臭椿葉中甾體類化合物的制備及應用
1.本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種從植物臭椿葉中制備甾體類化合物的方法及這類化合物在抗腫瘤方面的應用。
背景技術：
2.臭椿(ailanthus altissima(mill.)swingle)為苦木科(simaroubaceae)臭椿屬(ailanthusdesf.)植物，廣泛分布于我國陜西省、甘肅省、四川省、云南省等地。其根皮入藥具有清熱燥濕、收澀固腸的功效，主治赤白久痢、腸風下血、帶下血崩、夢遺滑精等癥。現代化學與藥理學研究表明，臭椿中含有苦味素、甾體、香豆素、生物堿、木質素等成分，具有抗癌、抗病毒、抗炎、抗氧化等多種活性。
3.我國癌癥數據評估：據2015年中國居民主要疾病死亡匯率及死因構成報告顯示，因癌癥死亡人數達到1643.5萬(占比26.4％)，位居第一位。據權威機構發布的《2020-2026年中國腫瘤精準醫療行業市場分析預測及投資價值咨詢報告》顯示：2018年全球新增癌癥患者達1810萬人，因癌癥死亡人數為960萬人。我國是人口大國，也是癌癥高發國家，2018年我國新發病例數380.4萬例，占全球癌癥新發病人數的20％以上，肺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、女性乳腺癌是我國主要的常見惡性腫瘤，約占全部新發病例的77％。其中，我國肝癌發病和死亡人數約占全球一半，肝癌位居我國惡性腫瘤致死率第2～3位，5年生存率僅為14.1％。中國人的肝癌存在生存率低、死亡率高的情況，如何有效降低肝癌相關負擔仍是中國公共衛生和慢性病防控領域亟待解決的重大問題。目前，超過60％的抗癌藥物來自天然產物，天然產物為化療藥物的發現提供了重要來源，為維護人類健康做出了巨大貢獻。因此，在天然產物中尋具有抗癌潛力的藥物具有重要意義。
技術實現要素：
4.本發明的目的是提供4種從苦木科臭椿屬植物臭椿(ailanthus altissima(mill.)swingle) 葉中分離得到的甾體類化合物，結構如下所示：
1.46 (3h,s)，1.20(3h,s)，0.87(3h,s)；剩余質子信號均為脂肪族碳上的質子信號且化學位移均在 3以內。依據上述信號推測化合物1可能為甾體類化合物。
13
c nmr中共給出24個碳信號，包括α，β不飽和酮碳基片段中的3個碳信號：δ
c 198.9，167.5，127.1；一個酯羰基信號：δ
c 177.6；兩個連氧碳信號：δ
c 88.4，68.4；三個甲基碳信號：26.8，17.2，13.2；剩余碳信號均為脂肪族碳。根據hmbc譜與1h-1
h cosy中的相關信號表明化合物1具有甾體四環骨架。對數據的進一步分析發現，δ
c 198.9(c-3),127.1(c-4)與167.5(c-5)低場區信號以及h-4與c
??
2,c-6和c-10；h-1與c-3之間的hmbc相關表明，α，β-不飽和羰基連接在a環上。hmbc 譜中h-21與c-17,c-20,c-22，h-22與c-24，h-23與c-20的相關信號與c-20(δ
c 88.7)的去屏蔽信號證實該化合物的17位側鏈為五元內酯環。此外h-7與c-5,c-9,c-14間的hmbc相關信號證明該化合物的7位被羥基取代。化合物1的相對構型可通過noesy譜進行確定。 h-7/h-18，h-18/h-8，h-8/h-19間的noe相關信號證明h-7,8以及18,19-ch3均為β-構型； h-9/h-14，h-14/h-17間的noe相關信號證明h-9,14,17均為α-構型。對于21-ch3而言，由于其處于17側鏈上而c-17與c-20間為可自由旋轉的碳碳單鍵，無法通過noesy譜確定其相對構型。因此結合生源以及文獻報道的數據將其暫定為β-構型。化合物的絕對構型是通過比較計算和實測ecd確定的。化合物實測ecd曲線與計算的7r,8s,9s,10r,13s,14s,17s, 20s構型ecd曲線能夠較好的吻合，因此確定化合物的絕對構型為7r,8s,9s,10r,13s,14s, 17s,20s，并命名為chouchunsteride a。
19.chouchunsteride b(2):白粉末，uv(meoh)λ
max
(logε)：240.5 nm(0.10)；高分辨質譜hresims給出準分子離子峰[m+na]
+
(m/z):355.2246(calcd forc
