促進(jìn)中華鱉體外胚胎發(fā)育的方法
1.本發(fā)明涉及一種調(diào)控中華鱉胚胎發(fā)育的方法。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2.胚蛋給養(yǎng)是通過注射將外源營養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)充到孵化期胚蛋中的給養(yǎng)方式，也稱卵內(nèi)給養(yǎng)。目前，胚蛋給養(yǎng)主要應(yīng)用與家禽中，大量研究結(jié)果表明，卵內(nèi)給養(yǎng)可改善雛雞腸道健康，增加肌肉和肝臟糖原儲備，促進(jìn)器官發(fā)育，提高機(jī)體免疫力。其中維生素和氨基酸在胚蛋給養(yǎng)中改善生長發(fā)育的研究較多。如卵內(nèi)注射精氨酸對家鴿(columba livia)的孵化性能和生長發(fā)育具有影響；家鴿卵內(nèi)注射組氨酸可以提高孵化率、縮短孵化周期、有利于腸道發(fā)育，但對后期生長性能幾乎無影響。
3.胚胎期是中華鱉優(yōu)良性狀和個(gè)體生長發(fā)育的重要時(shí)期，易受到外界環(huán)境的影響。胚胎發(fā)育期間的營養(yǎng)限制可能妨礙胚胎發(fā)育，目前常見的方法是于大規(guī)模噴淋、飼喂等方式，雖然在一定程度上也可以干預(yù)胚胎發(fā)育過程，促進(jìn)胚蛋發(fā)育，但存在用料不夠精準(zhǔn)、時(shí)機(jī)把握不佳等因素，無法充分發(fā)揮功效。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
4.本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種能精準(zhǔn)的促進(jìn)中華鱉體外胚胎發(fā)育的方法。
5.本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種促進(jìn)中華鱉體外胚胎發(fā)育的方法，其特征在于選擇中華鱉發(fā)育在第15期的胚蛋，在胚蛋中添加脯氨酸促進(jìn)胚蛋發(fā)育。
6.胚胎期中華鱉在第14期胚胎背甲尚未發(fā)育完全，第16期才開始出現(xiàn)裙邊，選擇第15期是考慮在該性狀出現(xiàn)之前的敏感期或關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行營養(yǎng)調(diào)控，更有利于裙邊組織的發(fā)育。而如果操作過早，胚胎死亡率會增大。
7.所述的脯氨酸注射到胚蛋的卵氣室內(nèi)，不戳破卵膜，以免對胚蛋造成損傷，影響發(fā)育。
8.作為優(yōu)選，其特征在于所述的脯氨酸溶解在氯化鈉水溶液中形成注射液進(jìn)行注射，注射量為2～10μl，脯氨酸濃度為10～30mg/ml，氯化鈉百分比濃度為0～0.9％。
9.作為最佳，所述注射量為5μl，脯氨酸濃度為20mg/ml，氯化鈉百分比濃度為0.9％。
10.作為優(yōu)選，包括如下步驟：首先用75％乙醇對中華鱉卵表面進(jìn)行消毒，接著用鉆孔器在中華鱉卵氣室位置開注射孔，通過微量進(jìn)樣器將脯氨酸的氯化鈉溶液注射到卵氣室內(nèi)，注射完畢后用封口膜封住注射孔。注射孔不易太大，1mm左右比較合適。
11.與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：脯氨酸(proline，pro)是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的亞氨基酸，被稱為蛋白質(zhì)的基本組成部分，是具有仲胺的唯一蛋白源氨基酸，有助于膠原蛋白的構(gòu)建，對于維持生命、生長、攝食、營養(yǎng)利用、免疫、抵御環(huán)境和病原應(yīng)激都是必需的，被歸為是功能性氨基酸。中華鱉裙邊富含膠原蛋白，而脯氨酸是構(gòu)成膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的重要組成之一，因此采用脯氨酸可以促進(jìn)膠原積累，得到更優(yōu)品質(zhì)的中華鱉個(gè)體。
12.通過胚蛋給養(yǎng)脯氨酸可以干預(yù)胚胎發(fā)育過程，提高中華鱉品質(zhì)性狀，相對于大規(guī)模噴淋、飼喂等方式，更能精準(zhǔn)的發(fā)揮作用。裙邊是中華鱉最具特征性的營養(yǎng)組織，脯氨酸能夠在胚胎期就可以促進(jìn)裙邊生長和發(fā)育，有利于中華鱉幼體出殼后形成寬厚肥大裙邊等優(yōu)良品質(zhì)性狀。
附圖說明
13.圖1為實(shí)施例第22期和對比例第22期背甲比值對比圖。
14.圖2為實(shí)施例第22期和對比例第22期背甲指數(shù)對比圖。
15.圖3為實(shí)施例第22期和對比例第22期胚胎重對比圖。
16.圖4為實(shí)施例第22期和對比例第22期胚胎長對比圖。
17.圖5為實(shí)施例第22期和對比例第22期裙邊比值對比圖。
18.圖6為實(shí)施例第22期和對比例第22期裙邊指數(shù)對比圖。
