一種培育栽培煙草單倍體誘導系的方法與流程
1.本發明涉及一種培育栽培煙草單倍體誘導系的方法，屬于植物基因工程領域。
背景技術：
2.煙草是我國重要的經濟作物之一，隨著經濟的發展及環境的變化，煙農對培育高品質、安全性好、抗逆性強的煙草品種有了更迫切的需求，栽培煙草的常規雜交選育至少要經歷6代以上的篩選和穩定過程，存在育種周期長，且工作量巨大的問題。以單倍體誘導系雜交誘導為基礎的單倍體育種方法僅需兩個世代即可迅速獲得純系，極大地縮短了育種進程，是重要的現代育種技術之一。
3.野生煙草n.africana具有誘導煙草產生單倍體的功能，但存在誘導率低，易形成混倍體、易攜帶野生煙草不良氣息、遠緣雜交不親和等問題，急需獲得新的栽培煙草來源的單倍體誘導系。目前，在玉米、擬南芥等植物中相繼報道了單倍體誘導基因或誘導系，栽培煙草為異源四倍體，基因家族內通常存在基因功能冗余現象，很多性狀都是由兩個以上基因共同發揮作用，這為功能基因的研究和利用帶來諸多困難。目前，對于栽培煙草來源的單倍體誘導系和誘導相關基因尚未見報道。
技術實現要素：
4.基于上述，本發明提供一種培育栽培煙草單倍體誘導系的方法，可以短時間內獲得純系煙草，加快煙草新品種選育進程，以克服現有技術的不足。
5.本發明的技術方案是：一種培育栽培煙草單倍體誘導系的方法，包括：
6.用基因編輯系統編輯目的栽培煙草，獲得ntdmp1基因、ntdmp2基因和ntdmp3基因同時編輯失活的純合株系即為栽培煙草單倍體誘導系；
7.所述ntdmp1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述ntdmp2基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述ntdmp3基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
8.可選的，所述基因編輯系統中含有sgrna序列，所述sgrna在目的栽培煙草中識別的靶標dna為編碼ntdmp1蛋白的dna片段、編碼ntdmp2蛋白的dna片段和編碼ntdmp3蛋白的dna片段。
9.可選的，所述sgrna識別的靶位點的核苷酸序列如seq id no.4所示。
10.可選的，所述用基因編輯系統編輯目的栽培煙草的方法包括：
11.1)將所述sgrna連接到載體上得到重組crispr/cas9載體；
12.2)將所述重組crispr/cas9載體轉入到栽培煙草k326中。
13.本發明還提供一種培育栽培煙草單倍體的方法，為將所述方法培育的栽培煙草單倍體誘導系作為父本，目的栽培煙草作為母本進行雜交，獲得栽培煙草單倍體。
14.本發明的有益效果是：
15.1、通過分析ntdmp1，ntdmp2和ntdmp3序列，設計同時靶向ntdmp1，ntdmp2和ntdmp3三個基因的sgrna，構建編輯失活載體，對栽培煙草進行遺傳轉化，獲得ntdmp1，ntdmp2和
ntdmp3三基因同時編輯失活的純合株系。該株系具有誘導栽培煙草產生單倍體的功能，在煙草育種中具有重要應用價值。
16.2、通過培育煙草單倍體誘導系可以短時間內獲得純系煙草，加快煙草新品種選育進程，有效解決了目前栽培煙草的常規選育存在的育種周期長，且工作量巨大的問題。
17.3、通過對煙草單倍體誘導相關基因進行鑒定，獲得了栽培煙草中具有單倍體誘導功能的基因，對解析栽培煙草的單倍體誘導遺傳機理具有重要的意義。
18.4、本發明證明了16個煙草dmp家族基因中的3個成員同時發生突變可誘導栽培煙草產生單倍體，首次提供了一種創制栽培煙草單倍體誘導系的新方法。
附圖說明
19.圖1流式細胞法分析雜交后代的倍性；
20.圖2雜交后代中單倍體和四倍體的染體數目分析。
具體實施方式
21.為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖對本發明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本發明。但是本發明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。
22.下述實施例選擇表1中靶點進行實驗，靶點位置、靶點序列依序見表1中第3列和第4列，對應的靶基因見表1中第1列。
23.表1靶標位點的位置和序列
[0024][0025]
ntdmp1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，ntdmp2基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，ntdmp3基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0026]