21h32
nao3:355.2244),結合1h nmr以及
13
c nmr核磁共振譜得出分子式為c
21h32
o3，計算不飽和度為6。1h nmr高場區僅觀察到一個烯烴質子信號：δ
h 5.73(1h,br s)；此外還觀察到兩個連氧碳上的質子信號：δ
h 4.50(1h,ddd,j＝7.8,5.7,2.2hz)，4.14(1h,dd,j＝9.8,6.0hz)；以及三個甲基信號：δ
h 1.31(3h,d,j＝6.0hz)，1.19(3h,s)，0.92(3h,s)；剩余質子信號均為脂肪族碳上的質子信號且化學位移均在3以內。依據上述信號推測化合物2可能為甾體類化合物。
13
c nmr中共給出21個碳信號，包括α,β不飽和酮碳基片段中的3個碳信號：δ
c 199.7， 171.2，124.1；兩個連氧碳信號：δ
c 73.1，66.7；三個甲基碳信號：23.8，17.5，14.2；剩余碳信號均為脂肪族碳。根據hsqc譜對該化合物的碳氫數據進行了全歸屬。依據hmbc譜中h-4與c-2,c-6,c-10，h-18與c-1,c-5,c-9,c-10間的相關信號以及1h-1
h cosy譜中h-1/h
??
2間的相關信號可確定a環具有一個α,β不飽和酮碳基片段并通過c-5,c-10與b環相連。 hmbc譜中h-8與c-6,c-10,c-11,c-13,c-15的相關信號以及1h-1
h cosy譜中h-6/h-7， h-7/h-8，h-8/h-9，h-9/h-11，h-11/h-12，h-8/h-14的相關信號證明化合物2的b環以及c 環均為6元環且b、c環通過c-8,c-9相連。h-19與c-12,c-13,c-14,c-17，h-16與c-13， h-20/c-13,16,17，h-21/c-17間的hmbc相關證明d環為五元環，且17位具有一個2-羥基
??
乙基片段。化合物2的相對構型是通過noesy確定的，而20位羥基處于柔性鏈中，由于碳碳單鍵可進行自由旋轉而無法利用空間相關譜如noesy或roesy譜進行確定。而20位的間位17位也存在一個仲醇羥基，構成了1,3-二羥基片段，符合制備丙叉衍生物的基本要求，因此可通過制備丙叉衍生物的方法確定20位羥基相對構型。根據該化合物丙叉產物2a的 noesy光譜中，h-9/h-14、h-14/h-16、h-14/h-17存在noesy相關以及h-8/h
3-18、h-8/h3??
19、h
3-19/h-20的noesy相關確定h-9、h-14、h-16和h-17的為α-構型，而h-8、h
3-18、 h
3-19和h-20的相
對構型為β-構型，通過對比實測和計算ecd譜圖確定了化合物的絕對構型為8s,9s,10r,13s,14s,16s,17s,20s，并命名為chouchunsteride b。
[0020]
化合物1,2與2的縮醛化產物2a的核磁數據歸屬如表1所示。
[0021]
表1化合物1,2,2a的1h(600mhz)和
13
c(150mhz)在cdcl3中的nmr數據
[0022][0023][0024]
chouchunsteride c(3):白粉末，uv(meoh)λ
max
(logε):240.5 nm(0.20)；高分辨質譜hresims給出準分子離子峰[m+na]
+
(m/z):353.2088(calcd forc
21h30
nao3:353.2087),結合1h nmr以及
13
c nmr核磁共振譜得出分子式為c
21h30
o3，計算不飽和度為7。1h nmr高場區僅觀察到一個烯烴質子信號：δ
h 5.74(1h,d,j＝1.7hz)；此外還觀察到一個連氧碳上的質子信號：δ
h 4.59(1h,ddd,j＝7.5,6.5,4.3hz)，以及三個甲基信號：δ
h 2.22(3h,s)，1.21(3h,s)，1.01(3h,s)；剩余質子信號均為脂肪族碳上的質子信號且化學位移均在3以內。依據上述信號推測化合物3可能為甾體類化合物。
13
c nmr中共給出21 個碳信號，包括α,β不飽和酮碳基片段中的3個碳信號：δ
c 199.5，170.8，124.2；一個酮碳基信號：δ
c 213.1；一個連氧碳信號：δ
c 72.3；三個甲基碳信號：32.7，17.5，14.9；剩余碳信號均為脂肪族碳。依據hmbc譜以及1h-1
