堿性木聚糖酶突變體的制作方法
1.本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種堿性木聚糖酶突變體及其應用。
背景技術：
2.木聚糖是植物半纖維素的主要組成部分，廣泛存在于玉米芯、甘蔗渣、麥麩、秸稈等農作物廢棄物中，由于木聚糖酶能夠將木聚糖分解成不同長度的低聚木糖和木糖，該產物具有重要的經濟價值，通過木聚糖酶將這些可利用資源充分利用，發揮其潛在的應用價值，木聚糖酶的研究也受到充分的重視。
3.木聚糖酶（xylanase，xyl）是個復雜的酶系，主要包括β-1,4-內切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-l-阿拉伯糖苷酶、α-d-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶[3]，可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素，在木聚糖水解酶系中，β-1,4-內切木聚糖酶是最關鍵的水解酶，它通過水解木聚糖分子的β-1,4-糖苷鍵，將木聚糖水解為小寡糖和木二糖等低聚木糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖。β-木糖苷酶通過水解低聚木糖的末端來催化釋放木糖殘基。另外，參與徹底降解木聚糖的還有α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶，以及能降解木聚糖中阿拉伯糖側鏈殘基與酚酸（如阿魏酸或香豆酸）形成的酯鍵的酚酸酯酶等側鏈水解酶，它們作用于木糖與側鏈取代基之問的糖苷鍵，協同主鏈水解酶的作用，最終將木聚糖轉化為它的組成單糖。現在木聚糖酶已廣泛應用于造紙、食品、飼料和能源等領域，帶來了很大的經濟效益。
[0004]
木聚糖酶是第一個成為工業用商品酶的半纖維素酶。自viikari等首次發現使用木聚糖酶處理硫酸鹽紙漿能增強制漿漂白度和降低在紙漿漂白等造紙過程中環境污染物的用量后，制漿造紙工業中對木聚糖酶的研究已全面展開，并取得了可喜的成果。將木聚糖酶融入到造紙生產工業中，不僅可以降低原料的黏度，分解多余的半纖維素，促進原料生成可溶性脂類成分，改善紙張性能，更重要的是可利用木聚糖酶對紙漿原料進行預處理，輔助等化學漂白劑滲透到紙漿，大大減少化學漂白劑的使用，進而有效減少環境污染。
[0005]
在紙漿和造紙工業中，造紙工藝多需較高的ph及高溫蒸煮的方法除去原漿中的木質素，受這種嚴格的工藝條件限制，工業生產應用上需要具有耐高溫、耐堿、催化活性高、成本低等特性的木聚糖酶。目前的木聚糖酶普遍存在活性不高、酶學性質不能滿足工業生產應用的需求、發酵成本過高等問題，限制了木聚糖酶在造紙工業中的應用。大多數自然界中篩選獲得的野生型木聚糖酶菌株往往產酶量、酶學性質等都達不到工業化應用的需要，故利用基因工程方法獲得高活性且酶學性質優良的木聚糖酶編碼基因和構建高效的表達菌株是研究的趨勢。
技術實現要素：
[0006]
本發明的目的是提供一種新的堿性木聚糖酶突變體。本發明通過對來源于放線桿菌（actinobacteria bacterium）的木聚糖酶進行蛋白質工程改造，獲得了突變體蛋白，使其對高溫和堿性環境的耐受性得到顯著提高，有利于其在造紙領域的廣泛應用。
[0007]
申請人通過對木聚糖酶進行隨機突變和大量篩選，發現t3c和t30c兩個突變位點能引起木聚糖酶耐熱性和耐堿性的改變，從而促成本發明。
[0008]
本發明一方面提供了一種木聚糖酶，其氨基酸序列為seq id no:1，其編碼核苷酸序列為seq id no:2。
[0009]
本發明另一方面提供了一種木聚糖酶突變體，其包含與seq id no:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且與seq id no:1相比在第3位或/和第130位上發生了氨基酸的取代。
[0010]
所述突變體的氨基酸序列與seq id no:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
[0011]
所述突變體的氨基酸序列與seq id no:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
[0012]
所述突變體包含的取代為t3c，t30c或t3c/t30c中的任意一個。
[0013]
所述突變體的氨基酸序列如seq id no:3或seq id no:5或seq id no:7所示。
[0014]
本發明還涉及編碼上述木聚糖酶突變體的dna分子。
[0015]
