一種用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架及其制備方法和應用
1.本發明屬于生物材料技術領域，具體涉及一種用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架及其制備方法和應用。
背景技術：
2.關節軟骨缺損是全球導致殘疾的主要原因之一。據統計，全球大概有3.55億人患有關節疾病，60歲以上人的患病率更是高達50％。國內的發病率也逐年增高，并呈年輕化趨勢，給家庭和個人造成了巨大的痛苦和經濟負擔。關節軟骨是一種缺乏血管、淋巴和神經的高度分化的致密結締組織，一旦損傷就很難自身修復。目前臨床常用方法有：
①
外科常規療法，主要適用于初期的關節軟骨損傷。
②
微骨折法，通過在關節軟骨缺損下的骨組織上鉆孔釋放骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells，bmscs)進行修復，修復后生成纖維軟骨而非天然軟骨，其耐磨性差。
③
手術移植法，雖是軟骨損傷的有效途徑，但限于自體骨源及異體骨的免疫排斥，難以大面積推廣。綜上所述，現有的方法存在諸多弊端，無法實現軟骨缺損的有效。
3.軟骨組織工程的發展為軟骨缺損提供了新的途徑。軟骨組織自上而下由透明軟骨層、鈣化軟骨層及軟骨下骨層構成，在透明軟骨層與鈣化層交界處有一潮線結構，其主要作用是將相對較軟的關節軟骨組織與相對堅硬的鈣化軟骨連接在一起，在鈣化軟骨層的下方是軟骨下骨平臺，兩層之間交錯結合錨定，交界處形成的結構又被稱作水泥線。關節軟骨和軟骨下骨共同組成了一個既相互依存又互相作用、既獨立又統一的復合功能單元。全層軟骨損傷時，由于特殊的解剖關系往往合并軟骨下骨的損傷，因此軟骨修復常常以骨和軟骨缺損的共同修復為主。當前軟骨組織工程主要圍繞結構、功能及損傷修復之間的關系開展研究，通過結構仿生及理論模擬來揭示三者之間的相互作用關系。
4.隨著軟骨組織工程的發展，本領域的研究人員已經研發出多種的骨-軟骨修復凝膠支架，例如，發明專利cn111773435b公開了一種用于關節軟骨修復的雙交聯一體化無縫復合水凝膠支架，其在凝膠支架中間添加了聚電解質復合水凝膠膜層，實現了對軟骨和軟骨下骨微環境的隔離效應；發明專利cn111419479b公開了一種用于髖關節軟骨修復的復合支架及其制備方法，復合支架遇到體內組織微環境的體液后，支架中的多孔鎂成分氧化產生氫氣，產生的氣體受表面陶瓷膜的限制無法立即擴散，在局部形成氣膜，形成穩定的隔離層，將成骨微環境與軟骨微環境隔離開來，防止下方的成骨微環境中細胞、細胞因子進入軟骨微環境，阻止軟骨骨化發生，有效保持了軟骨微環境的穩定，適用于大面積軟骨修復，修復面積直徑大于1厘米。發明專利cn108478871b公開了一體化骨-軟骨修復支架及其制備方法，其中的修復支架能阻止血管侵入軟骨層，提高骨層與軟骨層之間連接的緊密性與穩定性，實現二者的生物結合，達到良好的修復效果。但是，上述制備的支架，還是無法最大程度的達到仿生的效果。
5.針對現有技術的不足，本發明提供了一種用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支
架，由下至上依次為軟骨下骨層、鈣化界面層和軟骨層；各層的結構顯著區別開。
技術實現要素：
6.本發明的首要目的在于為改善骨軟骨缺損后修復困難，手段單一且愈合效果不佳等問題，創造性地發明了一種基于3d打印技術快速、批量化、規模化、個性化制作促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架。
7.為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：一種用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架，由下至上依次為軟骨下骨層、鈣化界面層和軟骨層；
