PDGF-D在調控干細胞增殖和/或分化中的應用
pdgf-d在調控干細胞增殖和/或分化中的應用
技術領域
1.本發明屬于干細胞培養領域，具體地，涉及pdgf-d在調控干細胞增殖和/或分化中的應用。
背景技術：
2.干細胞(stem cell，sc)是一類具有自我更新能力和多分化潛能的細胞，即在體外培養可以無限增殖；同時可以多向分化，被誘導分化為幾乎所有類型的細胞。因此，干細胞在再生醫學和組織修復方面具有廣闊的應用前景和利用價值。
3.血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,pdgf)是生長因子家族的重要成員之一，可促進多種細胞，如血管細胞，神經元細胞等的生長，分化和遷移。pgdf家族包含四個亞型(pdgf-a、-b、-c和-d)和兩個酪氨酸激酶受體pdgfr-α/β。其中，pdgf-d是中山眼科中心李旭日博士與其同事于2001年發現的新的pdgf家族成員，其由348個氨基酸組成，在n端有一個cub蛋白質結構域，c端有一個core domain結構域。cub結構域在空間上阻斷了受體的結合，因而起初會以未活化的前體形式分泌，而后胞外蛋白酶如尿激酶型纖溶酶原激活物(upa)及蛋白裂解酶識別并水解cub結構域，從而剩下的core domain結構域就可結合和激活pdgf受體和下游通路。pdgf蛋白均可通過二硫鍵可形成5個同源或異源二聚體，包括pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc和pdgf-dd，它們可通過與細胞膜上兩種血小板衍生因子受體α、β(pdgfrα、β)不同程度地結合并激活其酪氨酸激酶，從而激活下游信號通路。
技術實現要素：
4.本發明的目的在于提供pdgf-d在調控干細胞增殖和/或分化中的應用，以通過作用于干細胞的erk信號通路調控干細胞的增殖、分化活動。
5.根據本發明的一個方面，提供pdgf-d在調控干細胞增殖和/或分化中的應用。
6.進一步地，pdgf-d具有促進干細胞分化的作用。
7.進一步地，干細胞的分化方向為朝血管內皮細胞方向分化。
8.根據本發明的一個方面，一種利用pdgf-d促進干細胞分化的方法：利用pdgf-d通過激活pdgfrβ,進而激活干細胞中的erk信號通路。
9.可選地，包括上調干細胞的pdgf-d表達水平的操作步驟。
10.可選地，包括向干細胞的培養基中添加pdgf-dd蛋白的操作步驟。
11.進一步地，干細胞的分化方向為朝血管內皮細胞方向分化。
12.進一步地，erk信號通路被激活的表現為磷酸化erk1/2的表達水平上調。
13.進一步地，干細胞為胚胎干細胞。
14.根據本發明的一個方面，一種用于促進干細胞分化的添加劑：添加劑的活性成分包括pdgf-dd蛋白和/或pdgf-d基因的激動劑。
15.根據本發明的另一個方面，提供一種提高胚胎干細胞的增殖能力的方法：包括下
調pdgf-d的表達水平的步驟。
16.進一步地，包括通過抗原抗體免疫反應抑制pdgf-d的表達；或，包括通過基因沉默抑制pdgf-d的表達；或，包括通過采用pdgf-d抑制劑抑制pdgf-d信號通路的表達，pdgf-d抑制劑選自pdgf-d受體pdgfrβ抑制劑、pdgf-d配體抑制劑中的至少一種。
17.根據本發明的另一個方面，提供一種用于提高干細胞的增殖能力的組合物：組合物中的活性成分包括pdgf-d抑制劑，pdgf-d抑制劑選自pdgf-d配體抑制劑、pdgf-d受體抑制劑、pdgf-d下游信號通路抑制劑中的至少一種。
18.進一步地，pdgf-d配體抑制劑包括靶向pdgf-d的核酸效應分子或單克隆抗體中的至少一種。
19.進一步地，pdgf-d受體抑制劑包括pdgfrβ抑制劑。pdgfrβ抑制劑可選自靶向pdgfrβ的中和抗體或通過基因沉默對pdgfrβ表達進行抑制。
20.進一步地，pdgf-d下游信號通路抑制劑包括mapk/erk通路抑制劑。
21.進一步地，mapk/erk通路抑制劑包括pd0325901。
22.生長因子對干細胞的調控是非常精細的，pdgf-d在干細胞中通過結合pdgfrβ受體從而激活下游erk通路調控細胞干性，本發明通過調節pdgf-d的表達，從而實現了對胚胎干細胞的增殖、分化活動的有效調控。