所述木聚糖酶突變體dna分子的編碼序列如seq id no:4或seq id no:6或seq id no:8所示。
[0016]
本發明還涉及包含上述dna分子的重組表達質粒。
[0017]
本發明還涉及一種宿主細胞，包含上述重組表達質粒。
[0018]
在本發明的一些實施例中，宿主細胞為畢赤酵母（pichia pastoris）。
[0019]
將上述重組表達質粒轉入畢赤酵母宿主細胞中進行重組表達，獲得的木聚糖酶突變體在高溫和堿性環境中具有更高的酶活力。
[0020]
本發明還涉及上述木聚糖酶突變體在造紙領域中的應用。
[0021]
本發明所述木聚糖酶突變體xyn11-1、xyn11-2、xyn11-3的最適作用ph為6.0，與野生型一致；但突變體對ph 9.0-12.0的堿性條件耐受性更強，37℃處理2h后，其酶活殘留率均高于90%；尤其是突變體xyn11-3，其在ph9.0-12.0條件下幾乎沒有酶活損失，取得了意料不到的技術效果。
[0022]
本發明提供的木聚糖酶突變體xyn11-1和xyn11-2的最適作用溫度均為65℃，與野生型一致，但在90℃條件下分別處理30min后，其酶活殘留率比野生型分別提高了22.4%和108.0%；突變體xyn11-3的的最適作用溫度是70℃，明顯高于野生型；而且其耐熱性最強，80℃、85℃和90℃處理30min后，酶活殘留率分別高達98.37%、96.75%和56.46%，比野生型分別提高了322.7%、847.6%和731.5%，取得了意料不到的技術效果。
[0023]
與野生型相比，本發明所述木聚糖酶突變體的耐熱性和耐堿性均得到顯著提高，有利于其在造紙行業的廣泛推廣和應用。
具體實施方式
[0024]
本發明公開了一種堿性木聚糖酶突變體、其制備方法及應用、編碼該堿性木聚糖酶突變體的dna分子、載體、宿主細胞，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現
和應用本發明技術。
[0025]
本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如molecular cloning：a laboratory manual，3nd ed. (sambrook, 2001)和current protocols in molecular biology (ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，本領域的技術人員可以在本發明所記載的技術方案的基礎上，采用本領域其它常規的方法、實驗方案和試劑，而不限于本發明具體實施例的限定。例如，本發明可選用如下實驗材料和試劑：菌株與載體：大腸桿菌dh5α、畢赤酵母gs115、載體ppic9k、amp、g418均購自invitrogen公司。
[0026]
酶與試劑盒：pcr酶及連接酶購買自takara公司，限制性內切酶購自fermentas公司，質粒提取試劑盒及膠純化回收試劑盒購自omega公司，genemorph ii隨機誘變試劑盒購自北京博邁斯生物科技有限公司。
[0027]
培養基配方：大腸桿菌培養基（lb培養基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，ph7.0；酵母培養基（ypd培養基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；酵母篩選培養基（md培養基）：2%蛋白胨，2%瓊脂糖；bmgy培養基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸鉀緩沖液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
% 生物素，1%甘油；bmmy培養基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸鉀緩沖液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
% 生物素，0.5%甲醇；lb-amp培養基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，100μg/ml氨芐青霉素，ph7.0；lb-amp平板：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，1.5%瓊脂，100μg/ml氨芐青霉素，ph7.0；下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例1 表達質粒的構建將來源于放線桿菌（actinobacteria bacterium）的木聚糖酶基因（genbank pzn45477.1）根據畢赤酵母密碼子偏好性進行密碼子優化，并在其起始密碼子atg前增加6個堿基gaattc（ecor i酶切位點），在其終止密碼子taa后增加gcggccgc（not i酶切位點）。優化后的核苷酸序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。將該木聚糖酶命名xyn11，其氨基酸序列為seq id no：1，編碼核苷酸序列為seq id no：2。
