大鼠線粒體基因aC（aCC）位點(diǎn)特異性堿基編輯及其應(yīng)用
大鼠線粒體基因ac(acc)位點(diǎn)特異性堿基編輯及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明涉及動(dòng)物基因遺傳修飾，具體涉及一種大鼠線粒體基因ac(acc)位點(diǎn)特異性的堿基編輯工具及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2.線粒體是唯一擁有自己遺傳物質(zhì)(線粒體dna，mtdna)的細(xì)胞器。mtdna突變與人類多種系統(tǒng)性疾病相關(guān)。目前為止，已報(bào)道人類疾病相關(guān)的mtdna突變超過390種，并且數(shù)量還在不斷增加。但是，臨床目前仍沒有針對(duì)mtdna突變所致疾病的特異物。因此，迫切需求包含精確的人類mtdna變異的動(dòng)物模型來揭示這類疾病的病理生理學(xué)過程并開發(fā)針對(duì)這些疾病的方法。由于傳統(tǒng)ddcbe工具的識(shí)別靶點(diǎn)只局限于tc位點(diǎn)，嚴(yán)重地限制了ddcbe工具的應(yīng)用。因此，開發(fā)能夠識(shí)別非tc(ac/cc/gc)位點(diǎn)的ddcbe工具，對(duì)于建立對(duì)應(yīng)的mtdna突變動(dòng)物模型，服務(wù)于基礎(chǔ)和臨床研究至關(guān)重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
3.本發(fā)明的目的之一是開發(fā)一種實(shí)現(xiàn)大鼠mtdna ac(acc)位點(diǎn)c
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g到t
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a的編輯工具。
4.根據(jù)本發(fā)明的第一方面內(nèi)容，提供一種大鼠mtdna ac(acc)位點(diǎn)c
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g到t
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a的編輯工具，包括：
5.根據(jù)目標(biāo)mtdna突變位點(diǎn)，在其上下游各選定一個(gè)tale識(shí)別靶點(diǎn)，tale識(shí)別靶點(diǎn)序列之間的間隔為7-18bp；
6.篩選能夠高效率的定位到目標(biāo)ac(acc)位點(diǎn)使其發(fā)生c
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a轉(zhuǎn)變的ddcbe組合，從而在大鼠線粒體基因組中引入突變。
7.本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)ddcbe只能實(shí)現(xiàn)tc位點(diǎn)編輯的局限性，通過優(yōu)化ddcbe組合，擴(kuò)展其在大鼠中的識(shí)別位點(diǎn)，從而提供了一種能夠?qū)崿F(xiàn)ac(acc)位點(diǎn)特異性編輯的ddcbe工具。
8.其中所述特異性的ddcbe組合被共注射以實(shí)現(xiàn)大鼠線粒體目標(biāo)ac位點(diǎn)堿基c
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g到t
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a的突變。
9.根據(jù)本發(fā)明，大鼠mtdna ac(acc)位點(diǎn)特異性ddcbe組合為：
10.rat ac(acc)left tale-g1333c(l1333c)和rat ac(acc)right tale-g1333n(r1333n)
11.根據(jù)本發(fā)明，可以實(shí)現(xiàn)大鼠mtdna ac(acc)位點(diǎn)堿基c
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g到t
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a的突變。
12.根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了上述編輯工具在大鼠受精卵中進(jìn)行mtdna g007a的突變應(yīng)用。
13.根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種試劑盒，包括上述堿基編輯工具或系統(tǒng)。
14.根據(jù)本發(fā)明方法制備的mtdna g007a f0雌性突變大鼠，與野生型雄性大鼠交配，在子代大鼠中能夠檢測(cè)到mtdna g007a突變。
15.根據(jù)本發(fā)明建立的mtdna g007a突變大鼠，通過行為學(xué)和心臟功能分析，證明
mtdna g007a突變大鼠模型能夠模擬人mtdna g583a突變的臨床表型。
附圖說明
16.圖1人和大鼠線粒體致病突變ac(acc)位點(diǎn)同源比對(duì)；
