一種核酸提取磁珠的泡騰片、合成方法及其應用與流程
1.本發明涉及核酸提取技術領域，特別涉及一種核酸提取磁珠的泡騰片、合成方法及其應用。
背景技術：
2.目前，市場上常規的核酸提取用磁珠的類型為水分散溶液，該產品類型存在顯著的存儲、運輸問題，即需要低溫條件（2-8 ℃）存儲、存儲容器密封性要求高，且液體試劑質量大、可選擇的運輸方式有限（液體無法空運）。對于出口市場，成本、時效均是重要的考量因素。
3.僅將產品磁珠制成粉末存在較大問題，即干粉在溶液中自主分散困難。在主要的應用場景（核酸提取）下，而磁珠試劑的重懸分散性、速度等會影響磁珠的性能和使用體驗。另一方面，在核酸提取試劑使用過程中，磁珠的用量很小，每個樣本的提取僅有0.5-2 mg，磁珠的干粉難以準確稱量、分配。
4.磁珠泡騰片有一篇文獻報道（analytica chimica acta, 2016, 118-127），該文獻報道了將fe3o4納米顆粒（每個泡騰片中磁納米顆粒含量10-20 mg）和碳酸鈉、磷酸二氫鈉制備的泡騰片，在離子液體的輔助下應用于水中的有機農藥殘留的萃取回收，利用的是“相似相溶原則”，水溶液中的離子強度對該過程的影響有限。直接用此方法制備的核酸提取磁珠的泡騰片（每個泡騰片磁珠含量0.5-2 mg）在核酸提取試劑中無法應用，因為泡騰片會引入大量的鹽，影響到水中的離子分布，進而影響了依靠“靜電吸附原則”的核酸提取過程。另一方面，我們觀測到，該方法制備的泡騰片磁珠，無法長時間保存，會出現磁珠氧化，性能下降等情況。
技術實現要素：
5.為了改善上述技術問題，本發明提供一種核酸提取磁珠的泡騰片、合成方法及應用。
6.第一方面，本發明提供一種核酸提取磁珠的泡騰片，包括以下組分：核酸提取磁珠、保護劑、崩解劑；其中，崩解劑包括酸劑和堿劑。
7.在一些實施方案中，崩解劑中的堿劑選自碳酸鹽和碳酸氫鹽中的一種或多種；其中，碳酸鹽和碳酸氫鹽是無機鹽；優選地，碳酸鹽選自碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銨、碳酸鈣、碳酸鎂中的一種或多種，和/或碳酸氫鹽選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫銨、碳酸氫鎂中的一種或多種；更優選地，崩解劑中的堿劑選自碳酸鈉和/或碳酸氫鈉。
8.在一些實施方案中，崩解劑中的酸劑選自無機酸、有機酸、和/或無機鹽中的一種或多種；優選地，無機鹽為強酸弱堿鹽；優選地，無機鹽選自磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等磷酸鹽中的一種或多種，和/或有機酸選自檸檬酸、
蘋果酸、抗壞血酸、脫氫抗壞血酸、酒石酸等中的一種或多種；更優選地，無機酸選自磷酸二氫鈉和/或磷酸氫二鉀，有機酸選自檸檬酸、蘋果酸和/或酒石酸；最為優選地，崩解劑中的酸劑選自檸檬酸、蘋果酸和/或酒石酸。
9.在一些實施方案中，崩解劑中作為堿劑或酸劑的無機鹽組分含量小于60%，優選為40%-60%，更優選為50%-60%。
10.在一些實施方案中，崩解劑中的堿劑與酸劑的質量比為20-60:40-80，優選為40-60:60-40，更優選為40:60。
11.在一些實施方案中，崩解劑用量的比例為10-95%，優選為90-95%。
12.在一些實施方案中，所述保護劑為抗氧化或防潮保護劑。