[0028]
用限制性內切酶ecor i和not i（fermentas）對木聚糖酶基因進行酶切；同時，用限制性內切酶ecor i和not i對質粒ppic9k進行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產物純化，并用t4 dna連接酶（fermentas）將上述兩個酶切產物連接。將連接產物轉化進dh5α大腸桿菌（invitrogen），涂布于lb+amp平板，37℃倒置培養，待轉化子出現后，菌落pcr（反應體系：模板挑取的單克隆，rtaqdna聚合酶 0.5μl，10
×
buffer 2.0μl，dntps（2.5mm）2.0μl，5’aox引物（10mm）：0.5μl，3’aox引物：0.5μl，ddh2o 14.5μl，反應程序：95℃預變性5min，30個循環： 94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，72℃ 10min），驗證陽性克隆子，并進行測序分析。使用質粒小量制備試劑盒（omega）從測序結果正確的大腸桿菌克隆中純化質粒，測序結果顯示獲得的dna序列為seq id no：2，其編碼的氨基酸序列為seq id no：1，從而說明表達
質粒構建成功，命名為ppic9k-xyn11。
[0029]
實施例2 耐高溫木聚糖酶突變體的篩選為了進一步提高木聚糖酶xyn11的耐溫性，對其進行蛋白結構分析。該蛋白是11家族木聚糖酶，其結構為β-果凍卷的結構，蛋白質表面和蛋白質的活性中心都是暴露在外界環境中。所以，外界環境的改變，特別是高溫環境，既可以直接影響到酶的表面結構的穩定性，也可以直接影響酶的活性中心的穩定性。要提高該酶在高溫環境中的耐受性，就要提高蛋白整體的剛性，穩定酶的整體結構，在不破壞該酶蛋白二級結構與活性中心的前提下，進一步對該基因進行突變。
[0030]
1.1設計pcr引物xyn11-f1、xyn11-r1：xyn11-f1：ggcgaattcgatacttgtatcactcaaaaccaaac（下劃線為限制性內切酶ecori識別位點）；xyn11-r1：atagcggccgcttatccaatggtaacagttgatgatcc（下劃線為限制性內切酶noti識別位點）。
[0031]
以xyn11基因（seq id no：2）為模板，利用上述引物用genemorph ii隨機突變pcr試劑盒（博邁斯）進行pcr擴增，膠回收pcr產物，ecori、noti進行酶切處理后與經同樣酶切后的pet21a載體連接，轉化至大腸桿菌bl21（de3）中，涂布于lb+amp平板，37℃倒置培養，待轉化子出現后，用牙簽逐個挑至96孔板，每個孔中加入150μl含有0.1mm iptg的lb+amp培養基，37℃ 220rpm培養6 h左右，離心棄上清，菌體用緩沖液重懸，反復凍融破壁，獲得含有木聚糖酶的大腸桿菌細胞裂解液。
[0032]
分別取出兩份裂解液做如下處理：第一份裂解液用ph8.0的緩沖液稀釋，第二份裂解液用ph8.0的緩沖液稀釋后于75℃處理30min；然后分別取上述處理好的30 μl裂解液至兩塊新的96孔板，兩塊96孔板都加入30 μl用相應緩沖液配置的底物，于50℃反應30 min后，dns法測定生成的還原糖，計算突變體的酶活殘留率。
[0033]
實驗結果表明，不同的突變體在高溫處理后保持的活性不同。有些突變對木聚糖酶的耐溫性沒有影響，有些突變甚至使其耐溫性或酶活變得更差了；另外還有些突變，雖然能提高木聚糖酶的耐溫性，但突變導致其酶學性質發生了顯著的變化，這些均不符合要求。最終，申請人篩選到既能顯著提高木聚糖酶xyn11的耐溫性，又不會影響其酶活及原有酶學性質的突變位點及位點的組合：t3c，t30c單點突變，t3c/t30c 兩點突變。
[0034]
含t3c單點突變的木聚糖酶突變體命名為xyn11-1，其氨基酸序列為seq id no：3，編碼核苷酸序列為seq id no：4；含t30c單點突變的木聚糖酶突變體命名為xyn11-2，其氨基酸序列為seq id no：5，編碼核苷酸序列為seq id no：6；含t3c/t30c兩點突變的木聚糖酶突變體命名為xyn11-3，其氨基酸序列為seq id no：7，編碼核苷酸序列為seq id no：8。
