一種重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法與流程
1.本發(fā)明涉及生物蛋白純化的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法。
背景技術(shù)：
2.貽貝粘蛋白(mussel adhesive protein，map)是貽貝足部分泌腺分泌出的一種蛋白復(fù)合物，具有促進(jìn)細(xì)胞貼壁爬行、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、抑制瘙癢、廣譜粘接、形成抗水保護(hù)膜等作用。近年來因其具有高強(qiáng)度，高韌性，防水性和可降解性等優(yōu)點(diǎn)收到了廣泛的關(guān)注，在生物醫(yī)藥方面得到了大力的推廣和應(yīng)用。
3.貽貝粘蛋白的獲取途徑主要為海洋紫貽貝足部提取，受原材料及提取工藝的限制，獲取貽貝粘蛋白純品的效率及產(chǎn)量較低，極大得限制了貽貝粘蛋白的應(yīng)用，利用生物技術(shù)手段進(jìn)行重組類貽貝黏蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)成為現(xiàn)下的研究重點(diǎn)。
4.現(xiàn)有技術(shù)中，利用生物技術(shù)獲取的大腸桿菌工程菌發(fā)酵表達(dá)純化最終獲得重組類貽貝粘蛋白凍干產(chǎn)品的報(bào)道日益增多，但凍干產(chǎn)品或純化產(chǎn)品中內(nèi)毒素高且去除困難，極大地限制了其產(chǎn)品在醫(yī)療器械領(lǐng)域的使用，
5.內(nèi)毒素不是蛋白質(zhì)，因此非常耐熱。在100℃的高溫下加熱1小時(shí)也不會(huì)被破壞，只有在160℃的溫度下加熱2到4個(gè)小時(shí)，或用強(qiáng)堿、強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑加溫煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。內(nèi)毒素相對(duì)分子質(zhì)量從幾千到幾萬不等，具有耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性，性質(zhì)極不均一，目前很難到一種高效且通用的內(nèi)毒素去除方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
6.本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是利用生物技術(shù)獲得的重組類貽貝粘蛋白產(chǎn)品含內(nèi)毒素過高，提供一種重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素的去除方法，使產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量小于5eu/mg。
7.為了解決上述問題，本發(fā)明提出以下技術(shù)方案：
8.一種重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，包括以下步驟：
9.s1，向被內(nèi)毒素污染的蛋白制劑中加入含有尿素與氯化鈉的混合溶液，使蛋白充分溶解，得到上樣料液；
10.s2，用緩沖液平衡好層析柱，將所述上樣料液過柱，收集穿柱料液；
11.s3，向穿柱料液中加入鹽酸，進(jìn)行酸熱反應(yīng)；
12.s4，對(duì)s3反應(yīng)完的料液調(diào)節(jié)ph值至大于或等于3.0，經(jīng)透析過濾濃縮收集截留液，得到內(nèi)毒素含量小于或等于5eu/mg的產(chǎn)物。
13.本發(fā)明在內(nèi)毒素的去除過程中加入了尿素，尿素在層析過程中具有增強(qiáng)內(nèi)毒素掛柱以達(dá)到預(yù)期內(nèi)毒素去除效果的作用，同時(shí)尿素在酸熱反應(yīng)的過程中還具有保護(hù)蛋白，防止蛋白在酸熱反應(yīng)的過程中分解的作用。
14.其進(jìn)一步的技術(shù)方案為，所述被內(nèi)毒素污染的蛋白制劑包含部分純化的重組類貽
貝粘蛋白。例如，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述被內(nèi)毒素污染的蛋白制劑為采用大腸桿菌工程菌發(fā)酵表達(dá)純化獲取重組類貽貝粘蛋白的中間產(chǎn)物。
15.其進(jìn)一步的技術(shù)方案為，所述被內(nèi)毒素污染的蛋白制劑包含高度純化的重組類貽貝粘蛋白。例如，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述被內(nèi)毒素污染的蛋白制劑為采用大腸桿菌工程菌發(fā)酵表達(dá)純化獲取的重組類貽貝粘蛋白凍干粉。