8.所述的軟骨下骨層為含有核酸適配體和羥基磷灰石的水凝膠；
9.所述的鈣化界面層為水凝膠；
10.所述的軟骨層為含有生化因子的水凝膠；
11.所述的水凝膠由海藻酸鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨和n'n-亞甲基雙丙烯酰胺制備得到。
12.優選的，所述的羥基磷灰石為接枝雙鍵的羥基磷灰石纖維，終濃度為30％～80％；其中羥基磷灰石纖維接枝雙鍵的過程如下：
13.(1)配制體積比為9：1的乙醇溶液，并用醋酸緩沖液調節ph至4.0備用；
14.(2)在步驟(1)所得溶液中加入體積分數為5％的硅烷偶聯劑kh570，室溫下降解30min；
15.(3)在步驟(2)所得溶液中加入質量分數為40％的羥基磷灰石纖維，超聲分散10min；
16.(4)步驟(3)所得的溶液在65℃水浴攪拌2h后，用步驟(1)所得溶液洗滌后烘箱干燥過夜。
17.優選的，所述的接枝雙鍵的羥基磷灰石纖維的終濃度為40％～70％
18.優選的，所述的生化因子為sdf-1、pdgf、mcp-1、il-8、mip、tgf-β超家族、igf、vegf、fgf、hgf、egf、prp、epo、功能性多肽、外泌體中的一種或幾種，所述的生化因子載入到緩釋微球中。
19.優選的，所述的核酸適配體為核酸適配體hm69或核酸適配體apt19s。
20.優選的，所述的海藻酸鈉和丙烯酰胺的比例為1～10：2～20溶解，海藻酸鈉終濃度為1.5％～15％，所述的過硫酸銨終濃度為0.4～4.0wt％，所述的n'n-亞甲基雙丙烯酰胺濃度為丙烯酰胺的6～60
‰
。
21.本發明的第二目的在于提供所述的復合水凝膠支架的制備方法，包括如下步驟：
22.(1)制備軟骨下骨層水凝膠：將海藻酸鈉和丙烯酰胺按照比例溶解于去離子水中；加入過硫酸銨和n'n-亞甲基雙丙烯酰胺，避光攪拌；再加入接枝雙鍵的羥基磷灰石纖維，避光攪拌過夜；
23.(2)制備鈣化界面層水凝膠：將海藻酸鈉和丙烯酰胺按照比例溶解于去離子水中；加入過硫酸銨和n'n-亞甲基雙丙烯酰胺，避光攪拌；
24.(3)制備軟骨層水凝膠：將海藻酸鈉和丙烯酰胺按照比例溶解于去離子水中；加入過硫酸銨和n'n-亞甲基雙丙烯酰胺，避光攪拌；再加入載生化因子緩釋微球，避光攪拌；
25.(4)制備復合水凝膠支架：將步驟(1)、(2)和(3)制備得到的水凝膠按照順序分別
裝入3個3d打印料筒中，3d打印機按照預定參數打印；
26.(5)步驟(4)得到的復合水凝膠支架置于波長范圍在10～380nm的uv燈下光照10～100min；浸泡于濃度為2～20mg/ml鈣離子溶液中，過夜，即得。
27.優選的，步驟(4)所述的打印過程中使用電子噴霧裝置進行初級網絡交聯。
28.優選的，步驟(4)所述的3d打印機為擠壓式3d打印機。
29.本發明的第三目的在于提供所述的復合水凝膠支架在制備骨-軟骨修復材料中的應用。
30.本發明具有以下有益效果：(1)本發明采用3d打印技術制作分層、梯度、功能化仿生軟骨水凝膠，具有經濟高效、操作簡單、模式靈活、個性化等優點。(2)所制備的復合水凝膠支架的雙網絡結構由海藻酸鈉和丙烯酰胺共同提供，丙烯酰胺提供初級網絡支撐結構，海藻酸鈉為功能化的修飾提供附著及終網絡支撐結構，雙鍵修飾羥基磷灰石纖維用以增加材料的物理性能及促進干細胞分化，核酸適配體用以募集干細胞，微球包裹的生化因子用以促進干細胞的分化、為干細胞遷移提供方向，它們共同作用以促進骨軟骨缺損原位誘導再生。(3)本發明所述的復合水凝膠支架改善了骨軟骨修復材料愈合性差，異源干細胞應用導致的免疫排斥反應等問題，具有良好的生物相容性，能夠有效地促進骨軟骨缺損原位誘導再生。
附圖說明
31.圖13d打印hs69支架照片
32.圖2不同實施例制備的復合水凝膠支架的力學性能分析圖
33.圖3hs69復合水凝膠支架的掃描電鏡圖
34.圖4骨軟骨缺損修復大體表現與micro-ct三維重建圖
35.圖5不同實施例制備的復合水凝膠支架骨軟骨愈合組織化學圖
36.圖6不同實施例制備的復合水凝膠支架骨軟骨愈合免疫熒光組化圖