13.在一些實施方案中，所述抗氧化保護劑化或防潮保護劑選自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨酯、bsa（牛血清蛋白）、檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉、二苯酮、水楊酸乙基己酯、甲氧基肉桂酸乙基己酯、西諾沙酯、甲氧基肉桂酸辛酯、對-胺基苯甲酸等中的一種或多種，優選為聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨酯中的一種或多種；和/或，保護劑用量的比例為0.1-5%，優選為1-2%。
14.在一些實施方案中，核酸提取磁珠選自硅羥基磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠等中的至少一種，優選為硅羥基磁珠、羧基磁珠中的至少一種，更優選為硅羥基磁珠；和/或，核酸提取磁珠的粒徑范圍選自100-1200 nm；和/或，核酸提取磁珠的表面材料選自二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酸、多巴胺、聚羧甲基甘油醛、聚氨酯、聚甲基丙烯酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯等不同的材料中的一種或多種，優選為二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸；和/或，核酸提取磁珠的用量比例為0.1-5%，優選為1-2%。
15.在一些實施方案中，上述核酸提取磁珠的泡騰片還包括防腐劑。
16.在一些實施方案中，防腐劑選自疊氮化鈉、山梨醇、山梨酸鉀、苯氧乙醇、多菌清、百菌靈中的一種或幾種，優選為疊氮化鈉和/或山梨酸鉀；和/或，防腐劑的用量比例為0-3 %，優選為1%。
17.在一些實施方案中，核酸提取磁珠、保護劑、崩解劑、防腐劑的質量比為1:1:100:1。
18.在一些實施方案中，泡騰片的直徑大小范圍為1-15 mm，優選為3-6 mm，和/或，泡騰片的厚度為3-5 mm，優選為3 mm；和/或，泡騰片的緊實程度以硬度表征，范圍為10-200n，優選的硬度為100n。
19.在一些實施方案中，泡騰片壓制時壓力范圍為0.1-5 mpa，優選為0.5 mpa；和/或，泡騰片壓制時間范圍為5-20s，優選為10s。
20.第二方面，本發明提供上述核酸提取磁珠的泡騰片的合成方法，包括以下步驟：將各組分分別用瑪瑙研缽碾碎后，按照一定比例混合均勻，利用壓片機在一定壓力下壓制成泡騰片。
21.第三方面，本發明提供上述核酸提取磁珠的泡騰片在核酸提取中的應用。
22.在一些實施方案中，核酸提取的樣本選自拭子、全血、血漿、血清、動物組織勻漿液、植物組織勻漿液、土壤、糞便、細菌、腦脊液、耳槽、精液等中的至少一種。
23.在一些實施方案中，拭子為口腔拭子。
24.在一些實施方案中，核酸提取的樣本為全血、血清、血漿。
25.在一些實施方案中，核酸為dna或rna。
26.在一些實施方案中，核酸為新型冠狀病毒核酸。
27.第四方面，本發明提供一種核酸提取的試劑盒，包括上述核酸提取磁珠的泡騰片。
28.有益效果本發明主要是將核酸提取磁珠與保護劑、崩解劑、防腐劑等多種不同的組分，在特定壓力下壓制成不同的泡騰片，并成功應用于核酸提取試劑中。同時，通過老化實驗結果顯示，該磁珠泡騰片具有良好的穩定性。
29.附圖說明
30.圖1顯示了磁珠泡騰片在水中的不同崩解階段和情況。
31.圖2顯示了磁珠泡騰片、磁珠原分散液在37攝氏度恒溫烘箱中處理，不同時間取出進行新冠假病毒rna提取的穩定性實驗結果。