16.其進(jìn)一步的技術(shù)方案為，所述步驟s1中，混合溶液中的尿素含量大于或等于4.0mol/l，氯化鈉含量為1.5～2.0mol/l。例如，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，混合溶液中的尿素含量為4.0mol/l、5.0mol/l、6.0mol/l、7.0mol/l或8.0mol/l，氯化鈉含量為1.5mol/l、1.7mol/l、1.9mol/l或2.0mol/l。
17.需要說明的是，考慮到混合溶液中尿素的溶解度，其含量一般不超過8mol/l。
18.可以理解的，混合溶液所用的溶劑為純化水。
19.其進(jìn)一步的技術(shù)方案為，所述步驟s1中，上樣料液中含有的重組類貽貝粘蛋白含量為15～20g/l。
20.需要說明的是，上樣料液中的重組類貽貝粘蛋白含量最好不超過20g/l，含量過高會(huì)導(dǎo)致料液粘度提升，層析時(shí)嚴(yán)重影響內(nèi)毒素的掛柱效果，從而大幅度降低在層析步驟中去除內(nèi)毒素的效率，可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)毒素超標(biāo)；含量過低的話會(huì)雖不會(huì)影響去除內(nèi)毒素的效果，但會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)效率變低。因此，上樣料液中的重組類貽貝粘蛋白含量應(yīng)在適宜范圍內(nèi)，以15～20g/l為宜。例如，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，上樣料液中含有的重組類貽貝粘蛋白含量為15g/l、16g/l、18g/l、或20g/l。
21.其進(jìn)一步的技術(shù)方案為，所述步驟s2中，所述緩沖液為1.5～2.0mol/l的氯化鈉溶液。例如，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液中，氯化鈉含量為1.5mol/l、1.7mol/l、1.9mol/l或2.0mol/l。
22.其進(jìn)一步的技術(shù)方案為，所述步驟s2中，所述層析柱為苯基疏水層析柱。
23.其進(jìn)一步的技術(shù)方案為，所述步驟s3中，加入鹽酸至0.05～0.15mol/l。例如，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟s3中，加入鹽酸至0.05mol/l、0.07mol/l、0.09mol/l、0.12mol/l、0.14mol/l或0.15mol/l。
24.其進(jìn)一步的技術(shù)方案為，所述步驟s3中，酸熱反應(yīng)的溫度為80℃及以上，反應(yīng)時(shí)間0.5～1h。例如，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟s3中，酸熱反應(yīng)的溫度為80℃、85℃、90℃、95℃或100℃，反應(yīng)時(shí)間0.5h、40min或1.0h
25.可以理解的，酸熱反應(yīng)的溫度為不宜過高，以80～100℃為宜，以防止蛋白酸解，適宜的溫度可以提高鹽酸對(duì)內(nèi)毒素的去除效率。
26.其進(jìn)一步的技術(shù)方案為，所述步驟s4中，過濾方式為超濾。例如，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，采用10kd的超濾膜進(jìn)行超濾。
27.其進(jìn)一步的技術(shù)方案為，所述步驟s4中，采用純化水進(jìn)行透析。
28.其進(jìn)一步的技術(shù)方案為，所述步驟s4中，還包括對(duì)截留液進(jìn)行冷凍干燥。
29.在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟s4中，調(diào)節(jié)料液的ph值至大于或等于3.0，例如，采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)料液的ph值至3.0、3.1、3.2、3.3、3.4或3.7。由于目標(biāo)產(chǎn)物重組類貽貝粘蛋白為酸溶性蛋白，因此，ph值在3～6之間為宜，在3～5之間較佳，在3～4之間為最佳范圍，ph值過高會(huì)存在目標(biāo)蛋白在超濾過程中析出堵塞的風(fēng)險(xiǎn)。
30.與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所能達(dá)到的技術(shù)效果包括：