具體實施方式
37.下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
38.以下實施例中所述的.stl格式是在計算機圖形應用系統中，用于表示三角形網格的一種文件格式。它的文件格式非常簡單，應用很廣泛。stl是最多快速原型系統所應用的標準文件類型。stl是用三角網格來表現3d cad模型。
39.以下實施例中所述的3d studio max，常簡稱為3ds max或max，是discreet公司開發的(后被autodesk公司合并)基于pc系統的三維動畫渲染和制作軟件。其前身是基于dos操作系統的3d studio系列軟件。
40.本發明提供的分層、梯度、功能化仿生軟骨水凝膠，以質量為基準，3d打印墨水里水：海藻酸鈉：丙烯酰胺：接枝雙鍵的羥基磷灰石的比例為：(100～1000):(1～30):(2～60):(30～800)。
41.原位誘導組織再生是利用宿主自身再生修復的潛能，通過對支架的生物物理和生化線索進行功能化設計，以調節細胞外微環境或驅動細胞重編程來誘導組織的再生。原位誘導組織再生的優勢主要體現在：
①
不引入外源細胞，原位捕獲自體細胞；
②
不經過體外培養，誘導自體細胞的增殖和分化；
③
利用支架的微環境，誘導干細胞的分化，實現缺損組織的再生。因此原位誘導組織再生可以解決外源干細胞應用所帶來的上述問題，加之3d打印的技術優勢，可實現軟骨組織快速、低成本、個性化及規模化的制備，為其向臨床應用轉化創造了有利的條件。
42.以下實施例中，使用的核酸適配體為核酸適配體hm69，購自金斯瑞。
43.實施例1：一種用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架(hs69水凝膠)的合成
44.(1)將質量分數為6％的丙烯酰胺(6.0g)、0.4％的過硫酸銨(0.4g)和丙烯酰胺質量6
‰
的n'n-亞甲基雙丙烯酰胺(0.036g)溶解于100ml去離子水中，避光攪拌30分鐘，得到初級水凝膠溶液；
45.(2)在步驟(1)所得溶液中加入質量分數為3％的海藻酸鈉(3.0g)，避光攪拌12小時，得到混合物1；
46.(3)在步驟(2)所得溶液中加入載sdf-1的緩釋微球(10g)，避光攪拌6小時，得到混合物2；
47.(4)將hm69(250nmol)接枝于步驟(2)所得溶液中，避光攪拌12小時，得到混合物3；
48.(5)在步驟(2)所得溶液加入6g接枝雙鍵的羥基磷灰石，避光攪拌12小時，得到混合物4，在步驟(4)所得溶液中加入21g接枝雙鍵的羥基磷灰石，避光攪拌12小時，得到混合物5；
49.(6)將步驟(4)，(5)所得混合物裝入3d打印料筒中，3d打印機進行逐層打印，所述3d打印內容為1個30mm
×
30mm的平板，平板打印內容為6層機械層與引導長軸相互垂直，層內纖維間距為2.5mm，其中步驟混合物5為最底2層，混合物4為中間2層，混合物2為最上2層；
50.(7)打印過程中使用2％氯化鈣溶液對水凝膠網絡進行初級網絡交聯；
51.(8)打印完成后將步驟(7)所得樣品再次置于的波長為285nm的uv燈下光照10分鐘；
52.(9)將步驟(8)制得水凝膠浸泡于2％氯化鈣溶液中，過夜保存。
53.實施例2：一種用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架(hs69水凝膠)的合成
54.該實施例與實施例1相同，不同之處在于：步驟(1)制備的初級水凝膠溶液中丙烯酰胺的濃度為12％，過硫酸銨濃度為2％，n'n-亞甲基雙丙烯酰胺濃度為丙烯酰胺濃度的30
‰
。
55.實施例3：一種用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架(hs69水凝膠)的合成
56.該實施例與實施例1相同，不同之處在于：步驟(2)制備的混合物1中海藻酸鈉的濃度為6％。
