/cych/mat1抑制劑中的任意一種或至少兩種的組合。
[0038]
優(yōu)選地，當(dāng)所述afa衍生物為4f-afa時(shí)，所述激酶抑制劑為flt3itd抑制劑、pim1抑制劑、pim3抑制劑、map4k3抑制劑、irak4抑制劑或pak1抑制劑中的任意一種或至少兩種的組合。
[0039]
優(yōu)選地，當(dāng)所述afa衍生物為7cl-afa時(shí)，所述激酶抑制劑為flt3itd抑制劑和/或pim1抑制劑。
[0040]
優(yōu)選地，當(dāng)所述afa衍生物為5br-afa時(shí)，所述激酶抑制劑為flt3itd抑制劑和/或pim1抑制劑。
[0041]
優(yōu)選地，當(dāng)所述afa衍生物為7,7’cl-afa時(shí)，所述激酶抑制劑為cdk7/cych/mat1抑制劑和/或pim1抑制劑。
[0042]
優(yōu)選地，當(dāng)所述afa衍生物為5f-afa時(shí)，所述激酶抑制劑為flt3itd抑制劑、pim1抑制劑或pim3抑制劑中的任意一種或至少兩種的組合。
[0043]
優(yōu)選地，當(dāng)所述afa衍生物為5,5'f-afa時(shí)，所述激酶抑制劑為flt3itd抑制劑。
[0044]
本發(fā)明所述的數(shù)值范圍不僅包括上述列舉的點(diǎn)值，還包括沒有列舉出的上述數(shù)值范圍之間的任意的點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。
[0045]
相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0046]
本發(fā)明首次提出從afa的衍生物入手，提供一種快速、方便、低成本合成afa的衍生物的方法(生物合成方法)，并從這些衍生物中篩選得到具有新的激酶靶點(diǎn)，或激酶抑制特異性好(1-2個(gè)靶點(diǎn))的化合物來作為藥物合成中間體，對(duì)于新型、特異性好、毒性小的抗癌藥物的篩選和研發(fā)而言具有重要的意義。
[0047]
具體地，本發(fā)明采用所述方法合成了8種afa衍生物：4f-afa、4,4'f-afa、5f-afa、5,5'f-afa、5br-afa、5,5’br-afa、7cl-afa和7,7’cl-afa，各產(chǎn)物之間可以相互分離，且不受其他物質(zhì)干擾，純度高，產(chǎn)量高，合成方法快速、方便、低成本。
[0048]
其中，4f-afa具有抑制map4k3、irak4、pak1的活性，7cl-afa具有抑制cdk7/cych/mat1的活性，這些活性都是afa不具備的，此結(jié)果令人驚喜。這些衍生物可用于制備map4k3、irak4、pak1、cdk7/cych/mat1抑制劑或以這些激酶為靶點(diǎn)的抗癌藥物。
[0049]
7,7’cl-afa與5br-afa僅有兩個(gè)激酶靶點(diǎn)，因此在特異性、毒性方面相較于afa(4個(gè)激酶靶點(diǎn))具有顯著優(yōu)勢(shì)。特別地，5,5'f-afa僅對(duì)flt3itd有抑制活性，可用作flt3itd的
特異性抑制劑，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
附圖說明
[0050]
圖1為實(shí)施例1中所得產(chǎn)物的lc/ms檢測(cè)圖譜，其中a為產(chǎn)物在316nm處的紫外吸收?qǐng)D譜；其中，3.196min和3.310min處的蜂分別對(duì)應(yīng)4,4’f-afa和4f-afa；b為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為342(m-1)的離子圖譜，對(duì)應(yīng)4f-afa；c為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為360(m-1)的離子圖譜，對(duì)應(yīng)4,4’f-afa。
[0051]
圖2為實(shí)施例1中l(wèi)c/ms檢測(cè)圖譜中4f-afa(3.310min)紫外吸收峰所對(duì)應(yīng)蜂的全波長(zhǎng)掃描圖譜。
[0052]
圖3為實(shí)施例2中所得產(chǎn)物的lc/ms檢測(cè)圖譜，其中a為產(chǎn)物在316nm處的紫外吸收?qǐng)D譜；其中，3.791min和3.893min處的蜂分別對(duì)應(yīng)5f-afa和5,5’f-afa；b為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為342(m-1)的離子圖譜，對(duì)應(yīng)5f-afa；c為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為360(m-1)的離子圖譜，對(duì)應(yīng)5,5’f-afa。
[0053]
圖4為實(shí)施例2中l(wèi)c/ms檢測(cè)圖譜中5f-afa(3.791min)紫外吸收峰所對(duì)應(yīng)蜂的全波長(zhǎng)掃描圖譜。
[0054]
圖5為實(shí)施例2中l(wèi)c/ms檢測(cè)圖譜中5,5’f-afa(3.893min)紫外吸收峰所對(duì)應(yīng)蜂的全波長(zhǎng)掃描圖譜。
[0055]
圖6為實(shí)施例3中所得產(chǎn)物的lc/ms檢測(cè)圖譜，其中a為產(chǎn)物在316nm處的紫外吸收?qǐng)D譜；其中，4.095min和4.406min處的蜂分別對(duì)應(yīng)5br-afa和5,5