23.心血管疾病是目前全球致死率和致殘率最高的疾病之一，其與血管內皮細胞的數目減少、功能紊亂密切相關。由于血管內皮細胞增殖能力有限，無法自我更新，因此使用干細胞分化為血管內皮細胞成為目前研究和臨床應用的重點方向。盡管目前已有多種方法誘導干細胞分化為血管內皮細胞，但其效率、純度等仍未盡如人意。不同組織的血管內皮細胞具有異質性；血管內皮細胞在發育和形成過程、干細胞向內皮細胞分化過程中也會出現不同的細胞亞型，表達不同的分子標記物。本發明探明了干細胞定向分化為血管內皮細胞過程中關鍵的重要蛋白和機制，利用pdgf-d可促進胚胎干細胞向血管內皮細胞方向的分化。
附圖說明
24.圖1為實施例1中誘導mescs細胞內皮分化的rt-qpcr檢測結果；
25.圖2為實施例2中mescs增殖實驗的shctrl、shpdgfd細胞數量的柱形統計圖，其中，在同組對照數據中，位于左側的柱形圖對應shctrl的細胞數量，位于右側的柱形對應shpdgfd的細胞數量；
26.圖3為實施例2中mescs增殖實驗的shctrl穩定細胞系、shpdgfd穩定細胞系二次鋪板實驗培養結果，其中，在柱形統計圖的同組對照數據中，位于左側的柱形對應shctrl的細胞數量，位于右側的柱形對應shpdgfd的細胞數量；
27.圖4為實施例2中mescs分化實驗的光鏡拍照及堿性磷酸酶染結果；
28.圖5為實施例2中mescs分化實驗中關于干細胞多能性標志物的rt-qpcr檢測結果，其中，在同組對照數據中，位于左側的柱形圖對應shctrl的標志物rna表達量，位于右側的柱形對應shpdgfd的標志物rna表達量；
29.圖6為實施例2中mescs分化實驗的western blot檢測結果；
30.圖7為實施例2中mescs分化實驗中關于血管內皮細胞相關分子標記物的qrt-pcr檢測結果，其中，在同組對照數據中，位于左側的柱形圖對應shctrl的標志物rna表達量，位
于右側的柱形對應shpdgfd的標志物rna表達量；
31.圖8為實施例2中穩定敲pdgf-d組mescs(shpdgfd)的go分析結果；
32.圖9為對實施例2中的shctrl、shpdgfd進行gsea分析的統計結果；
33.圖10為實施例3中對實驗小鼠胚胎的心臟進行切片染的取樣區域；
34.圖11為對應圖10的樣本切片染的觀察視圖以及對應的cd31的區域密度統計圖；
35.圖12為實施例3中對實驗小鼠胚胎的腦部進行切片染的取樣區域；
36.圖13為對應圖12的樣本切片染的觀察視圖以及對應的cd31的區域密度統計圖；
37.圖14為實施例4中的畸胎瘤形成實驗的畸胎瘤組織實物圖；
38.圖15為實施例4中的畸胎瘤形成實驗的畸胎瘤組織切片后的he染圖；
39.圖16為實施例4中的畸胎瘤形成實驗的qrt-pcr檢測結果，其中，在同組對照數據中，位于左側的柱形圖對應shctrl的標志物rna表達量，位于右側的柱形對應shpdgfd的標志物rna表達量；
40.圖17為實施例5中參試細胞的內皮細胞標記物ang2、vegf-a、vegfr-2、tie2的qrt-pcr檢測結果；
41.圖18為實施例5中參試細胞的sox2、ve-cadherin、cd133的qrt-pcr檢測結果；
42.圖19為實施例6中利用加入了外源pdgf-d的培養基培養mescs的western blot檢測結果；
43.圖20為實施例6中利用加入了外源pdgf-d的培養基培養mescs的qrt-pcr檢測結果；
44.圖21為實施例6中利用pdgf-dd蛋白刺激小鼠胚胎干細胞后的western blot檢測結果；
45.圖22為實施例6中利用pdgf-dd蛋白和pdfgrβ中和抗體共同作用于小鼠胚胎干細胞后的western blot檢測結果；
46.圖23為實施例6中的小鼠胚胎干細胞的磷酸酶染效果圖。
具體實施方式
47.為了使本技術領域的人員更好地理解本發明方案，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分的實施例，而不是全部的實施例。