57.實施例4：一種用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架的合成
58.該實施例與實施例1相同，不同之處在于：將步驟(3)中載sdf-1的緩釋微球替換為載pdgf的微球(10g)。
59.實施例5：一種用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架的合成
60.該實施例與實施例1相同，不同之處在于：將步驟(4)接枝核酸適配體hm69替換為
核酸適配體apt19s(250nmol)。
61.實施例6：雙網絡水凝膠(dn)的合成
62.該實施例與實施例1相同，不同之處在于：無步驟(3)、(4)、(5)，步驟(6)打印的混合物僅為混合物1。
63.實施例7：含有生化因子的雙網絡水凝膠(s-dn)的合成
64.該實施例與實施例1相同，不同之處在于：無步驟(4)、(5)，步驟(6)打印的混合物為混合物1和混合物2，其中混合物1為底下4層，混合物2為最上2層。
65.實施例8：含核酸適配體的水凝膠(69-dn)的合成
66.該實施例與實施例1相同，不同之處在于：無步驟(3)、(5)，步驟(6)打印的混合物為混合物1和混合物3，其中混合物3為最下2層，混合物1為上面4層。
67.實施例9：含羥基磷灰石的水凝膠(h-dn)的合成
68.該實施例與實施例1相同，不同之處在于：無步驟(3)、(4)，步驟(5)中2種含量的雙鍵接枝的羥基磷灰石均加入步驟(2)所得溶液，得到混合物4和混合物6，步驟(6)打印的混合物是混合物1、混合物4和混合物6，其中混合物6為最下2層，混合物4為中間2層，混合物1為最上2層。
69.實施例10：含羥基磷灰石和核酸適配體的水凝膠(h69-dn)的合成
70.該實施例與實施例1相同，不同之處在于：無步驟(3)，步驟(6)打印的混合物是混合物1、混合物4和混合物5，其中混合物5為最下2層，混合物4為中間2層，混合物1為最上2層。
71.實施例11：含生化因子和羥基磷灰石的水凝膠(hs)的合成
72.該實施例與實施例1相同，不同之處在于：無步驟(4)，步驟(5)中雙鍵接枝的羥基磷灰石僅加入步驟(2)所得溶液，步驟(6)打印的混合物是混合物2、混合物4和混合物6，其中混合物6為最下2層，混合物4為中間2層，混合物2為最上2層。
73.實施例12：含生化因子和核酸適配體的水凝膠(s69)的合成
74.該實施例與實施例1相同，不同之處在于：無步驟(4)，步驟(6)打印的混合物是混合物1、混合物2和混合物3，其中混合物3為最下2層，混合物1為中間2層，混合物2為最上2層。
75.實驗例1：用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架的力學及表征分析
76.本實施例將實施例1、實施例6-11中的hs69，dn，s-dn，69-dn，h-dn，h69-dn，hs，s69作為實施對象，用于以下實驗。
77.(1)實驗方法如下：
78.本實驗通過通用材料測試機以10mm/min的速度，對形狀為長方體，體積大小為80mm
×
25mm
×
1mm的上述實驗組進行了拉伸性能的測試；對形狀為圓柱體，體積大小為π
×
(5mm)2×
10mm的上述實驗組進行了抗壓強度的分析；并通過掃描電鏡對hs69支架進行表征分析其分層結構。
79.(2)實驗結果：
80.如圖1所示3d打印hs69支架照片。從左到右分別為hs69水凝膠支架對應樣品在脫離支撐和彎曲的狀態，最下則為hs69支架的側視圖圖像。
81.如圖2所示hs69水凝膠有著明顯的三層結構，圖2a為hs69水凝膠支架表面孔隙，圖
2e為hs69水凝膠橫截面顯示的3層梯度結構，圖2b、f為hs69水凝膠支架最表面的一層，可見含生長因子的納米球，圖2c、g為hs69水凝膠支架的中間層，可見雙鍵接枝的羥基磷灰石纖維的存在及孔隙的形成，圖2d、h為hs69水凝膠支架的最下層，可見隨著雙鍵接枝的羥基磷灰石纖維的含量增大，孔隙率有所增加，這種更加規則化的排列更有利于hs69水凝膠支架抗壓能力的增加。