17.圖2不同ddcbe組合在c6細(xì)胞中對(duì)ac(acc)位點(diǎn)編輯效率的比較；
18.圖3mtdna g007a f0突變大鼠的組織突變情況鑒定；
19.圖4mtdna g007a f1突變大鼠的組織突變情況分析；
20.圖5mtdna g007a f1突變大鼠的運(yùn)動(dòng)行為分析；以及
21.圖6mtdna g007a f1突變大鼠的心臟功能檢測(cè)。
具體實(shí)施方式
22.首先，根據(jù)臨床中人源致病性mtdna ac(acc)突變位點(diǎn)g583、g1606、g12147和g12315/6，確定其分別對(duì)應(yīng)大鼠中mtdna位點(diǎn)g007、g1030、g11547和g11714/5(見圖1)。根據(jù)大鼠的ac(acc)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)tale的識(shí)別序列。ddcbe定點(diǎn)線粒體編輯是利用一對(duì)tale識(shí)別位點(diǎn)將融合的堿基編輯工具定位到靶點(diǎn)位置，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)堿基的突變是本發(fā)明的關(guān)鍵之處。本發(fā)明如下選擇設(shè)計(jì)tale識(shí)別靶點(diǎn)：
23.根據(jù)tale的識(shí)別原則，在靶點(diǎn)上下游分別選定一個(gè)tale識(shí)別位點(diǎn)，兩個(gè)tale識(shí)別位點(diǎn)中間間隔序列為7-18bp，需要包含的目標(biāo)突變堿基g，同時(shí)在間隔序列中盡量避免目標(biāo)堿基外的堿基g。
24.利用兩個(gè)融合tale識(shí)別位點(diǎn)的ddcbe定位于相應(yīng)的目標(biāo)突變序列位置，并使目標(biāo)突變g編輯變?yōu)閍，從而在大鼠線粒體基因中引入突變；
25.上述所述的tale識(shí)別序列位于目標(biāo)突變堿基上下游的3-15bp序列位置；
26.針對(duì)大鼠mtdna g583位點(diǎn)，本發(fā)明選定下面兩條tale左右識(shí)別靶點(diǎn)：
27.左側(cè)識(shí)別靶點(diǎn)：
28.tccacatacaccaa(seq id no.1)
29.右側(cè)識(shí)別靶點(diǎn)：
30.ttatttcgtttcgtgac(seq id no.2)
31.針對(duì)大鼠mtdna g1606位點(diǎn)，本發(fā)明選定下面兩條tale左右識(shí)別靶點(diǎn)：
32.左側(cè)識(shí)別靶點(diǎn)：
33.ggaaagtgtgcttggaat(seq id no.3)
34.右側(cè)識(shí)別靶點(diǎn)：
35.ttagtgtttcgtagac(seq id no.4)
36.針對(duì)大鼠mtdna g12147位點(diǎn)，本發(fā)明選定下面兩條tale左右識(shí)別靶點(diǎn)：
37.左側(cè)識(shí)別靶點(diǎn)：
38.ggcctaacaatatgt(seq id no.5)
39.右側(cè)識(shí)別靶點(diǎn)：
40.tttgtaatctgacac(seq id no.6)
41.針對(duì)大鼠mtdna g12315/6位點(diǎn)，本發(fā)明選定下面兩條tale左右識(shí)別靶點(diǎn)：
42.左側(cè)識(shí)別靶點(diǎn)：
43.ggtcttaggaaccaaa(seq id no.7)
44.右側(cè)識(shí)別靶點(diǎn)：
45.gtttattttcatta(seq id no.8)
46.針對(duì)上述選定的tale靶點(diǎn)序列，構(gòu)建不同的ddcbe，對(duì)應(yīng)不同的ddcbe如下：
47.rat g007a left tale-g1333c(seq id no.9)；
48.rat g007a right tale-g1333n(seq id no.10)；
49.rat g007a left tale-g1397c(seq id no.11)；
50.rat g007a right tale-g1397n(seq id no.12)；
51.rat g007a left tale-g1333n(seq id no.13)；
52.rat g007a right tale-g1333c(seq id no.14)；
53.rat g007a left tale-g1397n(seq id no.15)；
54.rat g007a right tale-g1397c(seq id no.16)；
55.rat g1030a left tale-g1333c(seq id no.17)；
56.rat g1030a right tale-g1333n(seq id no.18)；
57.rat g1030a left tale-g1397c(seq id no.19)；
58.rat g1030a right tale-g1397n(seq id no.20)；
59.rat g1030a left tale-g1333n(seq id no.21)；
60.rat g1030a right tale-g1333c(seq id no.22)；
61.rat g1030a left tale-g1397n(seq id no.23)；