19.圖7為實(shí)施例第22期和對比例第22期中華鱉裙邊組織col1a1表達(dá)水平對比圖。
20.圖8為實(shí)施例第22期和對比例第22期中華鱉裙邊組織col1a2表達(dá)水平對比圖。
21.圖9為實(shí)施例第22期天狼星紅染顯微照片。
22.圖10對比例第22期天狼星紅染顯微照片。
23.圖11為實(shí)施例第22期和對比例第22期天狼星紅i型膠原百分占比對比圖。
具體實(shí)施方式
24.以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
25.實(shí)施例，首先用75％乙醇對中華鱉卵(發(fā)育在第15期的胚蛋)表面進(jìn)行消毒，接著用鉆孔器在中華鱉卵氣室位置開注射孔，通過微量進(jìn)樣器將脯氨酸的氯化鈉溶液注射到卵氣室內(nèi)，注射完畢后用封口膜封住注射孔。注射量5μl，脯氨酸的濃度為20mg/ml，氯化鈉百分比濃度為0.9％。實(shí)施例中選用12個(gè)中華鱉卵。
26.對比例，首先用75％乙醇對中華鱉卵(發(fā)育在第15期的胚蛋)表面進(jìn)行消毒，接著用鉆孔器在中華鱉卵氣室位置開注射孔，通過微量進(jìn)樣器將脯氨酸的氯化鈉溶液注射到卵氣室內(nèi)，注射完畢后用封口膜封住注射孔。注射量5μl氯化鈉水溶液，氯化鈉百分比濃度為0.9％。對比例中選用12個(gè)中華鱉卵。
27.表一為實(shí)施例和對比例中華鱉卵重量統(tǒng)計(jì)：
28.序號實(shí)施例重量g對比例重量g12.35282.449722.32932.963032.75792.485942.63112.83952.67732.383662.83663.406172.56932.694282.89362.329093.26602.6440
102.98042.6797112.80773.2055123.68063.6419平均值和標(biāo)準(zhǔn)差2.8152
±
0.37572.8101
±
0.4193
29.結(jié)果：
30.存活率：由試驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)施例中中華鱉卵第22期孵化率為51％，對比例中中華鱉卵第22期的孵化率為42％，同等條件下實(shí)施例中的孵化率顯著高于正常組(p＜0.05)。
31.對胚胎期中華鱉外部形態(tài)的影響：對實(shí)施例和對比例中胚胎在第22期進(jìn)行取樣，用游標(biāo)卡尺對胚胎長、背甲長、背甲寬、裙邊寬進(jìn)行測量，用電子天平測定胚胎重，背甲重以及裙邊重。試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合圖1～6所示，注射pro后，中華鱉胚胎更重，背甲裙邊發(fā)育更好，總的來說，胚胎生長發(fā)育優(yōu)于正常組。
32.對裙邊組織i型膠原基因表達(dá)的影響：結(jié)合圖7和圖8所示，實(shí)施例中i型膠原基因表達(dá)量更高，有利于i型膠原的合成。
33.對裙邊組織天狼星紅染的影響：結(jié)合圖9～圖11所示，對比例裙邊組織折光性不是很強(qiáng)，膠原纖維呈現(xiàn)亮紅，實(shí)施例膠原纖維也呈現(xiàn)亮紅，折光性更加明顯。并且i型膠原蛋白百分占比結(jié)果表明，實(shí)施例顯著高于對比例(p＜0.01)。
技術(shù)特征：
1.一種促進(jìn)中華鱉體外胚胎發(fā)育的方法，其特征在于選擇中華鱉發(fā)育在第15期的胚蛋，在胚蛋中添加脯氨酸促進(jìn)胚蛋發(fā)育。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)中華鱉體外胚胎發(fā)育的方法，其特征在于所述的脯氨酸注射到胚蛋的卵氣室內(nèi)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促進(jìn)中華鱉體外胚胎發(fā)育的方法，其特征在于所述的脯氨酸溶解在氯化鈉水溶液中形成注射液進(jìn)行注射，注射量為2～10μl，脯氨酸濃度為10～30mg/ml，氯化鈉百分比濃度為0～0.9％。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的促進(jìn)中華鱉體外胚胎發(fā)育的方法，其特征在于包括如下步驟：首先用75％乙醇對中華鱉卵表面進(jìn)行消毒，接著用鉆孔器在中華鱉卵氣室位置開注射孔，通過微量進(jìn)樣器將脯氨酸的氯化鈉溶液注射到卵氣室內(nèi)，注射完畢后用封口膜封住注射孔。
技術(shù)總結(jié)
一種促進(jìn)中華鱉體外胚胎發(fā)育的方法，其特征在于選擇中華鱉發(fā)育在第15期的胚蛋，在胚蛋中添加脯氨酸促進(jìn)胚蛋發(fā)育。進(jìn)一步，所述的脯氨酸注射到胚蛋的卵氣室內(nèi)。通過胚蛋給養(yǎng)脯氨酸可以干預(yù)胚胎發(fā)育過程，提高中華鱉品質(zhì)性狀，相對于大規(guī)模噴淋、飼喂等方式，更能精準(zhǔn)的發(fā)揮作用。發(fā)揮作用。發(fā)揮作用。