‘
br-afa；b為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為404(m-1)的離子圖譜(對(duì)應(yīng)5br-afa)。
[0056]
圖7為實(shí)施例3中l(wèi)c/ms檢測(cè)圖譜中5br-afa(4.095min)紫外吸收峰所對(duì)應(yīng)蜂的全波長(zhǎng)掃描圖譜。
[0057]
圖8為實(shí)施例3中l(wèi)c/ms檢測(cè)圖譜中5,5
‘
br-afa(4.406min)紫外吸收峰所對(duì)應(yīng)蜂的全波長(zhǎng)掃描圖譜。
[0058]
圖9為實(shí)施例4中所得產(chǎn)物的lc/ms檢測(cè)圖譜，其中a為產(chǎn)物在316nm處的紫外吸收?qǐng)D譜；其中，4.132min和4.423min處的蜂分別對(duì)應(yīng)7cl-afa和7,7’cl-afa；b為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為358(m-1)的離子圖譜(對(duì)應(yīng)7cl-afa)；c為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為392(m-1)的離子圖譜(對(duì)應(yīng)7,7’cl-afa)。
[0059]
圖10為實(shí)施例4中l(wèi)c/ms檢測(cè)圖譜中7cl-afa(4.132min)紫外吸收峰所對(duì)應(yīng)蜂的全波長(zhǎng)掃描圖譜。
[0060]
圖11為實(shí)施例4中l(wèi)c/ms檢測(cè)圖譜中7,7’cl-afa(4.423min)紫外吸收峰所對(duì)應(yīng)蜂的全波長(zhǎng)掃描圖譜。
具體實(shí)施方式
[0061]
下面通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。
[0062]
以下實(shí)施例中，若無(wú)特殊說明，所有的試劑及耗材均購(gòu)自本領(lǐng)域常規(guī)試劑廠商；若無(wú)特殊說明，所用的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)手段均為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和手段。
[0063]
本發(fā)明中涉及的重組質(zhì)粒pcdfduet-1_vioaviobrebprebc的制備方法為本領(lǐng)域常
規(guī)技術(shù)手段，例如可參照cn112980864a中的實(shí)施例1的方法。
[0064]
本發(fā)明所涉及的原料化合物：4f-l-trp、5f-l-trp、5br-l-trp和7cl-l-trp購(gòu)自蘇州愛瑪特生物科技有限公司。
[0065]
實(shí)施例1
[0066]
將重組質(zhì)粒pcdfduet-1_vioaviobrebprebc轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)，挑取單克隆接種至含10ml lb培養(yǎng)基的試管中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)。待菌液od600增長(zhǎng)至0.6-0.8時(shí)，4℃，6000rpm離心取菌泥，加入m9(葡萄—礦物鹽)培養(yǎng)基懸浮菌泥，得菌液，并加入0.4mm iptg誘導(dǎo)酶蛋白表達(dá)，同時(shí)加入4mm4f-l-trp，溫度降至20℃，振蕩培養(yǎng)42h。
[0067]
發(fā)酵結(jié)束后，金屬浴85℃加熱15min，然后冷卻至室溫(25℃)加入1倍體積的乙酸乙酯充分混勻進(jìn)行萃取，37℃，200rpm，30min后離心收集有機(jī)相上清，并重復(fù)一次。將收集到的有機(jī)相上清合并后，在40℃蒸干，加入50μldmso溶解后進(jìn)行l(wèi)c/ms檢測(cè)。
[0068]
所述大腸桿菌中afa衍生物的合成路徑如式ⅰ所示：
[0069][0070]
lc/ms檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，其中a為產(chǎn)物在316nm處的紫外吸收?qǐng)D譜；其中，3.196min和3.310min處的蜂分別對(duì)應(yīng)4,4’f-afa和4f-afa(全波長(zhǎng)掃描圖譜見圖2)；b為產(chǎn)
物中m/z為342(m-1)的離子圖譜，對(duì)應(yīng)4f-afa；c為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為360(m-1)的離子圖譜，對(duì)應(yīng)4,4’f-afa。
[0071]
上述結(jié)果證實(shí)了本實(shí)施例成功合成了2種afa衍生物：4f-afa和4,4’f-afa，各衍生物可以相互分離，且不受afa等其他物質(zhì)干擾。
[0072]
實(shí)施例2
[0073]