62.rat g1030a right tale-g1397c(seq id no.24)；
63.rat g11547a left tale-g1333c(seq id no.25)；
64.rat g11547a right tale-g1333n(seq id no.26)；
65.rat g11547a left tale-g1397c(seq id no.27)；
66.rat g11547a right tale-g1397n(seq id no.28)；
67.rat g11547a left tale-g1333n(seq id no.29)；
68.rat g11547a right tale-g1333c(seq id no.30)；
69.rat g11547a left tale-g1397n(seq id no.31)；
70.rat g11547a right tale-g1397c(seq id no.32)；
71.rat g11714/5a left tale-g1333c(seq id no.33)；
72.rat g11714/5a right tale-g1333n(seq id no.31)；
73.rat g11714/5a left tale-g1397c(seq id no.32)；
74.rat g11714/5a right tale-g1397n(seq id no.33)；
75.rat g11714/5a left tale-g1333n(seq id no.34)；
76.rat g11714/5a right tale-g1333c(seq id no.35)；
77.rat g11714/5a left tale-g1397n(seq id no.36)；
78.rat g11714/5a right tale-g1397c(seq id no.37)；
79.將ddcbe分別導(dǎo)入pb轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體，用于大鼠mtdna ac(acc)位點(diǎn)的突變。
80.實(shí)施例1
81.在大鼠細(xì)胞系上進(jìn)行ddcbe介導(dǎo)的mtdna ac(acc)位點(diǎn)c
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g到t
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a突變。按常規(guī)操
作，進(jìn)行細(xì)胞系的基因編輯(通過電轉(zhuǎn)或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染)，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染為例。
82.(1)以c6細(xì)胞為例，本發(fā)明進(jìn)行真核生物細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：c6細(xì)胞接種培養(yǎng)于添加10％fbs的dmem高糖培養(yǎng)液中(gemini),其中含penicillin(100u/ml)和streptomycin(100μg/ml)。
83.(2)在轉(zhuǎn)染前分至6孔板中，待密度達(dá)到70％-80％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
84.ddcbe系統(tǒng)質(zhì)粒組合如下：
85.a:rat g007a left tale-g1333c/rat g007a right tale-g1333n(l1333c+r1333n)；
86.b:rat g007a left tale-g1397c/rat g007a right tale-g1397n(l1397c+r1397n)；
87.c:rat g007a left tale-g1333n/rat g007a right tale-g1333c(l1333n+r l1333c)；
88.d:rat g007a left tale-g1397n/rat g007a right tale-g1397c(l1397n+r l1397c)；
89.e:rat g1030a left tale-g1333c/rat g1030a right tale-g1333n(l1333c+r1333n)；
90.f:rat g1030a left tale-g1397c/rat g1030a right tale-g1397n(l1397c+r1397n)；
91.g:rat g1030a left tale-g1333n/rat g1030a right tale-g1333c(l1333n+r l1333c)；
92.h:rat g1030a left tale-g1397n/rat g1030a right tale-g1397c(l1397n+r l1397c)；
93.i:rat g11547a left tale-g1333c/rat g11547a right tale-g1333n(l1333c+r1333n)；
94.j:rat g11547a left tale-g1397c/rat g11547a right tale-g1397n(l1397c+r1397n)；