48.為了使本技術領域的人員更好地理解本發明方案，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分的實施例，而不是全部的實施例。
49.以下實施例所采用的物料及方法概述如下：
50.1、實驗所需物料
51.(1)細胞
52.小鼠胚胎干細胞系e14及hek 293t細胞：來自申請人實驗室。
53.(2)質粒
54.小鼠pdgfd基因4inl shrna慢病毒載體：plent-pdgfd-4in1-shrna，購于vigene biosciences公司；
55.陰性對照載體：plent-4in1 shrna-gfp-puro(插入的是無義序列)，購于vigene biosciences公司；
56.慢病毒包裝質粒pspax2和pmd2g均購于addgene公司。
57.(3)抗體和蛋白
58.本實施例所涉及的抗體和蛋白的詳細信息如表1所示。
59.表1 本實施例所采用的抗體和蛋白
60.[0061][0062]
(4)shrna序列
[0063]
本實施例所采用的shrna的序列編碼如表2所示。
[0064]
表2 shrna序列編碼
[0065][0066]
[0067]
2、胚胎干細胞系的制備
[0068]
(1)小鼠胚胎干細胞的復蘇及培養
[0069]
1)配制小鼠胚胎干細胞完全培養基：knockout dmem 500ml+15％fbs+0.1mm mem-neaa+1％p/s+2mm l-glutamine+0.1mm 2-me+1000u/ml lif，4℃保存。
[0070]
2)0.1％gelatin的配制：將0.1g gelatin粉末溶解于100ml ddh2o中，混合均勻，高溫滅菌，常溫保存。
[0071]
3)配制10
×
pbs：磷酸二氫鉀(kh2po4)2.7g+磷酸氫二鈉(na2hpo4)14.2g+氯化鈉(nacl)80g+氯化鉀(kcl)2.0g，加雙蒸水定容至1l，混勻，高溫滅菌后常溫保存。使用時，用滅菌雙蒸水稀釋成1
×
pbs。
[0072]
4)向培養皿中加入0.1％gelatin溶液，在室溫放置約30min；
[0073]
5)用負壓泵吸走gelatin溶液，向培養皿中加適量培養基；
[0074]
6)離心管中預熱5ml培養基或pbs；
[0075]
7)從液氮罐中取出凍存管，將其放入37℃恒溫水浴槽中，快速解凍；
[0076]
8)將懸液轉移至離心管中，以1000rpm的轉速離心，3min，吸走上清；
[0077]
9)重懸細胞并轉移至干凈的培養皿，放入co2培養箱中培養。待細胞貼壁后，每兩天換一次液；
[0078]
10)顯微鏡下觀察，當細胞克隆長大，細胞密度長至80％～90％時可傳代。待傳2-3代后，細胞可用于實驗。
[0079]
(2)小鼠胚胎干細胞的傳代
[0080]
1)向培養皿中加入0.1％gelatin溶液，在室溫放置30min；
[0081]
2)用負壓泵吸走gelatin溶液；
[0082]
3)用1
×
pbs漂洗細胞2次；
[0083]
4)加0.25％胰蛋白酶消化細胞，在室溫孵育約30s后，輕輕搖晃培養皿，顯微鏡下見細胞克隆松散；
[0084]
5)加培養基終止消化，按1:3-1:6的比例，將細胞鋪到新的培養皿中，搖勻細胞懸液后，將培養皿放回37℃co2培養箱中培養。
[0085]
3、細胞rna提取，反轉cdna及qrt-pcr
[0086]
1)取生長至80％密度的細胞，棄培養液，用pbs洗1次，加入500μl trizol裂解細胞，轉移至1.5ml離心管中；
[0087]
2)加入100μl，用力搖晃20s，靜置3min后4℃離心10min，12000rpm；
[0088]
3)將上清吸取到新的離心管中，不要吸到中間層；按1:1的比例向上清中加入異丙醇，混勻，靜置10min后4℃離心10min；
[0089]
4)棄上清，加入1ml 75％的乙醇；
[0090]
5)4℃離心5min，棄上清，加入1ml 75％乙醇，4℃離心5min后，棄上清，將離心管倒立于干凈的吸水紙上，待管底的白沉淀變透明，加入50μl ddh2o，-20℃保存；