31.本發(fā)明提供的重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，對(duì)需處理的被內(nèi)毒素污染的蛋白制劑中加入尿素一起溶解，再過疏水柱層析，收集穿柱料液，進(jìn)一步對(duì)穿柱料液進(jìn)行酸熱處理，經(jīng)過超濾濃縮后可獲得內(nèi)毒素含量小于5eu/mg的目標(biāo)蛋白產(chǎn)品。本發(fā)明提供的去除方法在去除目標(biāo)蛋白內(nèi)毒素的同時(shí)，能夠獲得較高的目標(biāo)蛋白回收率，具有簡(jiǎn)單、高效的優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行大批量工業(yè)化生產(chǎn)。
附圖說明
32.圖1為實(shí)施例1及對(duì)比例2酸熱處理的樣品電泳檢測(cè)圖：其中，泳道1：蛋白marker，泳道2：重組類貽貝粘蛋白10g/l對(duì)照品點(diǎn)樣量10ul，泳道3：對(duì)比例2不含尿素的穿料液酸熱處理樣品點(diǎn)樣量10ul，泳道4：實(shí)施例1含尿素的穿料液酸熱處理樣品點(diǎn)樣量10ul。
具體實(shí)施方式
33.下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，以下將描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
34.應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用時(shí)，術(shù)語“包括”和“包含”指示所描述特征、整體、步驟、操作、元素和/或組件的存在，但并不排除一個(gè)或多個(gè)其它特征、整體、步驟、操作、元素、組件和/或其集合的存在或添加。
35.以下通過具體實(shí)施例來詳細(xì)介紹本發(fā)明提供的重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法能夠獲得內(nèi)毒素含量小于5eu/mg的目標(biāo)蛋白產(chǎn)品。
36.本發(fā)明實(shí)施例的內(nèi)毒素含量采用《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)四部通則1143凝膠法進(jìn)行檢測(cè)。
37.本發(fā)明實(shí)施例所用的被內(nèi)毒素污染的蛋白制劑為采用大腸桿菌工程菌發(fā)酵表達(dá)純化獲取的重組類貽貝粘蛋白凍干粉。在常規(guī)的生物工程技術(shù)提取純化獲得重組類貽貝粘蛋白的工藝流程中，通常是用大腸桿菌工程菌發(fā)酵表達(dá)獲取包涵體，再經(jīng)酸提鹽析超濾凍干的流程取得重組類貽貝粘蛋白凍干粉，受大腸桿菌內(nèi)毒素的影響以及提純工藝限制，凍干粉產(chǎn)品中的內(nèi)毒素含量大于20eu/mg、大于100eu/mg甚至大于500eu/mg，遠(yuǎn)高于實(shí)際應(yīng)用的限度水平。
38.在其他實(shí)施例中，本發(fā)明提供的內(nèi)毒素去除方法還可以直接應(yīng)用在利用生物工程技術(shù)獲得重組類貽貝粘蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，向生產(chǎn)得到的部分純化的蛋白產(chǎn)物執(zhí)行本發(fā)明的步驟s1-s4。
39.實(shí)施例1
40.本發(fā)明實(shí)施例提供一種重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，該方法包括以下步驟：
41.1)將5g采用常規(guī)生物工程技術(shù)獲得的重組類貽貝粘蛋白凍干粉產(chǎn)品溶于250ml的含6m尿素及1.5m氯化鈉的純化水中，使蛋白充分溶解，得到上樣料液。
42.2)用1.9mol/l氯化鈉緩沖液平衡好苯基疏水層析柱，將所述上樣料液過柱層析，
收集穿柱料液300ml，經(jīng)檢測(cè)，得到的穿柱料液中，內(nèi)毒素含量小于100eu/mg。
43.3)向穿柱料液加入鹽酸至濃度為0.1mol/l，加熱至81℃并保持35min，反應(yīng)完畢后留樣進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1的泳道4所示，顯示蛋白較為穩(wěn)定，無明顯降解條帶，說明目標(biāo)蛋白在酸熱處理中能夠穩(wěn)定存在。
44.4)將步驟3)中反應(yīng)完的料液冷卻至室溫，用2mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)料液的ph至3.5，再以純化水作為透析液經(jīng)10kd超濾膜進(jìn)行超濾脫鹽濃縮，收集截留液400ml，將截留液冷凍干燥，獲得目標(biāo)蛋白凍干粉4.72g，經(jīng)檢測(cè)，目標(biāo)蛋白凍干粉中的內(nèi)毒素含量小于5eu/mg，蛋白回收率為94.4％。