95.k:rat g11547a left tale-g1333n/rat g11547a right tale-g1333c(l1333n+r l1333c)；
96.l:rat g11547a left tale-g1397n/rat g11547a right tale-g1397c(l1397n+r l1397c)；
97.m:rat g11714/5a left tale-g1333c/rat g11714/5a right tale-g1333n(l1333c+r1333n)；
98.n:rat g11714/5a left tale-g1397c/rat g11714/5a right tale-g1397n(l1397c+r1397n)；
99.o:rat g11714/5a left tale-g1333n/rat g11714/5a right tale-g1333c(l1333n+r l1333c)；
100.p:rat g11714/5a left tale-g1397n/rat g11714/5a right tale-g1397c(l1397n+r l1397c)；
101.(3)轉(zhuǎn)染以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染為例。按照lipofectamine
tm
2000 transfection reagent
(invitrogen,11668-019)的操作手冊(cè)，以a組合為例，將1μg rat g007a left tale-g1333c(l1333c)質(zhì)粒與1μg rat g007a right tale-g1333n(r1333n)質(zhì)粒混勻，共轉(zhuǎn)染至每孔細(xì)胞中，6-8小時(shí)后換液，72小時(shí)后收取細(xì)胞。
102.(4)基因型分析
103.a、收取部分細(xì)胞在裂解液(10μm tris-hcl,0.4m nacl,2μm edta,1％sds)中用100μg/ml蛋白酶k裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μl去離子水中。
104.b、使用引物g007-fwd(aggcatctggttcttacttcagg)，g007-rev(ttattaaggtttagggctaagcatagtgg)；g1030-fwd(gcggtactttatatccatctagagg)，g1030-rev(gtttttaggtagctcgtttggtttc)；g11547-fwd(accttcccacacacgagaatta)，g11547-rev(gggtgcatgaattagcagttct)；g11714/5-fwd(tgaatctaacaacaggaaatcaaattc)，g11714/5-rev(gatataattcctactccttctcatccaat)；進(jìn)行pcr擴(kuò)增，用axyprep pcr cleanup試劑盒(axygen，ap-pcr-250g)純化獲得pcr回收產(chǎn)物，pcr反應(yīng)體系為：
105.300-400ng基因組dna
106.25μl 2
×
buffer
107.1μl dntp
108.2μl fwd(20μm)
109.2μl rev(20μm)
110.1μl dna polymerase(vazyme,p505-d3)
111.補(bǔ)水至50μl體系。
112.c、獲得的pcr回收產(chǎn)物連接到克隆載體-blunt cloning kit(transgen,cb 101)，連接反應(yīng)體系為：
113.2μl pcr產(chǎn)物
114.1μl-blunt cloning vector
115.輕輕混合，室溫(20-37℃)反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上。
116.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5感受態(tài)細(xì)胞(transgen,cd201)。
117.d、挑取克隆，用通用引物m13-f測(cè)序靶基因突變，測(cè)序結(jié)果如下(斜體、加粗、灰、下劃線表示突變堿基)：
118.g007靶點(diǎn)突變情況：
119.wt：aatgtag
120.mut：aatatag
121.g1030靶點(diǎn)突變情況：
122.wt：acagtgt
123.mut：acaatgt
124.g11547靶點(diǎn)突變情況：
125.wt：gtagttt
126.mut：gtaattt
127.g11714/5靶點(diǎn)突變情況：
128.wt：cttggtgc
g1333n組合，通過顯微注射的方式，可以實(shí)現(xiàn)大鼠mtdna g007 ac位點(diǎn)的c
·
g到t
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a突變。
155.(4)通過將獲得的g007a雌性突變大鼠與野生型雄性大鼠進(jìn)行雜交，對(duì)子代大鼠進(jìn)行基因組dna提取、pcr和測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)突變能夠穩(wěn)定的遺傳到子代大鼠中(見圖4)。表明我們獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的mtdna g007a突變大鼠。