[0091]
6)獲得的總rna，利用fastking rt kit with dnase(tiangen)試劑盒合成cdna；
[0092]
7)以合成好的cdna為模板，參照sybr green(roche)試劑盒，在abi quantstudio 6 flex device(life technologies)pcr儀上進行基因表達水平的檢測：
[0093]
8)以gapdh為內參基因，用delta-delta ct法對各基因的表達進行計算。各基因的
引物序列在primerbank網站上獲取。
[0094]
4、western blot實驗
[0095]
1)配制液體：
[0096]
①
10
×
running buffer：依次加入144g甘氨酸、10g sds粉末、30.3g tris粉末，加ddh2o定容至1升。使用時需稀釋成1
×
running buffer；
[0097]
②5×
sds loading buffer：依次加入sds粉末4g、溴酚藍20mg、dtt 3.085g、tris-hcl(1m ph 6.8)10ml、甘油20ml，加ddh2o定容至40ml；
[0098]
③
10
×
transfer buffer：依次加入30.3g tris粉末、144g甘氨酸，加ddh2o定容至1l。使用時稀釋成1
×
transfer buffer，即10
×
transfer buffer 100ml+甲醇200ml+蒸餾水700ml。
[0099]
2)配制分離膠和濃縮膠
[0100]
①
按照表3的配方配制8％分離膠(10ml)：
[0101]
表3 8％分離膠配方
[0102]
成分含量ddh2o4.6ml30％acrylamide2.7ml1.5m ph 8.8 tris-hcl2.5ml10％aps100μl10％sds100μltemed4μl
[0103]
②
按照表4的配方配制5％的濃縮膠濃縮膠(5ml)：
[0104]
表4 5％的濃縮膠濃縮膠
[0105]
成分含量ddh2o3.4ml30％acrylamide0.83ml0.5m ph 6.8 tris-hcl0.63ml10％aps5μl10％sds5μltemed4μl
[0106]
3)蛋白凝膠電泳：取出電泳槽，組裝蛋白凝膠電泳裝置，小心地拔掉梳子，向電泳槽中加入1升1
×
sds running buffer，向上樣孔中依次加入蛋白marker及樣品。插上裝置電源，設置程序：恒壓100v，1.5h，開始電泳，直到溴酚藍接近分離膠下緣時，停止電泳。
[0107]
4)轉膜：取出pvdf膜和濾紙，甲醇浸泡pvdf膜30s。拆除電泳裝置，取出凝膠，按照順序組裝好轉膜夾(即“三明治”樣結構)，組裝過程中要注意趕走氣泡。組裝轉膜裝置，加入轉膜液，設置轉膜程序：恒流250ma，1.5h-2h，開始轉膜。
[0108]
5)封閉：轉膜結束后，取出pvdf膜并放入配制好的封閉液中，在室溫搖床上封閉1h；
[0109]
6)孵育一抗：用1
×
tbst洗膜數次，至牛奶沖洗干凈為止，用封閉液配制好一抗，并放入pvdf膜，孵育盒放入4℃冷庫的搖床上過夜孵育；
[0110]
7)用1
×
tbst洗膜三次，10min每次；
[0111]
8)用封閉液按1：5000比例配制二抗，并放入pvdf膜，孵育盒置于搖床上，在室溫下孵育1h；
[0112]
9)同上步驟清洗pvdf膜。
[0113]
10)顯影、曝光：在避光環境中，配制化學顯液液，并將pvdf膜放入化學顯液中，正面朝上，孵育1-3分鐘。將pvdf膜放入蛋白凝膠曝光系統中，正面朝上并滴加幾滴發光液(避免膜放干)，曝光，拍照，記錄和保存結果。
[0114]
5、慢病毒包裝法建立穩定細胞株(以6孔板為例)
[0115]
1)配制hek 293t細胞完全培養基：dmem培養基500ml+10％fbs+1％p/s，4℃保存。
[0116]
2)接種hek 293t細胞于6孔板中，當細胞密度達到80％后，換成無雙抗的培養基；
[0117]
3)準備轉染試劑及質粒:
[0118]
a液：opti-mem 100μl(50μl