seq id no.1：
[0027]
atggagcaaagtactgagggaattgggatcaaaatttacagtgcatcaaaacgtgccgatacatcaatgtaccctactaatttaccaccagacaacgatgttccgatccccgaattgcctcaaccagcaattggtggcaagaaaagacgagcaatggcaaatggggttcaaaaaacactctcaaaaacttcattgcttgtcaatttcttgccaacaggcacacttttaacttttgaaatggtccttccatcagtctatggcaaaggcgattgttcccctgtcactacactaatgattttaacactacttggcctttgtactttgtcttgcttcttcttccattttaccgatagttttcggggacccgacgggaaagtttactatggatttgtgacaccaagaggattgaaagttttcaagtccggactaggtgtggatgtgccaaaagatgagaggtaatatgtgtgatcaaacatatatgacagacagatcgcctctcacaattttgtgatagtttttatgacgaaattcatccatgtggattgatacttttgacggaatatatatcaccagaccgatcgtctgtcacaattttgtgacattttttatgttcatccatttggattgatattttttgacggaataaatatgacaaacagatcgtctgttacaattttgtgacatt
tatgatggaattcatccatgtggattgatagttttgacggaatatacatgacggacagatcgtctgtcacaattttgtgacaatttttatgtcagaattcatccatgtggattgatatatgtgaagattttattcttttgtcacaagcattatttttcttgtagtacgttgatttcacacttcaaagccgttatttcatgttttaatttattgtttactttttctaataggtacgtagtgggatttacggatttcgtgcatgcgatgatgtctgttttggtatttgtggcgattgctttttcggatcatagagtgacgctttgtctattccctggacatgcaaaagaacttgatgaaattatgaggagttttcctttaatggtgggagttatttgcagtggactttttcttgtttttcccaatactagatatggtattggatgtatgtctgcttaa
[0028]
seq id no.2：
[0029]
atggagcaaagtactgagggaattgggatcaaaatctacagtgcatcaaaacgtgcagatacaacaatataccctactaatttaccaccagataacgatgttccgatccctgaattgcctcaaccagcaattggtggcaaaaaaagaagagcaatggctaatggggttcaaaaaactctctcaaaaacttcattgcttgtcaattttctaccaacaggcacacttctaacttttgaaatggtccttccatcagtctatggcaaaggcgattgttcaccggtcactacattaatgattttaacactacttggcctttgtactttgtcttgcttcttcttccattttaccgatagttttcgtggacccgatgggaaagtttactatggatttgtgacaccaagagggttgaaagttttcaagtctggactaggtgtggatgtgccaaaagatgagaggtaatatttgtgacggaatagatatgatagacagatcgtctgtcacagttttgtaacagttttatggcagaattcatccatgtgggttgatatttgtgacgattttattctttcgtcacgaacattatttttcttgtagtaagttgattttacacttcaaagccgttatttcatgttttaatctattgtttactttttctaacaggtacgtcgtgggatttacggatttcgtacatgcaatgatgtctgttttggtatttgtggcgattgcattttcggatcatagagtgacgctttgtctattccctggacatgcaaaagaacttgatgaaattatgaggagttttcctttaatggtgggagttatttgcagtggactttttcttgttttccccaatactagatatggtattggatgtatgtctgcttaa