32.圖3顯示了磁珠泡騰片、磁珠原分散液在60攝氏度恒溫烘箱中處理，不同時間取出進行新冠假病毒rna提取的穩定性實驗結果。
33.圖4顯示了加入檸檬酸的泡騰片在空氣中10min的潮解情況（未加入保護劑和防腐劑）。
34.圖5顯示了加入檸檬酸的泡騰片在室溫下放置0、1、3天后的外觀圖（未加入保護劑和防腐劑）。
具體實施方式
35.下文將結合具體實施例對本發明的技術方案做更進一步的詳細說明。應當理解，下列實施例僅為示例性地說明和解釋本發明，而不應被解釋為對本發明保護范圍的限制。凡基于本發明上述內容所實現的技術均涵蓋在本發明旨在保護的范圍內。
36.除非另有說明，以下實施例中使用的原料和試劑均為市售商品，或者可以通過已知方法制備。
37.實施例1：崩解速度按下表1中所示試劑分別用瑪瑙研缽研磨破碎后，按表中添加量混合均勻用壓片機在0.5 mpa壓力下壓制10 s時間，制成直徑6 mm的泡騰片片劑。將磁珠泡騰片分別投入水中，靜置等待崩解，錄像觀測泡騰片崩解、分散情況。
38.表1 不同核酸提取磁珠的泡騰片的組分和崩解時間
崩解時間的結果如表1所示，序號1-6號不同核酸提取磁珠的泡騰片的崩解時間分別為3542、3038、68、43、62、80秒。
39.崩解分散情況如圖1所示，從左至右，依次為序號1-6號。
40.分析上述實驗結果可知：1) 不同崩解劑造成磁珠泡騰片的崩解速度差異明顯：以碳酸鈉與磷酸二氫鹽及磷酸一氫鹽等作為崩解劑的泡騰片（序號1-2），在水中崩解困難，分散性極差；以碳酸氫鈉與檸檬酸、蘋果酸、酒石酸等作崩解劑后的泡騰片（序號4-6）在水中崩解迅速，分散更為均勻。
41.2) 添加保護劑、防腐劑可能造成磁珠泡騰片的崩解速度減緩，但通過上述實驗，保護劑和防腐劑帶來的崩解速度的減緩仍在可控可預期的范圍內，且崩解后分散性、均勻性無顯著衰減。
42.實施例2：新冠2019-ncov假病毒rna提取將40.3 mg na2co3、59.7 mg檸檬酸、1 mg硅羥基磁珠、1 mg聚乙二醇和1 mg山梨酸鉀用瑪瑙研缽研磨粉碎，混合后以0.5 mpa壓力壓制10 s形成直徑6 mm的磁珠泡騰片1。
43.將52.9 mg nahco3、47.1 mg檸檬酸、1 mg硅羥基磁珠、1 mg聚氨酯和1 mg疊氮化鈉以相同方式制得磁珠泡騰片2。
44.將磁珠泡騰片投入不含磁珠的裂解結合液中，靜置等待崩解分散。將已添加新冠2019-ncov假病毒( 添加后終濃度為10
5 copies/ml ) 的口腔拭子樣本加入泡騰片已崩解分散完成的裂解結合液中，經裂解、結合、去蛋白、鹽洗滌、洗脫的磁珠法新冠核酸提取流程后，取洗脫液加入熒光定量pcr試劑中，進行定量擴增。將結果與磁珠原分散液、陰性對照，進行對比。
45.磁珠法新冠核酸提取流程參照市售產品：magbetter
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磁珠法病毒核酸提取試劑盒——mnapure virus rna kit中說明書所述提取流程。
46.表2中的磁珠原分散液的組分為：硅羥基磁珠的水分散液；陰性對照為ddh2o。
47.表2新冠2019-ncov假病毒核酸提取結果
結果顯示：該磁珠泡騰片可在新冠2019-ncov假病毒rna提取實驗中正常使用，且提取性能與含磁珠的原分散液相當。