82.如圖3所示，含有羥基磷灰石的h-dn、h69-dn、hs和hs69組的抗壓強度普遍高于其他組，最高可達6.5mpa，但其拉伸性能較差，僅可達0.4mpa。
83.實驗例2、用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架的骨軟骨缺損的療效
84.對本發明提供的促進骨軟骨缺損原位誘導再生的3d打印分層、梯度、功能化仿生軟骨水凝膠療效評估。
85.受試對象：spf級雄兔，平均體重2kg，購于蘭州大學生物醫學實驗中心，應用鉆孔法建立兔骨軟骨缺損模型，建模成功后在兔后腿關節處制備一個直徑4.0mm，深度3.0mm的骨軟骨缺損，并植入打印的支架。
86.實驗分組：將建立的骨軟骨缺損兔按方式分為(1)hs69；(2)dn；(3)s-dn；(4)69-dn；(5)h-dn；(6)h69-dn；(7)hs；(8)s69；(9)control等每組各三只。
87.方案：control組不予任何處理，組分別使用本發明實施例1～實施例8的3d打印水凝膠處理，周期為6周、12周。
88.療效評價：分別于后6周、12周觀察愈合情況。6周、12周后處死兔，取組織樣本，后對樣本進行micro-ct分析，后固定、脫鈣、包埋、切片，行h&e、番紅o/固綠染、阿利新藍染、免疫熒光組化染，觀察各組骨軟骨組織缺損部位的愈合情況。
89.實驗結果：
90.如圖4所示，大體觀hs69組的骨軟骨缺損愈合程度明顯優于另外八組，三維重建顯示所有樣本的表面都沒有被磨損，二維重建圖像顯示6周時所有組缺損部位呈低密度影，12周時hs69組呈現完整的高密度影，說明hs69組的修復效果優于其他組。如圖5所示，h&e染顯示結果與大體觀結果基本相同，6周所有組的纖維和未成熟組織為主要成分，顯示了有限的修復。組織學上，12周組的缺損邊緣為透明軟骨，中心區域纖維組織較少，比6周組較好，這表明隨著時間的推移，軟骨樣組織的成熟度明顯增加。番紅o/固綠染顯示hs69組透明軟骨樣細胞在淺表區排列有序，并與表面平行。阿利新藍染顯示hs69組軟骨細胞成熟，且軟骨蛋白多糖增多。如圖6所示，通過免疫熒光組化染評價骨軟骨缺損修復效果，在6周時hs69組表現出acan、col2、col1、runx2表達上調，說明骨軟骨修復正在進行，且在12周時，acan、col2、col1、runx2表達均高于其他組，說明骨軟骨修復程度最高，骨和軟骨細胞外基質合成增加，提示hs69對骨軟骨缺損修復具有持久作用。
91.本發明公開了一種基于3d打印技術制備的分層、梯度、功能化仿生軟骨水凝膠，并用于促進骨軟骨缺損原位誘導再生，是海藻酸鈉、丙烯酰胺、雙鍵接枝的羥基磷灰石、載生化因子的緩釋微球，核酸適配體混合溶液先通過3d打印和電子噴霧器預交聯，然后再浸泡鈣離子溶液交聯形成的復合材料，并提供了其制備方法和應用。本發明的有益效果為：本發明采用3d打印技術制作的分層、梯度、功能化仿生軟骨水凝膠，大大降低了傳統支架在制備過程中模式單一，人工成本高等問題，具有經濟高效、操作簡單、模式靈活、個性化等優點。同時本發明基于3d打印制備的分層、梯度、功能化仿生軟骨水凝膠，也解決了傳統軟骨制備
過程中步驟繁瑣，水凝膠中的分散性差等問題，除此之外，合成的分層、梯度、功能化仿生軟骨水凝膠具有良好的生物相容性，促進骨軟骨缺損原位誘導再生等作用。故本發明常溫下3d打印分層、梯度、功能化仿生軟骨水凝膠對于仿生軟骨支架水凝膠批量化、規模化生產提供了可能并探索了一套最簡便、省時的工藝流程。
92.最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
技術特征：