[0030]
seq id no.3：
[0031]
atggagcaaagtactgagggaattgggatcaaaatctacagtgcatcaaaacgtgcagatacatcaatataccctactaatttaccaccagataacgatgttccgatccctgaattgcctcaaccagcaattggtggcaaaaaaagaagagcaatggcaaatgggattcaaaaaactctctcaaaaacttcattgcttgtcaattttctaccaacaggcacacttctaacttttgaaatggtccttccatcagtctatggcaaaggcgattgttcacccgtcactacattaatgattttaacactacttggcctttgtactttgtcttgcttcttcttccattttaccgatagttttcgtggacccgatgggaaagtttactatggatttgtgacaccaagagggttgaaagttttcaagtctggactaggtgtggatgtgccaaaagataagaggtaatatttgtgacggaatagatatgatagacagatcgcctgtcacagttttgtaatagttttatggntatatactgacaaatcgtctgtcacaatatgtgacagtttttatgacggaattcatccatgtggattgatatttgtgacgattttattctttcgtcacgagcattatttttcttgtagtaagttgttttacacttcaaagccgttatttcatgttttaatctattatttactttttctaacaggtacgtcgtgggatttaccgatttcgtacatgcaatgatgtctgttttggtatttgtggcgattgcattttcggatcatagagtgacgctttgtctattccctggacatgcaaaagaacttgatgaaattatgaggagttttcctttaatggtgggagttatttgcagtggactttttcttgtttttcccaatactagatatggtattggatgtatgtctgcttaacdsatggagcaaagtactgagggaattgggatcaaaatctacagtgcatcaaaacgtgcagatacaacaatataccctactaatttaccaccagataacgatgttccgatccctgaattgcctcaaccagcaattggtggcaaaaaaagaagagcaatggctaatggggttcaaaaaactctctcaaaaacttcattgcttgtcaattttctaccaacaggcacacttctaacttttgaaatggtccttccatcagtctatggcaaaggcgattgttcaccggtcactacattaatgattttaacactacttggcctttgtactttgtcttgcttcttcttccattttaccgatagttttcgtggacccgatgggaaagtttactatggatttgtgacaccaagagggttgaaagttttcaagtctggactaggtgtggatgtgccaaaagatgagaggtacgtcgtgggatttacggatttcgtacatgcaatgatgtctgttttggtatttgtggcgattg
cattttcggatcatagagtgacgctttgtctattccctggacatgcaaaagaacttgatgaaattatgaggagttttcctttaatggtgggagttatttgcagtggactttttcttgttttccccaatactagatatggtattggatgtatgtctgcttaa
[0032]
實施例1：栽培煙草單倍體誘導系的獲得
[0033]
1、設計sgrna
[0034]
根據靶位點設計sgrna序列，如seq id no.4所示：
[0035]
seq id no.4：ccttccatcagtctatggcaaag
[0036]
2、重組crispr/cas9載體構建
[0037]
將sgrna通過gateway的方法連接到載體上得到重組載體crispr/cas9。具體方法如下：
[0038]
(1)合成如下1對引物
[0039]
dmp(+):cagtggtctcaagtgctttgccatagactgatgga，如seq id no.5所示。