48.實施例3：不同種類磁珠的新冠2019-ncov假病毒rna提取對比分別將崩解劑1(40.3 mg na2co3)、崩解劑2(59.7 mg檸檬酸)、保護劑(1 mg聚乙二醇)和防腐劑(1 mg山梨酸鉀)用瑙研缽研磨粉碎，分別與1 mg硅羥基磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠混合均勻，按實施例2中流程進行新冠假病毒rna提取，取洗脫液加入熒光定量pcr試劑中，進行定量擴增。將結果進行對比。
49.表3不同種類磁珠的新冠2019-ncov假病毒rna提取結果顯示：1) 硅羥基、羧基和氨基磁珠均可在泡騰片環境下進行新冠假病毒rna提??；2) 此條件下，羧基磁珠和氨基磁珠的提取性能均較硅羥基磁珠差，且羧基磁珠重復性略低于其他兩款磁珠；3) 硅羥基磁珠的提取性能最好，與含磁珠的原分散液提取性能相當。
50.實施例4：磁珠泡騰片應用不同試劑盒提取將40.3 mg na2co3、59.7 mg檸檬酸、一定量的硅羥基磁珠、1 mg聚乙二醇和1 mg山梨酸鉀用瑪瑙研缽研磨粉碎，混合均勻用壓片機在0.5 mpa壓力下壓制10 s時間，制成泡騰片。
51.將磁珠泡騰片分別將口腔拭子dna提取試劑盒、全血dna提取試劑盒和植物dna提取試劑盒中的磁珠進行替換，等待泡騰片崩解分散后，使用對應試劑盒內的試劑及對應樣本，依據試劑盒說明書流程進行樣本提取。使用nanodrop對洗脫液進行結果測定。結果與原產品分散液（含磁珠）進行對比。
52.表4磁珠泡騰片應用不同試劑盒提取結果顯示：1) 磁珠泡騰片在口腔拭子dna提取試劑盒、全血dna提取試劑盒和植物dna提取試劑盒中均可正常進行提取；2) 磁珠泡騰片在相對原磁珠含量較高的情況下，對樣本核酸的提取量均較原產品高。
53.實施例5：穩定性測試將每片40.3 mg na2co3、59.7 mg檸檬酸、1 mg硅羥基磁珠、1 mg聚乙二醇和1 mg山梨酸鉀用瑪瑙研缽研磨粉碎，混合均勻用壓片機在0.5 mpa壓力下壓制10 s時間，制成泡騰片。將半數磁珠泡騰片置于37攝氏度恒溫烘箱中，其余磁珠泡騰片置于60攝氏度恒溫烘箱中，密封靜置。置于37攝氏度恒溫烘箱中的磁珠泡騰片分別在0、1、3、5、7、14、21、28、56、84、112、140、168和196天時取出進行新冠假病毒rna提取測試，取洗脫液加入熒光定量pcr試劑中，進行定量擴增，進行穩定性(老化)測試。置于60攝氏度恒溫烘箱中的磁珠泡騰片分別在0、1、3、5、7、14、21和28天時取出進行新冠假病毒rna提取測試，取洗脫液加入熒光定量pcr
試劑中，進行定量擴增，進行穩定性(老化)測試。將結果進行對比。
54.結果如圖2-3所示：磁珠泡騰片在37攝氏度下密閉放置196天，即6個月內性能沒有下降，且泡騰片未發生明顯的吸潮、氧化及變；磁珠泡騰片在60攝氏度下密閉放置28天，即4周內性能無明顯下降，且泡騰片未發生明顯的吸潮、氧化及變。
55.對比例1. 常規泡騰片的崩解實驗按表5中所示試劑（崩解劑和硅羥基磁珠）分別用瑪瑙研缽研磨破碎后，按表中添加量混合均勻用壓片機在0.5 mpa壓力下壓制10 s時間，制成直徑6 mm的泡騰片片劑。將泡騰片分別投入水中，靜置等待崩解，錄像觀測泡騰片崩解、分散情況。由表5可知：不同崩解劑崩解的時間差異顯著。
56.表5 常規泡騰片的配方和崩解時間吸潮實驗：將上述表5中的序號1和3制成泡騰片后，敞開靜置于氣溫為29.7℃、相對濕度為44.2%的實驗室環境中；結果如圖4所示，加入檸檬酸的泡騰片易吸潮。
57.對比例2.常規泡騰片的核酸提取實驗將表5中的常規磁珠泡騰片投入不含磁珠的裂解結合液中，靜置等待崩解分散。將已添加新冠2019-ncov假病毒( 添加后終濃度為10