將重組質(zhì)粒pcdfduet-1_vioaviobrebprebc轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)，挑取單克隆接種至含10ml lb培養(yǎng)基的試管中，37℃，300rpm振蕩培養(yǎng)。待菌液od600增長(zhǎng)至0.6-0.8時(shí)，4℃，8000rpm離心取菌泥，加入m9(葡萄—礦物鹽)培養(yǎng)基懸浮菌泥，得菌液，并加入0.4mm iptg誘導(dǎo)酶蛋白表達(dá)，同時(shí)加入3.5mm 5f-l-trp，溫度降至22℃，振蕩培養(yǎng)40h。
[0074]
發(fā)酵結(jié)束后，金屬浴90℃加熱10min，然后冷卻至室溫加入2倍體積的乙酸乙酯充分混勻進(jìn)行萃取，37℃，200rpm，30min后離心收集有機(jī)相上清，并重復(fù)一次。將收集到的有機(jī)相上清合并后，在40℃蒸干，加入50μl dmso溶解后進(jìn)行l(wèi)c/ms檢測(cè)。
[0075]
所述大腸桿菌中afa衍生物的合成路徑如式ⅱ所示：
[0076][0077]
lc/ms檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，其中a為產(chǎn)物在316nm處的紫外吸收?qǐng)D譜；其中，3.791min和3.893min處的蜂分別對(duì)應(yīng)5f-afa(全波長(zhǎng)掃描圖譜見圖4)和5,5’f-afa(全波長(zhǎng)掃描圖譜見圖5)；b為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為342(m-1)的離子圖譜，對(duì)應(yīng)5f-afa；c為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為360(m-1)的離子圖譜，對(duì)應(yīng)5,5’f-afa。
[0078]
上述結(jié)果證實(shí)了本實(shí)施例成功合成了2種afa衍生物：5f-afa和5,5’f-afa，各衍生物可以相互分離，且不受afa等其他物質(zhì)干擾。
[0079]
實(shí)施例3
[0080]
將重組質(zhì)粒pcdfduet-1_vioaviobrebprebc轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)，挑取單克隆接種至含10ml lb培養(yǎng)基的試管中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)。待菌液od600增長(zhǎng)至0.6-0.8時(shí)，
4℃，6000rpm離心取菌泥，加入m9(葡萄—礦物鹽)培養(yǎng)基懸浮菌泥，得菌液，并加入0.4mm iptg誘導(dǎo)酶蛋白表達(dá)，同時(shí)加入5mm5br-l-trp，溫度降至18℃，振蕩培養(yǎng)48h。
[0081]
發(fā)酵結(jié)束后，金屬浴80℃加熱20min，然后冷卻至室溫加入1.2倍體積的乙酸乙酯充分混勻進(jìn)行萃取，37℃，200rpm，30min后離心收集有機(jī)相上清，并重復(fù)一次。將收集到的有機(jī)相上清合并后，在40℃蒸干，加入50μl dmso溶解后進(jìn)行l(wèi)c/ms檢測(cè)。
[0082]
所述大腸桿菌中afa衍生物的合成路徑如式ⅲ所示：
[0083][0084]
lc/ms檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，其中a為產(chǎn)物在316nm處的紫外吸收?qǐng)D譜；其中，4.095min和4.406min處的蜂分別對(duì)應(yīng)5br-afa(全波長(zhǎng)掃描結(jié)果見圖7)和5,5
‘
br-afa(全波長(zhǎng)掃描結(jié)果見圖8)；b為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為404(m-1)的離子圖譜，對(duì)應(yīng)5br-afa。
[0085]
上述結(jié)果證實(shí)了本實(shí)施例成功合成了2種afa衍生物：5br-afa和5,5
‘
br-afa，各衍生物可以相互分離，且不受afa等其他物質(zhì)干擾。
[0086]
實(shí)施例4
[0087]
將重組質(zhì)粒pcdfduet-1_vioaviobrebprebc轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)，挑取單克隆接種至含10ml lb培養(yǎng)基的試管中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)。待菌液od600增長(zhǎng)至0.6-0.8時(shí)，4℃，7000rpm離心取菌泥，加入m9(葡萄—礦物鹽)培養(yǎng)基懸浮菌泥，得菌液，并加入0.4mm iptg誘導(dǎo)酶蛋白表達(dá)，同時(shí)加入3mm7cl-l-trp，溫度降至22℃，振蕩培養(yǎng)42h。
[0088]
發(fā)酵結(jié)束后，金屬浴88℃加熱12min，然后冷卻至室溫加入1倍體積的乙酸乙酯充分混勻進(jìn)行萃取，37℃，200rpm，30min后離心收集有機(jī)相上清，并重復(fù)一次。將收集到的有機(jī)相上清合并后，在40℃蒸干，加入50μl dmso溶解后進(jìn)行l(wèi)c/ms檢測(cè)。
[0089]
所述大腸桿菌中afa衍生物的合成路徑如式ⅳ所示：
[0090][0091]