h cosy中的相關信號，化合物3可能具有與化合物 2相似的平面結構。對數據的進一步分析發現化合物3可能為化合物2的20位羥基被氧化為酮碳基的產物。hmbc譜中h-21/c-17,20，h-16/c-20的相關信號也證明該化合物的20位為酮碳基。化合物3為母核含有21個碳原子的甾體衍生物，母核中的手性中心通常較
為固定。但17位側鏈可能有α或者β兩種構型，此外16位也少見有羥基取代的報道。noesy譜中，依據h-16/h-14，h-14/h-17間的相關信號確定17位側鏈為少見的β構型，16位羥基為β構型。化合物的絕對構型是通過比較計算和實測ecd確定的。化合物實測ecd曲線與計算的 8s,9s,10r,13s,14s,16s,17r構型ecd曲線能夠較好的吻合，因此確定化合物的絕對構型為 8s,9s,10r,13s,14s,16s,17r，并命名為chouchunsteride c。
[0025]
chouchunsteride d(4):白粉末(甲醇)，uv(meoh)λ
max
(logε): 202.0nm(0.51)；高分辨質譜hresims給出準分子離子峰[m+h]
+
(m/z):333.2416(calcd forc
21h33
o3:333.2424),結合1h nmr以及
13
c nmr核磁共振譜得出分子式為c
21h32
o3，計算不飽和度為6。1h nmr高場區僅觀察到一個烯烴質子信號：δ
h 5.35(1h,dd,j＝5.3,2.6hz)；此外還觀察到兩個連氧碳上的質子信號：δ
h 4.58(1h,ddd,j＝7.1,6.8,4.5hz)，3.52(1h,m)以及三個甲基信號：δ
h 2.22(3h,s)，1.03(3h,s)，0.97(3h,s)；剩余質子信號均為脂肪族碳上的質子信號且化學位移均在3以內。依據上述信號推測化合物4可能為甾體類化合物。
13
c nmr 中共給出21個碳信號，包括一個酮碳基信號：δ
c 213.3；一對雙鍵碳信號：δ
c 140.8，121.2；兩個連氧碳信號：δ
c 72.3，71.7；三個甲基碳信號：32.6，19.4，14.6；剩余碳信號均為脂肪族碳。根據hsqc譜對該化合物的碳氫數據進行了全歸屬。依據hmbc譜以及1h-1
h cosy中的相關信號，化合物4可能具有與化合物4相似的平面結構。對數據的進一步分析發現化合物4可能具有孕甾烷特征的5,6位雙鍵，a環的3位不存在α,β不飽和酮碳基片段，而被羥基取代。hmbc譜中h-6/c-4，h-18/c-1,5,9,10以及1h-1
h cosy譜中h-1/h-2,h-2/h-3,h
??
3/h-4的相關信號證實了上述觀點。通過noesy譜并結合生源可確定化合物4的相對構型。其3位碳的化學位移為71.7，與文獻中報道的同類化合物3位化學位移基本一致，因此確定 3位羥基為β構型。通過對比實測和計算ecd譜圖確定了化合物的絕對構型為3s,8s,9s,10r, 13s,14s,16s,17r，并命名為chouchunsteride d。
[0026]
化合物3,4的核磁數據歸屬如表2所示。
[0027]
表2化合物3,4的1h(600mhz)和
13
c(150mhz)在cdcl3中的nmr數據
[0028][0029]
對本發明所述的四個甾體類化合物對腫瘤細胞hep3b和hepg2的細胞毒活性及作用機制進行了考察，體外細胞實驗結果表明化合物1對hepg2細胞具有顯著的細胞毒活性，ic
50
值為4.03μm。因此本發明所述的甾體類化合物具有進一步開發肺癌藥物的前景。
[0030]
一種藥物組合物，包含所述從臭椿葉中分離得到的甾體類化合物中任一種或多種或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的輔料和載體。
[0031]
一種臭椿葉提取物，包含所述四種甾體類化合物中任一種或多種。
[0032]
本發明還提供所述從臭椿葉中分離得到的甾體類化合物或所述藥物組合物或所述臭椿葉提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0033]
本發明的優點在于，所述化合物均為立體構型確定的光學純化合物，同時其抗癌活性強，具有進一步開發的價值。
附圖說明
[0034]
圖1化合物1的uv譜；
[0035]
圖2化合物1的hresims譜；
[0036]
圖3化合物1的1h nmr譜(600mhz,cdcl3)；
[0037]
圖4化合物1的
13
c nmr譜(150mhz,cdcl3)；
[0038]