5 copies/ml ) 的口腔拭子樣本加入泡騰片已崩解分散完成的裂解結合液中，經裂解、結合、去蛋白、鹽洗滌、洗脫的磁珠法新冠核酸提取流程后，取洗脫液加入熒光定量pcr試劑中，進行定量擴增。將結果與磁珠原分散液、陰性對照，進行對比。
58.磁珠法新冠核酸提取流程參照市售產品：magbetter
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磁珠法病毒核酸提取試劑盒——mnapure virus rna kit中說明書所述提取流程。
59.表6中，序號2-9分別對應于表5中的序號1-8的泡騰片；序號1磁珠原分散液的組分為：硅羥基磁珠的水分散液；陰性對照為ddh2o。
60.表6核酸提取效果
* 中國食品藥品檢定研究院提供的新型冠狀病毒（2019-ncov）的假病毒質控品作為樣本，檢測試劑：ncov-2019熒光定量pcr試劑。
61.對比例3. 泡騰片放置不同時間的核酸提取效果表7 泡騰片放置不同時間的核酸提取效果* 中國食品藥品檢定研究院提供的新型冠狀病毒（2019-ncov）的假病毒質控品作為樣本，檢測試劑：ncov-2019熒光定量pcr試劑。
62.上述表7的2、3、4號泡騰片實例均取自表6中的序號4泡騰片實例，在制片后立即密封存放于試劑瓶中；序號1磁珠原分散液的組分為：硅羥基磁珠的水分散液；陰性對照為ddh2o。
63.分析表6：核酸提取效果顯示，即使磁珠量增加到原磁珠分散液中的磁珠量的2倍，使用泡騰片進行核酸提取的性能仍然較磁珠原分散液差，其中僅3、4、6、7號數據有陽性檢出。此外，如圖4所示，序號1和3的泡騰片在空氣中易潮解，約10 min就出現坍塌、裂開等，不易儲存。
64.分析表7：所制泡騰片經過儲存穩定性測試，其在室溫下存放3天，出現磁珠性能降低的情況。圖5顯示了序號2-4泡騰片，在缺少保護劑、防腐劑的保護下，存放一定時間后，泡騰片出現了氧化、變的情況。
65.結論：崩解速度：比較實施例1(表1)與對比例1(表5)中的各配方崩解速度，可知本專利所述的一些實施例在包含了多種非崩解劑組分后，其崩解速度、分散性能仍能與常規泡騰片接近，該速度可滿足應用過程中快速、均勻的需求。
66.提取性能：比較實施例2、3(表2、3)與對比例2(表6)中的新冠假病毒rna提取效果，可知本發明的實施例加入保護劑和防腐劑后，核酸提取性能較不含保護劑和防腐劑的泡騰片(對比例2)顯著提升，與溶劑型磁珠分散液提取性能相當。實施例4的數據進一步表明，本發明的核酸提取磁珠可應用于各類常見的試劑盒。
67.穩定性：比較實施例5(圖2-3)與對比例3(表7)中的穩定性數據(主要以外觀和核酸提取性能作為表征)，可知本發明的實施例加入保護劑和防腐劑后，穩定性能顯著提升，存儲有效期可滿足相關市場中對于產品運輸、存儲的有關需求。
68.以上，對本發明的實施方式進行了說明。但是，本發明不限定于上述實施方式。凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
技術特征：
1.一種核酸提取磁珠的泡騰片，其特征在于，包括以下組分：核酸提取磁珠、保護劑、崩解劑；其中，崩解劑包括酸劑和堿劑。2.