[0035]
實施例3 木聚糖酶在畢赤酵母中的表達3.1表達質粒的構建依照畢赤酵母的密碼偏愛性對堿性木聚糖酶突變體xyn11-1，xyn11-2和xyn11-3的基因序列進行優化合成，基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并且在合成序列5’和3’兩端分別加上ecori和noti兩個酶切位點。
[0036]
按照實施例1中的方法，將合成的突變體的基因序列xyn11-1，xyn11-2和xyn11-3分別進行ecori和noti雙酶切，然后與經同樣酶切后的ppic-9k載體16℃過夜連接，并轉化
大腸桿菌dh5a，涂布于lb+amp平板，37℃倒置培養，待轉化子出現后，菌落pcr驗證陽性克隆子，經測序驗證后獲得了正確的重組突變體表達質粒，分別命名為ppic9k-xyn11-1，ppic9k-xyn11-2和ppic9k-xyn11-3。
[0037]
3.2畢赤酵母工程菌株的構建3.2.1酵母感受態制備將畢赤酵母gs115菌株進行ypd平板活化，30℃培養48 h后接種活化的gs115單克隆于6 ml ypd液體培養基中，30℃、220 rpm，培養約12 h后轉接菌液于裝有30ml ypd液體培養基的三角瓶中，30℃、220 rpm培養約5h，經紫外分光光度計檢測其菌體密度，待其od600值在1.1
–
1.3范圍后，4℃ 9000 rpm離心2 min分別收集4ml菌體至滅菌ep管中，輕輕棄上清，用滅菌的濾紙吸干殘留的上清后用預冷的1 ml滅菌水重懸菌體，4℃、9000 rpm離心2 min，輕輕棄上清，重復用1ml滅菌水洗一遍后，4℃、9000 rpm離心2 min，輕輕棄上清，預冷的1ml山梨醇（1 mol/l）重懸菌體；4℃、9000 rpm離心2 min，輕輕棄上清，預冷的100-150μl山梨醇（1 mol/l）輕柔重懸菌體。
[0038]
3.2.2轉化和篩選分別將實施例1和實施例3.1中構建獲得的表達質粒用sac i進行線性化，線性化片段純化回收后通過電穿孔法分別轉化畢赤酵母gs115，在md平板上篩選得到畢赤酵母重組菌株，然后在含不同濃度遺傳霉素的ypd平板（0.5mg/ml-8mg/ml）上篩選多拷貝的轉化子。
[0039]
將獲得的轉化子分別轉接于bmgy培養基中，30℃、250rpm振蕩培養1d；再轉入bmmy培養基中，30℃、250rpm振蕩培養；每天添加0.5%的甲醇，誘導表達4 d；9000rpm離心10min去除菌體，即得到分別含木聚糖酶xyn11及其突變體的發酵上清液。
[0040]
（1）木聚糖酶酶活單位的定義在溫度為50℃、ph為8.0的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的木聚糖溶液中降解釋放1μmol還原糖所需要的酶量即為一個酶活性單位，以u表示。
[0041]
（2）木聚糖酶酶活測定方法吸取10.0 ml木聚糖溶液，50℃平衡20 min。
[0042]
吸取10.0 ml經過適當稀釋的酶液，50℃平衡5 min。
[0043]
空白樣品測定：吸取2.00 ml經過適當稀釋的酶液（已經過50℃平衡），加入到刻度試管中，再加入5ml dns試劑，電磁振蕩3 s。然后加入2.0 ml木聚糖溶液，50℃平衡30 min，沸水浴加熱5 min。用自來水冷卻至室溫，加水定容至25 ml，電磁振蕩3 s～5s。以標準空白樣為空白對照，在540 nm處測定吸光度ab。
[0044]
樣品測定：吸取2.00 ml經過適當稀釋的酶液（已經過50℃平衡），加入到刻度試管中，再加入2.0 ml木聚糖溶液（已經過50℃平衡），電磁振蕩3 s，50℃精確保溫30 min。加入5.0 ml dns試劑，電磁振蕩3 s，以終止酶解反應。沸水浴加熱5 min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25 ml，電磁振蕩3 s。以標準空白樣為空白對照，在540 nm處測定吸光度ae。
[0045]
xd=。
[0046]
式中：xd—試樣稀釋液中木聚糖酶的活力，u/ml；ae
—酶反應液的吸光度；ab—酶空白樣的吸光度；k—標準曲線的斜率；co—標準曲線的截距；m—木糖的摩爾質量m（c5xyn110o5）= 150.2 g/mol；t—酶解反應時間，min；1000—轉化因子，1 mmol = 1000 μmol；xd值應在0.04—0.10 u/ml之間。如果不在這個范圍內，應重新選擇酶液的稀釋度，再進行分析測定。
[0047]
x = xd·df
???????????????