圖5化合物1的hsqc譜(600mhz,cdcl3)；
[0039]
圖6化合物1的hmbc譜(600mhz,cdcl3)；
[0040]
圖7化合物1的1h-1
h cosy譜00mhz,cdcl3)；
[0041]
圖8化合物1的noesy譜(600mhz,cdcl3)；
[0042]
圖9化合物1的dept譜(600mhz,cdcl3)；
[0043]
圖10化合物1的ecd譜；
[0044]
圖11化合物2的uv譜；
[0045]
圖12化合物2的hresims譜；
[0046]
圖13化合物2的1h nmr譜(600mhz,cdcl3)；
[0047]
圖14化合物2的
13
c nmr譜(150mhz,cdcl3)；
[0048]
圖15化合物2的hsqc譜(600mhz,cdcl3)；
[0049]
圖16化合物2的hmbc譜(600mhz,cdcl3)；
[0050]
圖17化合物2的1h-1
h cosy譜(600mhz,cdcl3)；
[0051]
圖18化合物2的noesy譜(600mhz,cdcl3)；
[0052]
圖19化合物2的ecd譜；
[0053]
圖20化合物2a的1h nmr譜(600mhz,cdcl3)；
[0054]
圖21化合物2a的
13
c nmr譜(150mhz,cdcl3)；
[0055]
圖22化合物2a的hsqc譜(600mhz,cdcl3)；
[0056]
圖23化合物2a的hmbc譜(600mhz,cdcl3)；
[0057]
圖24化合物2a的noesy譜(600mhz,cdcl3)；
[0058]
圖25化合物3的uv譜；
[0059]
圖26化合物3的hresims譜；
[0060]
圖27化合物3的1h nmr譜(600mhz,cdcl3)；
[0061]
圖28化合物3的
13
c nmr譜(150mhz,cdcl3)；
[0062]
圖29化合物3的hsqc譜(600mhz,cdcl3)；
[0063]
圖30化合物3的hmbc譜(600mhz,cdcl3)；
[0064]
圖31化合物3的1h-1
h cosy譜(600mhz,cdcl3)；
[0065]
圖32化合物3的noesy譜(600mhz,cdcl3)；
[0066]
圖33化合物3的ecd譜；
[0067]
圖34化合物4的uv譜；
[0068]
圖35化合物4的hresims譜；
[0069]
圖36化合物4的1h nmr譜(600mhz,cdcl3)；
[0070]
圖37化合物4的
13
c nmr譜(150mhz,cdcl3)；
[0071]
圖38化合物4的hsqc譜(600mhz,cdcl3)；
[0072]
圖39化合物4的hmbc譜(600mhz,cdcl3)；
[0073]
圖40化合物4的1h-1
h cosy譜(600mhz,cdcl3)；
[0074]
圖41化合物4的noesy譜(600mhz,cdcl3)；
[0075]
圖42化合物4的ecd譜；
[0076]
圖43化合物1-4的實測ecd與計算ecd譜。
具體實施方式
[0077]
下面所列實施例有助于本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0078]
實施例1
[0079]
臭椿葉中甾體類化合物1-4的制備方法，具體操作如下：
[0080]
(1)取干燥的臭椿葉50kg，以75％工業乙醇回流提取3次，每次3小時。濃縮提取液得乙醇粗提物4000g，浸膏采用二氯甲烷及正丁醇萃取。
[0081]
(2)將上述萃取液合并濃縮得浸膏(2500g)，所得浸膏經硅膠柱譜，以二氯甲烷-甲醇 100:1-1:1(v/v)進行梯度洗脫，共收集到5個流分a-e。
[0082]
(3)流分c(72g)經hp-20柱譜以乙醇-水系統20％,40％,60％,80％,90％梯度洗脫，得到了3個流分c1、c2、c3。
[0083]
(4)將流分c3進一步經ods柱譜以甲醇-水系統20:80-90:10(v/v)梯度洗脫得到了4 個流分c
.3.1-c
3.4
。
[0084]
(5)將流分c
3.2
(6g)經硅膠柱譜以二氯甲烷-甲醇系統50:1-1:1(v/v)進行梯度洗脫，得流分c
3.2.1-c
3.2.8
。
[0085]
(6)將流分c
3.2.2
經制備及半制備hplc以乙腈-水(50:50,v/v,2.5ml/min)純化得到化合物1(6mg)。流分c