×
2)，慢病毒包裝質粒pspax2和pmd2g各2μg輕輕混勻。
[0119]
b液：opti-mem 500μl(250μl
×
2)，lipo2000 20μl(10μl
×
2)，輕輕混勻，室溫靜置5min。
[0120]
4)將a液均分到兩個ep管中，分別加入shctrl、shpdgfd質粒各2μg，并分別加入200μl
[0121]
opti-mem，室溫放置5min；
[0122]
5)將b液均分到步驟3)中的ep管內，輕輕混勻，在室溫下孵育15min；
[0123]
6)將4)中混合液輕柔地滴加到6孔板中，隨后將孔板放入37℃co2培養箱培養；
[0124]
7)6h后更換新鮮無雙抗的培養基；
[0125]
8)轉染24h、48h后，分別用5ml的注射器吸取上清，再用直徑0.45μm濾器過濾上清至15ml離心管中；
[0126]
9)準備要侵染的細胞：將e14細胞常規消化，細胞計數后，以2*105/孔的密度接種于6孔板中；
[0127]
10)將步驟7)中過濾的上清滴加到孔板中，錫箔紙包裹孔板，離心600g，90min；
[0128]
11)吸走上清，加入新鮮培養基，重懸細胞，將細胞鋪均勻后，放入37℃co2培養箱培養；
[0129]
12)轉染72h后，換液，并加入嘌呤霉素(5μg/ml)進行藥篩，未被感染的細胞將死亡；
[0130]
13)每天換液，并加入嘌呤霉素藥篩，至細胞不再死亡為止；
[0131]
14)擴增細胞，凍存保種及進行后續試驗。
[0132]
6、集落形成及堿性磷酸酶(ap)染
[0133]
1)在一個6孔板的細胞培養板中，以2x105的細胞/孔的密度鋪入小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養層細胞，培養基為含10％胎牛血清的高糖dmem。
[0134]
2)第二天，等飼養層細胞達到90％的密度后，加入10μg/ml的絲裂霉素進行處理，終止細胞的分裂。放入培養箱處理3小時后，取出用pbs洗1次，換上常規胚胎干細胞培養基。
[0135]
3)小鼠胚胎干細胞進行消化、中和和重懸，細胞計數后以1000個細胞/孔的密度分別鋪入6孔板的細胞培養板中。
[0136]
4)培養板置于培養箱中培養7天，每2天換一次培養基。第7天，進行ap染實驗。根
據vector blue alkaline phosphatase substrate kit(sk-5300，vector laboratories)說明書的要求進行試劑的配制，然后將細胞培養基全部吸走，pbs洗1次后，按1.5ml/孔的體積將染劑加入到細胞中，避光孵育10分鐘。
[0137]
5)棄染劑，加pbs洗1次，加適量pbs后放在倒置顯微鏡觀察拍照，觀察染藍的克隆狀態及著程度，判斷細胞的自我更新狀態。
[0138]
7、小鼠胚胎干細胞的非定向誘導分化
[0139]
1)-lif培養的誘導分化：在小鼠胚胎干細胞培養液中不添加lif因子(-lif培養液)，并用這種培養液持續培養小鼠胚胎干細胞4天，可誘導小鼠胚胎干細胞向三胚層分化，每天收集樣品。
[0140]
2)擬胚體(embryo id body，eb)形成實驗：常規消化、收集小鼠胚胎干細胞，離心后，用去lif去2i(-lif-2i)的培養基重懸細胞，細胞計數后，以1
×
106/皿的密度將細胞接種于細菌培養皿中，-lif-2i的培養基培養。按不同時間點(0，3，6，9天)，在光鏡下觀察擬胚體大小、形態并拍照保存，收集蛋白和rna樣品。
[0141]
8、胚胎干細胞增殖實驗
[0142]
1)常規消化shctrl及shpdgfd胚胎干細胞，細胞計數后，向12孔板中每孔分別接種
[0143]1×
104/個細胞；
[0144]
2)培養板放入37℃co2培養箱中常規培養；
[0145]
3)培養72h和96h后，分別消化細胞，并進行細胞計數，統計、比較細胞數目。
[0146]
9、畸胎瘤形成實驗
[0147]
1)準備細胞：用10cm培養皿各養三盤shctrl及shpdgfd胚胎干細胞，待克隆長大、長滿，常規消化細胞，分別收集有10
×2×
106個細胞的懸液(每只裸鼠注射2