45.實(shí)施例2
46.本發(fā)明實(shí)施例提供一種重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，該方法包括以下步驟：
47.1)將10g采用常規(guī)生物工程技術(shù)獲得的重組類貽貝粘蛋白凍干粉產(chǎn)品溶于500ml的含4m尿素及2m氯化鈉的純化水中，使蛋白充分溶解，得到上樣料液。
48.2)用2.0mol/l氯化鈉緩沖液平衡好苯基疏水層析柱，將所述上樣料液過柱層析，收集穿柱料液520ml，經(jīng)檢測(cè)，得到的穿柱料液中，內(nèi)毒素含量小于100eu/mg。
49.3)向穿柱料液加入鹽酸至濃度為0.15mol/l，加熱至84℃并保持31min，反應(yīng)完畢后留樣進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示蛋白較為穩(wěn)定，無明顯降解條帶。
50.4)將步驟3)中反應(yīng)完的料液冷卻至室溫，用2mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)料液的ph至3.2，再以純化水作為透析液經(jīng)10kd超濾膜進(jìn)行超濾脫鹽濃縮，收集截留液410ml，將截留液冷凍干燥，獲得目標(biāo)蛋白凍干粉9.21g，經(jīng)檢測(cè)，目標(biāo)蛋白凍干粉中的內(nèi)毒素含量小于5eu/mg，蛋白回收率92.1％。
51.對(duì)比例1
52.本發(fā)明對(duì)比例提供一種重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，該方法包括以下步驟：
53.1)將5g采用常規(guī)生物工程技術(shù)獲得的重組類貽貝粘蛋白凍干粉產(chǎn)品溶于250ml的含2m尿素及1.5m氯化鈉的純化水中，使蛋白充分溶解，得到上樣料液。
54.2)用1.9mol/l氯化鈉緩沖液平衡好苯基疏水層析柱，將所述上樣料液過柱層析，收集穿柱料液304ml，經(jīng)檢測(cè)，得到的穿柱料液中，內(nèi)毒素含量大于100eu/mg。
55.3)向穿柱料液加入鹽酸至濃度為0.1mol/l，加熱至81℃并保持35min，反應(yīng)完畢后留樣電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示蛋白較為穩(wěn)定，無明顯降解條帶。
56.4)將步驟3)中反應(yīng)完的料液冷卻至室溫，用2mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)料液的ph至3.5，再以純化水作為透析液經(jīng)10kd超濾膜進(jìn)行超濾脫鹽濃縮，收集截留液410ml，將截留液冷凍干燥，獲得目標(biāo)蛋白凍干粉4.66g，經(jīng)檢測(cè)，目標(biāo)蛋白凍干粉中的內(nèi)毒素含量大于5eu/mg，目標(biāo)蛋白回收率93.2％。
57.本對(duì)比例在步驟1)中添加的尿素含量為2mol/l，低于本發(fā)明限定的保護(hù)范圍，由于尿素含量過低，導(dǎo)致上樣料液在過柱層析的過程中內(nèi)毒素掛壁效果差，使得穿柱料液中殘留了大量的內(nèi)毒素，而酸熱處理對(duì)內(nèi)毒素的去除量有限，因此，得到的目標(biāo)蛋白凍干粉的內(nèi)毒素含量大于5eu/mg。
58.對(duì)比例2
59.本發(fā)明對(duì)比例提供一種重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，該方法包括以下步驟：
60.1)將5g采用常規(guī)生物工程技術(shù)獲得的重組類貽貝粘蛋白凍干粉產(chǎn)品溶于250ml含1.5m氯化鈉的純化水中，使蛋白充分溶解，得到上樣料液。
61.2)用1.9mol/l氯化鈉緩沖液平衡好苯基疏水層析柱，將所述上樣料液過柱層析，收集穿柱料液310ml，經(jīng)檢測(cè)，得到的穿柱料液中，內(nèi)毒素含量大于100eu/mg。
62.3)向穿柱料液加入鹽酸至濃度為0.1mol/l，加熱至81℃并保持35min，反應(yīng)完畢后留樣電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1的泳道3所示，顯示目標(biāo)蛋白有明顯降解條帶產(chǎn)生。
63.4)將步驟3)中反應(yīng)完的料液冷卻至室溫，用2mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)料液的ph至3.5，再以純化水作為透析液經(jīng)10kd超濾膜進(jìn)行超濾脫鹽濃縮，收集截留液405ml，將截留液冷凍干燥，獲得目標(biāo)蛋白凍干粉4.52g，經(jīng)檢測(cè)，目標(biāo)蛋白凍干粉中的內(nèi)毒素含量大于5eu/mg，蛋白回收率90.4％。