3.2.3
經以乙腈-水(43:57,v/v,2.5ml/min)純化得到化合物2(5mg)、化合物3(7.2mg)、化合物4(3mg)。
[0086]
實施例2
[0087]
所述臭椿葉中甾體類化合物1-4在體外對癌細胞hep3b、hepg2的抗腫瘤活性考察。
[0088]
利用mtt法，考察化合物1-4對腫瘤細胞hep3b和hepg2的細胞毒活性實驗。將細胞放置于96孔板中，用培養液靜置培養12小時,使用不同濃度的化合物處理hep3b和hepg2 細胞，并用索拉非尼做陽性對照組。作用72小時后，加入20μl mtt試劑并在37℃放置4 小時，用酶標儀在490nm波長下對不同濃度處理的細胞進行檢測。結果表明，化合物1對 hepg2細胞有顯著的細胞毒活性，ic
50
值為4.03μm，化合物2與化合物4顯示出較好的細胞毒活性，對hep3b細胞的ic
50
值分別為47.08μm和31.51μm(表3)。
[0089]
表3細胞毒活性
[0090][0091]
細胞毒性用3次實驗的平均值
±
sd表示；以索拉非尼為陽性對照。
技術特征：
1.一種臭椿葉中甾體類化合物，其特征在于，其為如下所示化合物中任一種：2.根據權利要求1所述的臭椿葉中甾體類化合物，其特征在于，所述化合物由苦木科臭椿屬植物臭椿(ailanthus altissima(mill.)swingle)葉中分離得到。3.一種權利要求1或2所述臭椿葉中甾體類化合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)取干燥的臭椿葉以70-80％工業乙醇提取，濃縮提取液得浸膏，浸膏采用二氯甲烷與正丁醇萃取；(2)將二氯甲烷與正丁醇萃取液濃縮所得浸膏經硅膠柱譜，以二氯甲烷-甲醇或-甲醇100:1-1:1進行梯度洗脫，共收集到5個流分a-e；(3)將流分c進一步經hp-20大孔吸附樹脂柱譜以乙醇-水梯度洗脫，得3個流分c1、c2、c3；(4)將所得流分c3進一步經ods柱譜以甲醇-水系統20:80-90:10梯度洗脫得到了4個流分c
3.1-c
3.4
；(5)將所得流分c
3.2
經硅膠柱譜以二氯甲烷-甲醇系統50:1-1:1進行梯度洗脫，所得流分c
3.2.1-c
3.2.8
；(6)所得流分c
3.2.2
經制備與半制備hplc以乙腈-水(45:55-50:50)純化得到化合物1，流分c
3.2.3
經制備與半制備hplc以乙腈-水(50:50-30:70)純化得到化合物2-4。4.根據權利要求3所述的臭椿葉中甾體類化合物的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述提取為回流提取，提取3-5次，每次2-3小時。5.根據權利要求3所述的臭椿葉中甾體類化合物的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述臭椿葉是指苦木科臭椿屬植物臭椿(ailanthus altissima(mill.)swingle)的干燥葉子。6.根據權利要求3所述的臭椿葉中甾體類化合物的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述乙醇-水溶液中，乙醇體積濃度為20％-90％。7.一種藥物組合物，其特征在于，包含權利要求1所述臭椿葉中甾體類化合物中任一種
或多種或該化合物在藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的輔料和載體。8.一種臭椿葉提取物，其特征在于，包含權利要求1所述臭椿葉中甾體類化合物。9.一種權利要求1或2所述臭椿葉中甾體類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。10.一種權利要求7所述藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
技術總結
臭椿葉中甾體類化合物的制備及應用，屬于醫藥技術領域，具體涉及從苦木科臭椿屬植物臭椿(Ailanthus altissima(Mill.)Swingle)葉中提取分離的4個新的甾體類化合物chouchunsteride A-D，它們具有相同甾體母核，通過反復的硅膠、ODS柱層析、HPLC柱譜分離得到。并通過測試它們對Hep3B,HepG2肝癌細胞的抑制作用，對這些化合物抗腫瘤活性進行了考察。察。察。