×
106個細胞，共8只裸鼠，考慮注射過程中細胞的損失，需多準備兩只裸鼠所需的細胞)；
[0148]
2)1000rpm，離心3min，棄上清；
[0149]
3)1ml pbs重懸細胞(每只裸鼠注射100μl細胞懸液)，將細胞懸液轉移至ep管，用錫箔紙包裹ep管(避免動物房傳遞窗中紫外線照射，使細胞失活)；
[0150]
4)注射小鼠胚胎干細胞(在動物房屏障區操作)：
[0151]
a.連接小鼠呼吸麻醉機裝置，加入異氟烷，開啟機器；
[0152]
b.將裸鼠放入呼吸機所連的密閉籠盒中；
[0153]
c.待裸鼠麻醉后，將其取出，口鼻放入呼吸機連接的軟管中，進行持續麻醉；
[0154]
d.用1ml注射器抽吸100μl細胞懸液，注意抽吸前需輕彈ep管，混勻懸液，避免細胞沉降到管底；
[0155]
e.用鑷子夾起裸鼠耳后皮膚，皮下注射細胞懸液，停頓大概30s后抽針，左側注射shctrl胚胎干細胞，右側注射shpdgfd胚胎干細胞，依次注射完8只裸鼠；
[0156]
5)每周觀察裸鼠生長狀態，4周后，取出裸鼠，麻醉后，依次擺好拍照；
[0157]
6)將裸鼠安樂死，取出皮下畸胎瘤組織，稱重，拍照；
[0158]
7)剪下少量畸胎瘤組織，用于后續的rna提取及western blot等實驗；
[0159]
8)將畸胎瘤組織放入4％pfa固定，固定液體積是組織體積10倍以上；
[0160]
9)送至servicebio生物科技公司進行石蠟切片及he染。
[0161]
10、基因芯片測序分析
[0162]
用shrna穩定敲低e14細胞系中pdgf-d的表達，構建shpdgf-d及對照組shctrl細胞系，大量擴增細胞，每個樣品收集不少于106個細胞的沉淀，加入1ml trizol裂解液，每組準備三個重復樣品。將收集的trizol樣品送到上海康成生物工程公司進行基因芯片測序分析。測序數據結果會傳到geo數據庫。
[0163]
實施例1
[0164]
本實施例對mescs進行擬胚(embryoid body，eb)培養模擬體內胚胎發育以誘導mescs向內皮分化。在mescs的內皮分化過程中，分別在0，4，7天收樣，進行rt-qpcr檢測。如圖1所示，隨著mescs內皮分化程度加深，rt-qpcr檢測到pdgf-d表達更加強烈，與內皮標記物ve-cadherin和vegfr2一致。由此說明，pdgf-d有利于mesc向血管分化。
[0165]
實施例2
[0166]
采用常規的小鼠胚胎干細胞、pdgf-d穩定敲低的小鼠胚胎干細胞分別構建對照組(shctrl)、pdgf-d穩定敲低組(shpdgfd)以開展本實施例的培養增殖實驗。
[0167]
1、mescs增殖實驗
[0168]
將參試的細胞分別以10000/孔的密度接種于12孔板中，在接種后的72h、96h，分別統計shctrl、shpdgfd的細胞數量。如圖2所示，與shctrl相比，shpdgfd的細胞數量明顯更多，說明敲低pdgf-d的表達能夠顯著增強了mescs的細胞增殖能力。
[0169]
采用shctrl、shpdgfd的穩定細胞系進行二次鋪板實驗。將細胞以200，400，800/孔的密度分別接種于6孔板中，7天后進行堿性磷酸酶染(堿性磷酸酶活性是胚胎干細胞自我更新能力的表型之一)，比較mescs形成克隆的大小和數量，從而判斷干細胞克隆形成能力的強弱。結果顯示，敲低pdgf-d的表達后，克隆數目明顯增多，克隆大小更大，說明抑制pdgf-d的表達能明顯增強mescs克隆形成的能力(圖3)。綜上所述，可得出抑制pdgf-d的表達能夠維持mescs自我更新以及增殖能力。
[0170]
2、mescs分化實驗
[0171]
用+lif的培養基培養shctrl、shpdgfd穩定細胞系，2天后在光鏡下拍照并進行堿性磷酸酶染(堿性磷酸酶活性是胚胎干細胞自我更新能力的表型之一)，結果如圖4所示，在shctrl中，細胞克隆變扁平，堿性磷酸酶活性低，細胞分化嚴重，而在shpdgfd中，細胞克隆形態立體、邊角圓潤，堿性磷酸酶活性高。用rt-qpcr檢測(圖5)胚胎分化各胚層標志物的表達，與shctrl相比，shpdgfd的胚胎分化的三個胚層的標志物表達均受到明顯抑制。說明當pdgf-d敲低后，mescs的多能性增強。western blot檢測干細胞多能性標志物，western blot實驗結果(圖6)進一步驗證，以hsp90作為內參，pdgf-d敲低后，sox2的表達明顯升高，而細胞分化的標志物的表達明顯下降，這表明，抑制pdgf-d的表達有利于維持mescs自我更新。