64.本對(duì)比例中，步驟1)未加入尿素，上樣料液在過柱層析的過程中內(nèi)毒素掛壁效果差，使得穿柱料液中殘留了大量的內(nèi)毒素，即使在后續(xù)的酸熱處理中，通過提高鹽酸濃度來保護(hù)目標(biāo)蛋白，但由于缺少尿素，目標(biāo)蛋白仍會(huì)在酸熱處理中出現(xiàn)明顯的降解。可見，尿素在酸熱反應(yīng)的過程中具有保護(hù)蛋白，防止蛋白在酸熱反應(yīng)的過程中分解的作用。
65.對(duì)比例3
66.本發(fā)明對(duì)比例提供一種重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，該方法包括以下步驟：
67.1)將5g采用常規(guī)生物工程技術(shù)獲得的重組類貽貝粘蛋白凍干粉產(chǎn)品溶于250ml的含6m尿素及1.5m氯化鈉的純化水中，使蛋白充分溶解，得到上樣料液。
68.2)用1.8mol/l氯化鈉緩沖液平衡好苯基疏水層析柱，將所述上樣料液過柱層析，收集穿柱料液300ml，經(jīng)檢測(cè)，得到的穿柱料液中，內(nèi)毒素含量小于100eu/mg。
69.3)向穿柱料液加入鹽酸至濃度為0.02mol/l，加熱至81℃并保持35min，反應(yīng)完畢后留樣電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示蛋白較為穩(wěn)定。
70.4)將步驟3)中反應(yīng)完的料液冷卻至室溫，用2mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)料液的ph至3.5，再以純化水作為透析液經(jīng)10kd超濾膜進(jìn)行超濾脫鹽濃縮，收集截留液220ml，將截留液冷凍干燥，獲得目標(biāo)蛋白凍干粉4.68g，經(jīng)檢測(cè)目標(biāo)蛋白凍干粉中的內(nèi)毒素含量大于5eu/mg，目標(biāo)蛋白回收率93.6％。
71.本對(duì)比例中，步驟3)的鹽酸濃度為0.02mol/l，低于本發(fā)明限定的保護(hù)范圍，雖然尿素的加入增強(qiáng)了內(nèi)毒素過柱層析的效果，但在酸熱處理中，鹽酸濃度過低會(huì)導(dǎo)致對(duì)內(nèi)毒素的去除效果不明顯，因此，得到的目標(biāo)蛋白凍干粉的內(nèi)毒素含量大于5eu/mg。
72.對(duì)比例4
73.本發(fā)明對(duì)比例提供一種重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，該方法包括以下步驟：
74.1)將5g采用常規(guī)生物工程技術(shù)獲得的重組類貽貝粘蛋白凍干粉產(chǎn)品溶于250ml含6m尿素及1.5m氯化鈉的純化水中，使蛋白充分溶解，得到上樣料液。
75.2)用1.9mol/l氯化鈉緩沖液平衡好苯基疏水層析柱，將所述上樣料液過柱層析，收集穿柱料液290ml，經(jīng)檢測(cè)，得到的穿柱料液中，內(nèi)毒素含量小于100eu/mg。
76.3)向穿柱料液加入鹽酸至濃度為0.1mol/l，加熱至72℃并保持32min，反應(yīng)完畢后留樣電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示蛋白較為穩(wěn)定。
77.4)將步驟3)中反應(yīng)完的料液冷卻至室溫，用2mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)料液的ph至3.5，再以純化水作為透析液經(jīng)10kd超濾膜進(jìn)行超濾脫鹽濃縮，收集截留液385ml，將截留液冷凍干燥，獲得目標(biāo)蛋白凍干粉4.61g，經(jīng)檢測(cè)，目標(biāo)蛋白凍干粉中的內(nèi)毒素含量大于5eu/mg，蛋白回收率92.2％。
78.本對(duì)比例中，步驟3)的加熱溫度為72℃，低于本發(fā)明限定的溫度范圍，雖然尿素的加入增強(qiáng)了內(nèi)毒素過柱層析的效果，但在酸熱處理中，溫度過低會(huì)導(dǎo)致對(duì)內(nèi)毒素的去除效果不明顯，因此，得到的目標(biāo)蛋白凍干粉的內(nèi)毒素含量大于5eu/mg。
79.綜上，本發(fā)明提供的重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，對(duì)需處理的被內(nèi)毒素污染的蛋白制劑中加入尿素一起溶解，再過疏水柱層析，尿素的加入增強(qiáng)了內(nèi)毒素的掛柱效果，得到的穿柱料液中，內(nèi)毒素含量小于100eu/mg；再對(duì)穿柱料液結(jié)合酸熱處理去除殘留的內(nèi)毒素；經(jīng)過超濾濃縮后可獲得內(nèi)毒素含量小于5eu/mg的目標(biāo)蛋白產(chǎn)品，尿素還會(huì)在酸熱處理中起保護(hù)蛋白，防止目標(biāo)蛋白分解的作用，從而獲得較高的目標(biāo)蛋白回收率。