根據權利要求1所述的核酸提取磁珠的泡騰片，其特征在于，崩解劑中的堿劑選自碳酸鹽和碳酸氫鹽中的一種或多種，其中，碳酸鹽選自碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銨、碳酸鈣、碳酸鎂中的一種或多種，和/或碳酸氫鹽選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫銨、碳酸氫鎂中的一種或多種；和/或，崩解劑中的酸劑選自無機酸、有機酸、和/或無機鹽中的一種或多種，其中，無機鹽選自磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀中的一種或多種，和/或有機酸選自檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、脫氫抗壞血酸、酒石酸中的一種或多種。3.根據權利要求2所述的核酸提取磁珠的泡騰片，其特征在于，崩解劑中作為堿劑或酸劑的無機鹽組分含量小于60%，和/或，崩解劑中的堿劑與酸劑的質量比為20-60:40-80，和/或，崩解劑用量的比例為10-95%。4.根據權利要求1-3任一項中所述的核酸提取磁珠的泡騰片，其特征在于，所述保護劑為抗氧化或防潮保護劑，所述抗氧化或防潮保護劑選自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨酯、bsa牛血清蛋白、檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉、二苯酮、水楊酸乙基己酯、甲氧基肉桂酸乙基己酯、西諾沙酯、甲氧基肉桂酸辛酯、對-胺基苯甲酸中的一種或多種；和/或，保護劑的用量比例為0.1-5%。5.根據權利要求1-3任一項中所述的核酸提取磁珠的泡騰片，其特征在于，核酸提取磁珠選自硅羥基磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠中的至少一種；和/或，核酸提取磁珠的粒徑范圍選自100-1200 nm；和/或，核酸提取磁珠的表面材料選自二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酸、多巴胺、聚羧甲基甘油醛、聚氨酯、聚甲基丙烯酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯中的一種或多種；和/或，核酸提取磁珠的用量比例為0.1-5%。6.根據權利要求1-3任一項中所述的核酸提取磁珠的泡騰片，其特征在于，核酸提取磁珠的泡騰片還包括防腐劑，防腐劑選自疊氮化鈉、山梨醇、山梨酸鉀、苯氧乙醇、多菌清、百菌靈中的一種或幾種，和/或，防腐劑的用量比例為0-3 %。7.根據權利要求1-3任一項中所述的核酸提取磁珠的泡騰片，其特征在于，泡騰片的直徑大小范圍為1-15 mm，和/或，泡騰片的厚度為3-5 mm；和/或，泡騰片的緊實程度以硬度表征，范圍為10-200n；和/或，泡騰片壓制時壓力范圍為0.1-5 mpa；和/或，泡騰片壓制時間范圍為5-20s。8.權利要求1-7任一項中所述的核酸提取磁珠的泡騰片的合成方法，包括以下步驟：將各組分分別用瑪瑙研缽碾碎后，按照一定比例混合均勻，利用壓片機在一定壓力下
壓制成泡騰片。9.權利要求1-7任一項中所述的核酸提取磁珠的泡騰片在核酸提取中的應用。10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，核酸提取的樣本選自拭子、全血、血漿、血清、動物組織勻漿液、植物組織勻漿液、土壤、糞便、細菌、腦脊液、耳槽、精液中的至少一種。
技術總結
本發明提供一種核酸提取磁珠的泡騰片、合成方法及其應用。將核酸提取磁珠與保護劑、崩解劑、防腐劑等多種不同的組分，在特定壓力下壓制成不同的泡騰片，并成功應用于核酸提取試劑中。同時，通過老化實驗結果顯示，該磁珠泡騰片具有良好的穩定性。片具有良好的穩定性。片具有良好的穩定性。