（2）x—試樣中木聚糖酶的活力，u/ml；df—試樣的稀釋倍數。
[0048]
（3）測定結果按照上述方法進行酶活檢測，結果顯示：上述構建得到的重組表達木聚糖酶xyn11及其突變體的畢赤酵母重組菌株發酵上清液的酶活為120-330 u/ml。
[0049]
實施例4木聚糖酶的酶學性質測定1、最適作用ph采用ph值分別為ph 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.1m磷酸氫二鈉-0.05m檸檬酸，ph 8.0、8.5、9.0的0.2m硼酸-0.05m硼砂，ph9.5、10.0、11.0、12.0的0.05m硼砂-0.2m氫氧化鈉的緩沖液將上述畢赤酵母重組菌株的發酵上清液進行稀釋測定，木聚糖底物也分別用對應ph值的緩沖液配制，在50℃的條件下進行木聚糖酶酶活測定，以最高酶活為100%，計算相對酶活。
[0050]
結果顯示，野生型木聚糖酶xyn11及其突變體xyn11-1、xyn11-2、xyn11-3的最適作用ph值均為6.0。
[0051]
2、ph耐受性分析用去離子水將上述畢赤酵母重組菌株發酵上清液稀釋至50u/ml，取1ml上清液分別加入到已預熱10min的9ml緩沖液中，所述緩沖液的ph分別為9.0、10.0、11.0、12.0；37℃處理2h，反應結束迅速加入5ml補充液，搖勻，然后用緩沖液稀釋，測定殘余酶活。以未處理樣品酶活計100%，計算酶活殘留率。
[0052]
酶活殘留率（%）=處理后樣品的酶活/未處理樣品的酶活
×
100%。
[0053]
結果顯示，本發明提供的木聚糖酶突變體xyn11-1、xyn11-2、xyn11-3對ph 9.0
??
12.0的堿性條件耐受性更強，37℃處理2h后，酶活殘留率均高于90%；尤其是突變體xyn11-3，其在ph9 .0
??
12.0條件下幾乎沒有酶活損失，取得了意料不到的效果。
[0054]
3、最適反應溫度分別在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃，ph8.0條件下，對上述畢赤酵母重組菌株的發酵上清液進行木聚糖酶酶活測定，以最高酶活為100%，計算相對酶活。
[0055]
結果顯示，野生型木聚糖酶xyn11的最適作用溫度為65℃；而木聚糖酶突變體xyn11-1、xyn11-2和xyn11-3的最適溫度分別是65℃、65℃和70℃。
[0056]
4、耐熱性分析將上述畢赤酵母重組菌株發酵上清液用0.1m磷酸氫二鈉-0.05m檸檬酸稀釋至200u/ml，再用預熱10min的緩沖液稀釋10倍，混合均勻，80℃、85℃和90℃條件下分別處理30min，結束時取樣并冷卻至室溫，然后測定其木聚糖酶酶活，以未處理樣品酶活計100%，計算酶活殘留率。具體結果見表1。
[0057]
酶活殘留率（%）=處理后樣品的酶活/未處理樣品的酶活
×
100%。
[0058]
表1 木聚糖酶xyn11及其突變體的耐熱性分析從表1的結果可知，與野生型木聚糖酶xyn11相比，本發明提供的單點突變體xyn11-1和xyn11-2、兩點突變體xyn11-3在90℃條件下處理30min后，酶活殘留率分別提高了22.4%、108.0%、731.5%。從而說明，本發明提供的t3c和t30c兩個突變位點能顯著提高木聚糖酶xyn11對高溫環境的耐受性，其中含t3c和t30c兩點組合的木聚糖酶突變體xyn11-3的耐熱性最強，80℃、85℃和90℃處理30min后，其酶活殘留率分別高達98.37%、96.75%和56.46%，比野生型分別提高了322.7%、847.6%和731.5%，取得了意料不到的技術效果。
[0059]
綜上所述，本發明提供的木聚糖酶突變體與野生型相比，其耐熱性和耐堿性均得到顯著提高，有利于其在造紙行業的廣泛推廣和應用。
技術特征：
1.一種木聚糖酶突變體，其特征在于，所述突變體包含與seq id no:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且與seq id no:1相比在第3位或/和第130位上發生了氨基酸的取代。2.如權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列與seq id no:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。3.如權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列與seq id no:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。4.如權利要求1-3任一所述的突變體，其特征在于，所述突變體包含的取代為t3c，t30c或t3c/t30c中的任意一個。5.如權利要求4所述的突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列如seq id no:3或seq id no:5或seq id no:7所示。6.編碼權利要求5所述木聚糖酶突變體的dna分子。7.包含權利要求6所述dna分子的重組表達質粒。8.一種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞包含權利要求7所述的重組表達質粒。9.如權利要求8所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞為畢赤酵母（pichia pastoris）。10.權利要求1-5任一所述木聚糖酶突變體在造紙領域中的應用。
技術總結
本發明涉及基因工程與蛋白質改造技術領域，具體提供了一種新的堿性木聚糖酶突變體。本發明通過對來源于放線桿菌（Actinobacteria bacterium）的木聚糖酶進行蛋白質工程改造，獲得了突變體蛋白，使其對高溫和堿性環境的耐受性得到顯著提高，有利于其在造紙領域的廣泛應用。用。