[0040]
dmp(-):cagtggtctcaaaactccatcagtctatggcaaag，如seq id no.6所示。
[0041]
(2)pcr體系
[0042]
按照以下pcr反應體系進行加樣：
[0043]
成分體積nuclease-free water20μlbiorun pfu pcr mix25μlprimer(+)(100μm)2μlprimer(-)(100μm)2μltemplate1μltotal volum50μl
[0044]
pcr程序如下：
[0045]
步驟循環數94℃for 5min194℃for 30sec3050℃for 45sec3072℃for 54sec3072℃for 10min116℃for 30min1
[0046]
用1％瓊脂糖凝膠電泳，5v/cm電壓，20分鐘，將dmp(893bp)的電泳片段在紫外燈下切取出來，放在一個體系中進行溶膠回收，用總體積30ul的水溶解回收dna(回收產物標記為：rdnad1)，檢測無誤后與載體進行連接。
[0047]
(3)酶切連接
[0048]
酶切連接體系
[0049]
成分體積nuclease-free water8μl10
×
buffer2μl
bsai/eco31i1μlt4_ligase1μlphsbdcas9i4μlrdnad14μltotal20μl
[0050]
酶切連接反應條件
[0051]
步驟循環數37℃for 20min137℃for 10min520℃for 10min537℃for 20min180℃for 5min1
[0052]
(4)轉化
[0053]
將5-10ul連接產物轉化大腸桿菌感受態，涂卡那霉素抗性平皿，37℃培養12小時，進行菌斑pcr鑒定。
[0054]
(5)菌斑pcr鑒定
[0055]
挑取10個菌斑同時進行1.5mlep管接菌和pcr鑒定，引物：phsbdcas9i鑒定引物pbw-f：ccagaaattgaacgccgaag，pbw-r：gtaaaacgacggccagt，分別如seq id no.7和seq id no.8所示。pcr反應體系和反應程序同(2)。目標條帶為1667bp左右的片段。選1-3個陽性條帶對應的菌液，取100ul送樣測序，其余400ul菌液接種到含有5-10ml卡那霉素抗性lb中，試管搖菌，待測序結果出來后，對應測序正確的取一管提取質粒。
[0056]
3、轉基因植株的獲得
[0057]
將步驟2獲得的重組crispr/cas9載體通過熱激轉至農桿菌感受態gv3101，通過pcr驗證獲得陽性克隆。通過煙草遺傳轉化實驗將重組crispr/cas9載體轉入栽培煙草k326中，在抗性培養基上長出的抗性芽轉移到生根培養基中，待根長出后，將培養瓶置于陽光充足處，加入少量的水煉苗2d；煉苗后將小苗取出，洗去根部培養基，轉移至煙草育苗基質中，放入人工氣候室進行培養。
[0058]
4、ntdmp1/ntdmp2/ntdmp3基因突變的轉基因植株鑒定
[0059]
采集步驟3陽性苗的葉片，提取基因組dna作為pcr反映模板采用dmp1-f、dmp1-r、dmp2-f、dmp2-r、dmp3-f和dmp3-r引物進行擴增，測序鑒定突變情況。
[0060]
dmp1-f:tcaaaacgtgccgatacatcaatg，如seq id no.9所示。
[0061]
dmp1-r:cgatctgtctgtcatatatgtttga，如seq id no.10所示。
[0062]
dmp2-f:tcaaaacgtgcagatacaacaata，如seq id no.11所示。
[0063]
dmp2-r:acccacatggatgaattctgc，如seq id no.12所示。
[0064]
dmp3-f:ctacagtgcatcaaaacgtgca，如seq id no.13所示。
[0065]
dmp3-r:cgatctgtctatcatatctattccg，如seq id no.14所示。
[0066]
關于基因突變情況的鑒別方式為：
[0067]
自靶位點序列起具有雙峰特征的序列，則該株系的基因型為雜合基因型(2條同源染體中的1條染體上ntdmp1和/或ntdmp2和/或ntdmp3基因突變，且另一條染體上的
ntdmp1和/或ntdmp2和/或ntdmp3未突變或者突變形式不同)，則該株系為煙草雜合突變型株系。
[0068]
自靶位點序列起具有特異單峰特征的序列，若該序列與栽培煙草序列相同，則該株系為野生型基因型，即ntdmp1/ntdmp2/ntdmp3基因未發生突變。若該序列與普通栽培煙草序列不同，則該株系的基因型為純合突變基因型(兩條同源染體上ntdmp1和ntdmp2和ntdmp3基因均發生突變)，則該株系為煙草純合突變型株系。