lc/ms檢測(cè)結(jié)果如圖9所示，其中a為產(chǎn)物在316nm處的紫外吸收?qǐng)D譜；其中，4.132min和4.423min處的蜂分別對(duì)應(yīng)7cl-afa(全波長(zhǎng)掃描結(jié)果見圖10)和7,7’cl-afa(全
波長(zhǎng)掃描結(jié)果見圖11)；b為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為358(m-1)的離子圖譜，對(duì)應(yīng)7cl-afa；c為產(chǎn)物中質(zhì)荷比(m/z)為392(m-1)的離子圖譜，對(duì)應(yīng)7,7’cl-afa。
[0092]
上述結(jié)果證實(shí)了本實(shí)施例成功合成了2種afa衍生物：7cl-afa和7,7’cl-afa，各衍生物可以相互分離，且不受afa等其他物質(zhì)干擾。
[0093]
測(cè)試?yán)?br/>[0094]
分別對(duì)上述實(shí)施例中合成的afa衍生物進(jìn)行激酶抑制活性測(cè)試，同時(shí)將afa一并測(cè)試，進(jìn)行對(duì)比。該測(cè)試委托由上海潤(rùn)諾生物科技有限公司進(jìn)行，利用mobility shift assay的方法，分別測(cè)試待測(cè)化合物對(duì)于不同種激酶的抑制率，待測(cè)化合物的測(cè)試濃度為1000nm，單濃度，復(fù)孔檢測(cè)。結(jié)果見表1(抑制率為50％以上則認(rèn)為該化合物對(duì)于該激酶有抑制活性，
“?”
表示低于50％，無(wú)抑制活性)。
[0095]
表1
[0096][0097]
結(jié)果顯示，雖然各待測(cè)化合物結(jié)構(gòu)比較接近，但其在激酶的抑制方面差異顯著。其中，afa對(duì)alk5、flt3itd、pim1和pim3這4種激酶有抑制活性，對(duì)表中其他激酶無(wú)抑制活性；4f-afa對(duì)flt3itd、pim1、pim3、map4k3、irak4、pak1這6種激酶具有抑制活性；7cl-afa對(duì)flt3itd和pim1這兩種激酶有抑制活性；7,7’cl-afa對(duì)cdk7/cych/mat1和pim1這兩種激酶有抑制活性；5br-afa對(duì)flt3itd和pim1這兩種激酶有抑制活性；5f-afa對(duì)flt3itd、pim1和pim3這3種激酶具有抑制活性；5,5'f-afa僅對(duì)flt3itd有抑制活性。
[0098]
分析以上結(jié)果可知：(1)afa衍生物4f-afa具有抑制map4k3、irak4、pak1的活性，其衍生物7cl-afa具有抑制cdk7/cych/mat1的活性，這些活性都是afa不具備的，此結(jié)果令人驚喜。
[0099]
(2)7,7’cl-afa與5br-afa僅有兩個(gè)激酶靶點(diǎn)，因此在特異性、毒性方面相較于afa(4個(gè)激酶靶點(diǎn))具有顯著優(yōu)勢(shì)。特別地，5,5'f-afa僅對(duì)flt3itd有抑制活性，可用作flt3itd的特異性抑制劑，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0100]
申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的一種afa衍生物的制備方法及其應(yīng)用，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實(shí)施例才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
[0101]
以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0102]
另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。
技術(shù)特征：
1.一種afa衍生物的制備方法，其特征在于，所述afa衍生物的結(jié)構(gòu)為所述r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8各自獨(dú)立地選自h、ch3、oh、och3、f、cl、br、nh2、cn或no2中的任意一種，且其中至少一種不為h；所述制備方法包括：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到重組大腸桿菌，活化后，將菌株、培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑與原料化合物混合，誘導(dǎo)培養(yǎng)，得發(fā)酵液，萃取，即得所述afa衍生物；所述重組質(zhì)粒攜帶編碼l-氨酸氧化酶vioa、cpa合成酶viob、單加氧酶rebp和單加氧酶rebc的核苷酸序列；所述原料化合物的結(jié)構(gòu)為所述r9、r
10
、r
11
和r
12
各自獨(dú)立地選自h、ch3、oh、och3、f、cl、br、nh2、cn或no2中的任意一種，且其中至少一種不為h。2.如權(quán)利要求1所述的afa衍生物的制備方法，其特征在于，所述afa衍生物選自4f-afa、4,4'f-afa、5f-afa、5,5'f-afa、5br-afa、5,5’br-afa、7cl-afa或7,7’cl-afa中的任意一種，分別依次對(duì)應(yīng)如下結(jié)構(gòu)：一種，分別依次對(duì)應(yīng)如下結(jié)構(gòu)：