80.在上述實(shí)施例中，對(duì)各個(gè)實(shí)施例的描述都各有側(cè)重，某個(gè)實(shí)施例中沒有詳細(xì)描述的部分，可以參見其他實(shí)施例的相關(guān)描述。
81.以上所述，為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到各種等效的修改或替換，這些修改或替換都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
技術(shù)特征：
1.一種重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，其特征在于，包括以下步驟：s1，向被內(nèi)毒素污染的蛋白制劑中加入含有尿素與氯化鈉的混合溶液，使蛋白充分溶解，得到上樣料液；s2，用緩沖液平衡好層析柱，將所述上樣料液過柱，收集穿柱料液；s3，向穿柱料液中加入鹽酸，進(jìn)行酸熱反應(yīng)；s4，對(duì)s3反應(yīng)完的料液調(diào)節(jié)ph值至大于或等于3.0，經(jīng)透析過濾濃縮收集截留液，得到內(nèi)毒素含量小于或等于5eu/mg的產(chǎn)物。2.如權(quán)利要求1所述的重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，其特征在于，所述步驟s1中，混合溶液中的尿素含量大于或等于4.0mol/l，氯化鈉含量為1.5～2.0mol/l。3.如權(quán)利要求1所述的重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，其特征在于，所述步驟s1中，上樣料液中含有的重組類貽貝粘蛋白含量為15～20g/l。4.如權(quán)利要求1所述的重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，其特征在于，所述步驟s2中，所述緩沖液為1.5～2.0mol/l的氯化鈉溶液。5.如權(quán)利要求1所述的重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，其特征在于，所述步驟s2中，所述層析柱為苯基疏水層析柱。6.如權(quán)利要求1所述的重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，其特征在于，所述步驟s3中，加入鹽酸至0.05～0.15mol/l。7.如權(quán)利要求1所述的重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，其特征在于，所述步驟s3中，酸熱反應(yīng)的溫度為80℃及以上，反應(yīng)時(shí)間0.5～1h。8.如權(quán)利要求1所述的重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，其特征在于，所述被內(nèi)毒素污染的蛋白制劑包含部分純化的重組類貽貝粘蛋白；或者所述被內(nèi)毒素污染的蛋白制劑包含高度純化的重組類貽貝粘蛋白。9.如權(quán)利要求1所述的重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，其特征在于，所述步驟s4中，過濾方式為超濾。10.如權(quán)利要求1所述的重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素去除方法，其特征在于，所述步驟s4中，還包括對(duì)截留液進(jìn)行冷凍干燥。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種重組類貽貝粘蛋白內(nèi)毒素的去除方法，涉及生物蛋白純化技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括：S1，向被內(nèi)毒素污染的蛋白制劑中加入含有尿素與氯化鈉的混合溶液，使蛋白充分溶解，得到上樣料液；S2，用緩沖液平衡好層析柱，將所述上樣料液過柱，收集穿柱料液；S3，向穿柱料液中加入鹽酸，進(jìn)行酸熱反應(yīng)；S4，對(duì)S3反應(yīng)完的料液調(diào)節(jié)pH值至大于或等于3.0，經(jīng)透析過濾濃縮收集截留液，得到內(nèi)毒素含量小于或等于5EU/mg的產(chǎn)物。本發(fā)明提供的去除方法在去除目標(biāo)蛋白內(nèi)毒素的同時(shí)，能夠獲得較高的目標(biāo)蛋白回收率，具有簡(jiǎn)單、高效的優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行大批量工業(yè)化生產(chǎn)。業(yè)化生產(chǎn)。業(yè)化生產(chǎn)。