[0069]
表2栽培煙草突變體鑒定結果
[0070][0071]
選取栽培煙草純合突變體d3作為父本，常規栽培煙草作為母本雜交，獲得單倍體材料。
[0072]
實施例2：煙草單倍體誘導能力分析。
[0073]
將實施例1中獲得的栽培煙草突變株系d3作為父本，常規栽培煙草k326或f1(云煙87/k326)作為母本進行雜交收種，播種雜交后代，通過以下方法檢測雜交后代中的單倍體。
[0074]
1、流式細胞倍性分析法檢測葉片倍性
[0075]
采集所有后代植株葉片進行流式細胞倍性分析實驗，具體方法如下：
[0076]
提取待測植株幼嫩葉片的細胞核，以二倍體栽培煙草葉片作為對照；再用流式細胞儀器檢測信號，首先檢測二倍體細胞核信號，并將二倍體細胞核信號峰位設為50(由于二倍體細胞內的遺傳物質是單倍體細胞內遺傳物質的兩倍，因此，單倍體細胞核信號峰位在25附近出現)。若待測植株細胞核信號峰出現在200附近，則認為該待測植株為單倍體植株。若待測植株的信號峰出現在400附近，則認為其與二倍體細胞核信號強度富集位置相同，該待測植株為二倍體(圖1)。
[0077]
2、染體制片法鑒定染體數目
[0078]
采集上述步驟1檢測出的候選單倍體植株嫩葉制作染體片，具體方法如下：取栽培煙草生長點周圍幼嫩葉片，浸沒于0.002mol/l的8-羥基喹啉中，在4℃條件下預處理24小時，預處理后用卡諾固定液固定過夜，蒸餾水沖洗2～3次后，放入混合酶液(3％纖維素酶+1％離析酶)中于37℃下孵育0.5～1h。蒸餾水清洗后除去酶液，加入卡諾氏固定液，并以涂片法進行制片，火焰干燥，5％吉姆薩染。經鏡檢觀察染體數目。染體數目為24條的即為單倍體，染體數目為48條的即為二倍體栽培煙草，如圖2。
[0079]
統計上述鑒定結果并按照如下公式計算誘導率：誘導率(％)＝(單倍體株數/總株
數)
×
100。可以看出ntdmp1/ntdmp2/ntdmp3基因同時突變后，在雜交后代中可以獲得單倍體，誘導率在2.5％左右。可見本發明獲得的ntdmp1，ntdmp2和ntdmp3三基因同時編輯失活的純合株系，具有誘導栽培煙草在短時間內產生單倍體的功能，可加快煙草新品種選育進程，有效解決了目前栽培煙草常規育中存在的育種周期長，且工作量巨大的問題。
[0080]
表3誘導率統計結果
[0081][0082]
以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
技術特征：
1.一種培育栽培煙草單倍體誘導系的方法，其特征在于，包括：用基因編輯系統編輯目的栽培煙草，獲得ntdmp1基因、ntdmp2基因和ntdmp3基因同時編輯失活的純合株系即為栽培煙草單倍體誘導系；所述ntdmp1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述ntdmp2基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述ntdmp3基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。2.根據權利要求1所述的培育栽培煙草單倍體誘導系的方法，其特征在于，所述基因編輯系統中含有sgrna序列，所述sgrna在目的栽培煙草中識別的靶標dna為編碼ntdmp1蛋白的dna片段、編碼ntdmp2蛋白的dna片段和編碼ntdmp3蛋白的dna片段。3.根據權利要求2所述的培育栽培煙草單倍體誘導系的方法，其特征在于，所述sgrna識別的靶位點的核苷酸序列如seq id no.4所示。4.根據權利要求1所述的培育栽培煙草單倍體誘導系的方法，其特征在于，所述用基因編輯系統編輯目的栽培煙草的方法包括：1)將所述sgrna連接到載體上得到重組crispr/cas9載體；2)將所述重組crispr/cas9載體轉入到栽培煙草中。5.一種培育栽培煙草單倍體的方法，為將權利要求1至4任一所述方法培育的栽培煙草單倍體誘導系作為父本，目的栽培煙草作為母本進行雜交，獲得栽培煙草單倍體。
技術總結
本發明公開了一種培育栽培煙草單倍體誘導系的方法，包括：用基因編輯系統編輯目的栽培煙草，獲得tDMP1基因、tDMP2基因和tDMP3基因同時編輯失活的純合株系即為栽培煙草單倍體誘導系；所述tDMP1基因的核苷酸序列如SEQ ID O.1所示，所述tDMP2基因的核苷酸序列如SEQ ID O.2所示，所述tDMP3基因的核苷酸序列如SEQ ID O.3所示。本發明通過培育煙草單倍體誘導系可以短時間內獲得純系煙草，加快煙草新品種選育進程，有效解決目前栽培煙草常規育中存在的育種周期長，且工作量巨大的問題。題。題。