1.一種用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架，其特征在于，由下至上依次為軟骨下骨層、鈣化界面層和軟骨層；所述的軟骨下骨層為含有核酸適配體和羥基磷灰石的水凝膠；所述的鈣化界面層為水凝膠；所述的軟骨層為含有生化因子的水凝膠；所述的水凝膠由海藻酸鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨和n'n-亞甲基雙丙烯酰胺制備得到。2.如權利要求1所述的復合水凝膠支架，其特征在于，所述的羥基磷灰石為接枝雙鍵的羥基磷灰石纖維，終濃度為30％～80％；其中羥基磷灰石纖維接枝雙鍵的過程如下：(1)配制體積比為9：1的乙醇溶液，并用醋酸緩沖液調節ph至4.0備用；(2)在步驟(1)所得溶液中加入體積分數為5％的硅烷偶聯劑kh570，室溫下降解30min；(3)在步驟(2)所得溶液中加入質量分數為40％的羥基磷灰石纖維，超聲分散10min；(4)步驟(3)所得的溶液在65℃水浴攪拌2h后，用步驟(1)所得溶液洗滌后烘箱干燥過夜。3.如權利要求1所述的復合水凝膠支架，其特征在于，所述的生化因子為sdf-1、pdgf、mcp-1、il-8、mip、tgf-β超家族、igf、vegf、fgf、hgf、egf、prp、epo、功能性多肽、外泌體中的一種或幾種，再將所述的生化因子載入到緩釋微球中。4.如權利要求1所述的復合水凝膠支架，其特征在于，所述的海藻酸鈉和丙烯酰胺的比例為1～10：2～20溶解，海藻酸鈉終濃度為1.5％～15％，所述的過硫酸銨終濃度為0.4～4.0wt％，所述的n'n-亞甲基雙丙烯酰胺濃度為丙烯酰胺的6～60
‰
。5.如權利要求1所述的復合水凝膠支架，其特征在于，所述的核酸適配體為hm69或apt19s。(我們使用的是核酸適配體hm69，購自金斯瑞，還可使用具有捕獲細胞特性的apt19s等其他核酸適配體)。6.如權利要求1所述的復合水凝膠支架的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)制備軟骨下骨層水凝膠：將海藻酸鈉和丙烯酰胺按照比例溶解于去離子水中；加入過硫酸銨和n'n-亞甲基雙丙烯酰胺，避光攪拌；再加入接枝雙鍵的羥基磷灰石纖維，避光攪拌過夜；(2)制備鈣化界面層水凝膠：將海藻酸鈉和丙烯酰胺按照比例溶解于去離子水中；加入過硫酸銨和n'n-亞甲基雙丙烯酰胺，避光攪拌；(3)制備軟骨層水凝膠：將海藻酸鈉和丙烯酰胺按照比例溶解于去離子水中；加入過硫酸銨和n'n-亞甲基雙丙烯酰胺，避光攪拌；再加入載生化因子緩釋微球，避光攪拌；(4)制備復合水凝膠支架：將步驟(1)、(2)和(3)制備得到的水凝膠按照順序分別裝入3個3d打印料筒中，3d打印機按照預定參數打印；(5)步驟(4)得到的復合水凝膠支架置于波長范圍在10～380nm的uv燈下光照10～100min；浸泡于濃度為2～20mg/ml鈣離子溶液中，過夜，即得。7.如權利要求6所述的復合水凝膠支架的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述的打印過程中使用電子噴霧裝置進行初級網絡交聯。8.如權利要求6所述的復合水凝膠支架的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述的3d打印機為擠壓式3d打印機。9.如權利要求1-5任一項所述的復合水凝膠支架在制備骨-軟骨修復材料中的應用。
技術總結
本發明屬于生物材料技術領域，具體涉及一種用于促進骨-軟骨修復的復合水凝膠支架及其制備方法和應用，包括由下至上依次為軟骨下骨層、鈣化界面層和軟骨層；軟骨下骨層為含有核酸適配體和羥基磷灰石的水凝膠；鈣化界面層為水凝膠；軟骨層為含有生化因子的水凝膠；水凝膠由海藻酸鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨和'-亞甲基雙丙烯酰胺制備得到，其中，丙烯酰胺提供初級網絡支撐結構，海藻酸鈉提供附著及終網絡支撐結構，雙鍵修飾羥基磷灰石纖維用以增加材料的物理性能及促進干細胞分化，核酸適配體用以募集干細胞，微球包裹的生化因子用以促進干細胞的分化、為干細胞遷移提供方向，具有良好的生物相容性，能夠有效地促進骨軟骨缺損原位誘導再生。導再生。導再生。