156.(5)線粒體基因g007a點(diǎn)突變f1大鼠行為學(xué)分析
157.對(duì)獲得的線粒體基因g007a點(diǎn)突變f1大鼠，進(jìn)行行為學(xué)方法檢測(cè)，判定g007a大鼠的肌肉功能指標(biāo)。進(jìn)而驗(yàn)證該突變是否會(huì)導(dǎo)致線粒體功能缺陷，進(jìn)而影響肌肉組織的功能。
158.開放曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：該實(shí)驗(yàn)在80cm
×
80cm
×
50cm的黑箱體中進(jìn)行。使用supermaze數(shù)字跟蹤系統(tǒng)記錄大鼠自發(fā)活動(dòng)5分鐘。大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡通過supermaze軟件進(jìn)行分析。
159.開放曠場(chǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示g007a突變導(dǎo)致大鼠的運(yùn)動(dòng)距離和平均速度顯著下降，如圖5所示。
160.(6)線粒體基因g007a點(diǎn)突變f1大鼠心臟功能評(píng)價(jià)
161.對(duì)獲得的線粒體基因g007a點(diǎn)突變f1大鼠，用心臟超聲檢測(cè)分析突變大鼠的心臟結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)參數(shù)。
162.m型超聲心動(dòng)檢查：采用異氟烷麻醉大鼠，使用小動(dòng)物微超聲成像系統(tǒng)(vevo 3100)進(jìn)行超聲心動(dòng)圖觀察。記錄至少三個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期，然后進(jìn)行參數(shù)測(cè)量和計(jì)算。
163.心臟結(jié)構(gòu)和功能評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，與野生大鼠相比，g007a突變大鼠表現(xiàn)出擴(kuò)張型心肌病表型，左心室變大，左心室收縮功能下降，如圖6所示。
技術(shù)特征：
1.一種大鼠線粒體基因ac(acc)位點(diǎn)的編輯工具，包括：選定一對(duì)tale識(shí)別靶點(diǎn)序列，其中目標(biāo)位點(diǎn)ac(acc)位于tale識(shí)別靶點(diǎn)序列中間位置，tale識(shí)別靶點(diǎn)序列之間的間隔為7-18bp；篩選能夠高效率的定位到目標(biāo)ac(acc)位點(diǎn)使其發(fā)生c
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a轉(zhuǎn)變的ddcbe組合，從而在線粒體基因組中引入突變。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編輯工具，其中大鼠線粒體基因ac(acc)位點(diǎn)特異性的ddcbe組合為：mts-n-1366aa-rvdarray-c-g1333c-ugi和mts-n-1366aa-rvdarray-c-g1333n-ugi。3.權(quán)利要求1所述的編輯工具在大鼠中實(shí)現(xiàn)線粒體基因ac(acc)位點(diǎn)c
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g到t
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a的突變的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編輯工具在大鼠細(xì)胞系c6進(jìn)行線粒體基因ac(acc)位點(diǎn)c
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a突變的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編輯工具在大鼠受精卵注射制備大鼠線粒體基因ac(acc)位點(diǎn)c
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a突變模型的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編輯工具制備的線粒體基因突變大鼠模型，其獲得的突變能夠穩(wěn)定地母系遺傳。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編輯工具制備的g007a大鼠模型，具有人類線粒體g583a突變臨床表型，應(yīng)用于線粒體肌病的研究。
技術(shù)總結(jié)
大鼠線粒體基因aC(aCC)位點(diǎn)特異性堿基編輯及其應(yīng)用。本發(fā)明利用DdCBE堿基編輯技術(shù)，針對(duì)aC(aCC)位點(diǎn)，在其兩側(cè)設(shè)計(jì)TALE識(shí)別靶點(diǎn)序列，通過篩選四種DdCBE組合方式，鑒定出具有aC(aCC)位點(diǎn)特異性的DdCBE組合(L1333C+R1333)；通過大鼠受精卵顯微注射，能夠?qū)崿F(xiàn)大鼠線粒體基因第007位aC靶點(diǎn)C