[0172]
進一步地，對本實施例培養得到的shctrl、shpdgfd穩定細胞系進行rt-qpcr檢測，以統計細胞中血管內皮細胞相關分子標記物cd133,cd34,cd31和vegf-a的表達。如圖7所示，與shctrl細胞相比，shpdgfd細胞的cd133,cd34,cd31和vegf-a的表達均顯著下降，由此說明pdgf-d敲低會抑制血管內皮細胞方向的分化。
[0173]
為了探明pdgf-d調控小鼠胚胎干細胞的分子作用機制，通過對mescs進行了基因芯片數據分析，以探索在小鼠胚胎干細胞中，穩定敲低pdgf-d后，pdgf-d對全基因組轉錄的影響。設置1.5倍的差異為標準，且p《0.05，進行差異轉錄本分析，篩選和確定本實施例構建
的shctrl、shpdgfd之間存在明顯差異表達基因。利用gene ontology(go分析)、gsea方法對shpdgf-d后下調的基因進行分析，go分析(圖8)發現pdgf-d敲低后下調的基因與血管新生、發育及血管內皮細胞分化具有密切聯系，gsea分析(圖9)發現pdgf-d敲低后下調的基因與促血管新生經典通路vegf有密切相關性。上述數據提示pdgf-d能夠促進血管內皮細胞的分化。
[0174]
實施例3
[0175]
本實施例建立由pdgf-d全身敲除小鼠作為實驗對象構成的實驗組以及由前述pdgf-d全身敲除小鼠同窩的野生型小鼠作為實驗對象構成的對照組，以探討pdgf-d對血管發育的作用。
[0176]
對同窩的野生型(wt)和pdgf-d敲除(ko)小鼠e12.5天胚胎中心臟和腦部的血管染情況進行比對：圖10展示了對實驗小鼠e12.5天胚胎的心臟進行切片染的取樣區域視圖，利用cd31對樣本進行染和統計，如圖11所示，pdgf-d敲除后，胚胎心臟中cd31的密度下降，證明心臟血管減少；圖12展示了對實驗小鼠e12.5天胚胎的腦部進行切片染的取樣區域視圖，利用cd31對樣本進行染和統計，如圖13所示，pdgf-d敲除后，胚胎腦中cd31的密度下降，證明腦血管減少。綜上，在ko小鼠中，心臟和腦的血管密度(cd31陽性)均比野生型要低，說明pdgf-d的敲除會抑制血管的發育。
[0177]
實施例4
[0178]
為了在動物體內驗證胚胎干細胞的分化潛能，本實施例按照以下步驟設置體內畸胎瘤形成實驗：分別將2
×
106個shctrl、shpdgfd細胞注射到裸鼠兩側耳后皮下間隙，裸鼠存在免疫缺陷，具有多向分化潛能的小鼠胚胎干細胞在裸鼠體內可分化成不同胚層的組織，形成畸胎瘤。
[0179]
4周之后取出畸胎瘤組織，如圖14所示，與對照組相比，在注射shpdgfd mescs的裸鼠中，畸胎瘤的大小明顯偏小。對畸胎瘤組織進行石蠟切片和he染，觀察結果如圖15所示，pdgf-d敲低后血管的管腔組織數目比對照組要明顯下降(見圖15中箭頭所指示的位置)。qrt-pcr分析顯示(圖16)，在pdgf-d穩定敲低mescs中，中胚層(血管從中胚層分化而來)標記物(hand1、brachyury、eomes)以及血管內皮細胞標記物(cd31、cdc42、ve-cadherin等)的表達均明顯下調。綜上所述，敲低pdgf-d的表達可抑制胚胎干細胞朝血管內皮細胞分化。
[0180]
實施例5
[0181]
設置本實施例的目的在于探究過量pdgf-d對mescs自我更新的影響。
[0182]
采用常規的小鼠胚胎干細胞、pdgf-d過表達的小鼠胚胎干細胞分別構建對照組細胞系(ctrl)、pdgf-d過表達的細胞系(pdgf-d oe)以開展本實施例的培養增殖實驗。
[0183]