所述原料化合物具有任意一種如下結(jié)構(gòu)：3.如權(quán)利要求1或2所述的afa衍生物的制備方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒包括petduet系列、pacycduet系列、prsfduet系列、pcoladuet或pcdfduet系列表達(dá)載體中的任意一種；優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒包括pcdfduet-1_vioaviobrebprebc；優(yōu)選地，所述大腸桿菌包括大腸桿菌bl21(de3)。4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的afa衍生物的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括m9培養(yǎng)基；優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)劑包括iptg；優(yōu)選地，所述iptg的加入量為0.3-0.5mm；優(yōu)選地，所述原料化合物的加入量為3-5mm。5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的afa衍生物的制備方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為15-25℃，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為36-48h。6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的afa衍生物的制備方法，其特征在于，所述活化包括：將重組大腸桿菌接種至lb培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述活化培養(yǎng)的溫度為33-40℃。7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的afa衍生物的制備方法，其特征在于，所述萃取中使用的萃取試劑包括乙酸乙酯；優(yōu)選地，所述萃取在15-40℃下進(jìn)行；優(yōu)選地，所述萃取前還包括對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行加熱，所述加熱的溫度為80-90℃，所述加熱的時(shí)間為10-20min。8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的afa衍生物的制備方法或由所述制備方法得到的afa衍生物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。9.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的afa衍生物的制備方法或由所述制備方法得到的afa衍生物在制備激酶抑制劑中的應(yīng)用。10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激酶抑制劑包括flt3itd抑制劑、pim1抑制劑、pim3抑制劑、map4k3抑制劑、irak4抑制劑、pak1抑制劑或cdk7/cych/mat1抑制劑中的任意一種或至少兩種的組合；優(yōu)選地，當(dāng)所述afa衍生物為4f-afa時(shí)，所述激酶抑制劑為flt3itd抑制劑、pim1抑制劑、pim3抑制劑、map4k3抑制劑、irak4抑制劑或pak1抑制劑中的任意一種或至少兩種的組合；優(yōu)選地，當(dāng)所述afa衍生物為7cl-afa時(shí)，所述激酶抑制劑為flt3itd抑制劑和/或pim1抑制劑；優(yōu)選地，當(dāng)所述afa衍生物為5br-afa時(shí)，所述激酶抑制劑為flt3itd抑制劑和/或pim1抑制劑；
優(yōu)選地，當(dāng)所述afa衍生物為7,7’cl-afa時(shí)，所述激酶抑制劑為cdk7/cych/mat1抑制劑和/或pim1抑制劑；優(yōu)選地，當(dāng)所述afa衍生物為5f-afa時(shí)，所述激酶抑制劑為flt3itd抑制劑、pim1抑制劑或pim3抑制劑中的任意一種或至少兩種的組合；優(yōu)選地，當(dāng)所述afa衍生物為5,5'f-afa時(shí)，所述激酶抑制劑為flt3itd抑制劑。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種AFA衍生物的制備方法及其應(yīng)用，所述制備方法包括：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到重組大腸桿菌，活化后，將菌株、培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑與原料化合物混合，誘導(dǎo)培養(yǎng)，得發(fā)酵液，萃取，即得所述AFA衍生物；所述重組質(zhì)粒攜帶編碼L-氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、單加氧酶RebP和單加氧酶RebC的核苷酸序列。本發(fā)明首次提供了一種快速、方便、低成本合成AFA的衍生物的方法，對(duì)于新型、特異性好、毒性小的抗癌藥物的篩選和研發(fā)而言具有重要的意義?？拱┧幬锏暮Y選和研發(fā)而言具有重要的意義?？拱┧幬锏暮Y選和研發(fā)而言具有重要的意義。