對對照組細胞系和pdgf-d過表達的細胞系進行qrt-pcr檢測，檢測結果如圖17所示，據此說明pdgf-d過表達可促進小鼠胚胎干細胞中內皮細胞標記物ang2、vegf-a、vegfr-2、tie2的表達水平升高，證明pdgf-d可促進胚胎干細胞向內皮細胞方向分化。
[0184]
此外，如圖18所示，與ctrl相比，在pdgf-d oe中，sox2的表達下調，而血管內皮細胞標記物ve-cadherin和cd133的表達上調，但若加入mapk/erk通路的抑制劑pd0325901后，sox2的水平會回升，而血管內皮細胞標記物的表達會下降。上述實驗結果說明，pdgf-d是通過erk通路調控mescs自我更新和血管內皮分化的。
[0185]
實施例6
[0186]
本實施例通過在mescs的培養基中加入外源的pdgf-dd蛋白，以探究過量的外源pdgf-dd蛋白對mescs的影響。
[0187]
在外源加入pdgf-dd蛋白后處理24h和48小時后，以tubulin為內參，western blot結果(圖19)顯示sox2的表達下降。qrt-pcr檢測結果(圖20)表明，同樣在加入pdgf-dd蛋白處理mescs 4天后sox2和nanog的表達逐天下降。說明外源加入pdgf-dd蛋白可降低mescs自我更新的維持能力。
[0188]
在無血清無lif的培養條件下，用pdgf-dd蛋白刺激小鼠胚胎干細胞，在刺激15min、30min、60min對參試細胞進行western blot測試和堿性磷酸酶染實驗。western blot實驗結果(圖21)顯示，從15min開始，pdgf-dd蛋白刺激明顯地激活了小鼠胚胎干細胞erk信號通路，磷酸化erk1/2的表達明顯升高，與此一致的是，pdgfrβ受體在y1021、y751的兩個磷酸化位點也同時被激活，這兩個pdgfrβ受體的磷酸化位點是已經被證實的可被pdgf-d激活的位點。而加入pdgf-dd蛋白刺激的同時加入pdfgrβ中和抗體，磷酸化erk1/2的表達降低，如圖22所示。堿性磷酸酶染實驗(堿性磷酸酶活性是胚胎干細胞自我更新能力的表型之一)中顯示，在對照組中細胞圓潤，堿性磷酸酶活性高，分化程度低，pdgf-d過表達后堿性磷酸酶活性低，細胞分化嚴重。在過表達同時加入mapk/erk通路的抑制劑pd0325901，堿性磷酸酶活性高，細胞分化程度降低，如圖23所示。綜上，我們可以得出結論，pdgf-d可通過激活pdgfrβ,進而激活小鼠胚胎干細胞中的erk信號通路。
[0189]
以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
技術特征：
1.pdgf-d在調控干細胞增殖和/或分化中的應用。2.如權利要求1所述的應用，其特征在于：pdgf-d具有促進干細胞分化的作用。3.如權利要求2所述的應用，其特征在于：所述干細胞的分化方向為朝血管內皮細胞方向分化。4.一種利用pdgf-d促進干細胞分化的方法，其特征在于：利用pdgf-d通過激活pdgfrβ,進而激活干細胞中的erk信號通路。5.如權利要求4所述利用pdgf-d促進干細胞分化的方法，其特征在于：所述干細胞為胚胎干細胞。6.一種用于促進干細胞分化的添加劑，其特征在于：所述添加劑的活性成分包括pdgf-dd蛋白和/或pdgf-d基因的激動劑。7.一種提高胚胎干細胞的增殖能力的方法，其特征在于：包括下調pdgf-d的表達水平的步驟。8.一種用于提高干細胞的增殖能力的組合物，其特征在于：所述組合物中的活性成分包括pdgf-d抑制劑，所述pdgf-d抑制劑選自pdgf-d配體抑制劑、pdgf-d受體抑制劑、pdgf-d下游信號通路抑制劑中的至少一種。9.如權利要求8所述用于提高干細胞的增殖能力，其特征在于：所述pdgf-d受體抑制劑包括pdgfrβ抑制劑。10.如權利要求8所述用于提高干細胞的增殖能力，其特征在于：所述pdgf-d下游信號通路抑制劑包括mapk/erk通路抑制劑。
技術總結
本發明提供PDGF-D在調控干細胞增殖和/或分化中的應用。利用PDGF-D在干細胞中結合PDGFRβ受體從而激活下游Erk通路調控細胞干性，本發明通過調節PDGF-D的表達，從而實現了對胚胎干細胞的增殖、分化活動的有效調控。分化活動的有效調控。分化活動的有效調控。
