一種膜蛋白原位合成親和生物譜柱及其制備方法和應用
1.本發明涉及生物譜領域，具體地說，是一種采用cell-free蛋白表達和共價固定化親和譜技術，建立新的原位合成膜蛋白親和譜方法。
背景技術：
2.膜蛋白負責外部物質和信息的交換，并行使細胞間接觸、表面識別、信號轉導、酶活性和轉運等多種功能，是目前最有潛力的潛在藥物靶點體。據估計，60％的藥物靶標是膜蛋白。但由于膜蛋白的豐度低、結構復雜，基于膜蛋白的藥物發現相對困難。至今，只有1％具有三維結構的蛋白被成功解析。體外純化和模擬天然構象是靶向膜蛋白的藥物篩選與配體相互作用分析的瓶頸。
3.脂質雙分子層環境是膜蛋白維持其天然構象和生理活性所必需的。膜蛋白生物譜技術，如細胞膜譜(cmc)和細胞膜親和譜(cmac)被廣泛應用于膜蛋白的研究中。cmc直接提取細胞膜固定在硅膠上作為譜固定相，是篩選膜受體活性成分的有效方法。將固定相修飾技術和蛋白過表達策略與cmc相結合，可以實現針對特定蛋白的特異性篩選。cmac直接從細胞膜獲得靶標膜蛋白或隨后重組到固定化人工膜中，將其固定在固定相上，已廣泛應用于藥物發現過程的多個階段。近年來，含有靶蛋白的cmac柱已被擴展到表征候選先導藥物與靶蛋白結合的類型以及結合過程。然而，cmc或cmac發展至今仍存在一些局限性：1.直接獲取細胞膜作為膜蛋白來源，蛋白的特異性和豐度低，不利于對膜蛋白親和成分的準確篩選和相互作用分析；2.在細胞膜或重構的蛋白-脂質結構固定到固定相載體上的過程中，膜蛋白的朝向是隨機的，活性結合位點的暴露是不可控的；3.制備足夠數量的重組膜蛋白是一項昂貴、繁瑣且耗時的工作。
4.cell-free表達(cfe)技術為膜蛋白的表達提供了一個理想的途徑。其原理是以靶蛋白的dna或mrna為模板，在細胞提取物氨基酸、rna聚合酶和能量物質的存在下，實現蛋白的體外表達。cfe突破了活細胞的生理限制，大大提高了蛋白合成的效率和產量，同時減少了蛋白的錯誤折疊和聚集。cfe特別適合應用于膜蛋白的合成，通過在表達系統中提供人工仿生膜，膜蛋白可以在合成過程中直接表達、共翻譯并插入到磷脂膜中。更重要的是，可以觀察到該蛋白質在合成過程中在仿生膜上呈現矢量插入。cfe已被用于蛋白的高通量表達、蛋白藥物的篩選和合成。如蛋白原位陣列可通過cfe快速有效地合成蛋白并應用于芯片上的蛋白-蛋白相互作用網絡的研究。cfe是一種實用的方法，可以獲得足夠多的、朝向一致的功能性膜蛋白。而到目前為止，還沒有在硅膠固定相上實現基于cfe制備膜蛋白生物譜固定相。
技術實現要素：
5.本發明的目的在于提供一種新的原位合成膜蛋白親和生物譜柱及其制備方法和應用。本發明的譜柱結合cell-free表達(cfe)和3-巰基丙基三甲氧基硅烷(mpts)修飾生物親和譜的優點，實現硅膠-脂質體載體上膜蛋白的原位合成和單向插入。可應用于復
雜體系中靶向特定膜蛋白的潛在活性成分篩選，以及膜蛋白與其配體相互作用的表征。
6.為達到上述目的，本發明采用的技術方案是：
7.本發明的第一方面，提供一種原位合成膜蛋白親和生物譜柱，所述膜蛋白親和生物譜柱是在硅膠-脂質體載體上原位合成膜蛋白；其制備方法為：采用mpts修飾硅膠與脂質體真空渦旋混合制備空載固定相，再將膜蛋白的cdna和附著脂質體的硅膠同時加入表達體系中合成膜蛋白，得到膜蛋白插入式固定相；將制備好的固定相裝入譜柱中，獲得原位合成膜蛋白親和譜柱。
8.本發明的譜柱綜合了cfe和mpts修飾生物親和譜的優點。首次實現脂質體固定化硅膠載體中膜蛋白的原位合成和單向插入。可應用于靶向膜蛋白的復雜體系活性成分篩選和平衡解離常數的測定，并為膜蛋白固定化親和譜或其他生物固相材料的快速制備提供新的技術手段。
9.本發明所述的原位合成膜蛋白親和譜柱無需復雜的細胞培養和蛋白純化過程，一步可快速制備出含有單一且穩定含量的目標膜蛋白的生物譜固定相。所述的原位合成膜蛋白技術通過在cdna上構建標簽，可實現表征膜蛋白在脂質體膜上的單向插入。
10.進一步的，所述的原位合成膜蛋白親和譜柱的制備方法包含以下步驟：
11.a)二油酰磷脂酰膽堿(dopc)、二油酸磷脂酰乙醇胺(dope)、nbd-二油酰磷脂酰甘油(nbd-dopg)以摩爾比80:20:1溶解于氯仿/甲醇(1:1，v/v)，終濃度為20mg/ml，真空旋蒸；將薄脂膜懸浮于磷酸鹽緩沖液，得到20mg/ml的脂質混合物，超聲10分鐘形成脂質體囊泡，然后用脂質體擠壓機擠壓形成直徑小于100nm的囊泡；
12.b)采用mpts修飾硅膠(使用前120℃活化)與脂質體渦旋混合、4℃過夜孵育制備空載固定相；將膜蛋白的cdna和包裹脂質體的硅膠同時加入表達體系中，在37℃，300rpm振蕩下合成膜蛋白；離心并洗滌得到膜蛋白原位合成的生物固定相；
13.c)將制備好的固定相用裝柱機裝入微柱柱芯中，即得到所述的原位合成膜蛋白親和生物譜柱。
14.進一步的，所述的膜蛋白為pdgfrβ(血小板衍生生長因子受體β，platelet derived growth factor receptor-β),genebank編號：nm_002609.4。
15.可適用于大部分膜蛋白，例如tgfβr，egfr以及g蛋白偶聯受體(gpcrs)家族蛋白等。
16.進一步的，所述的步驟b中3000
×
g離心并洗滌3次得到膜蛋白原位合成的插入式固定相。
17.10.進一步的，所述的步驟c采用sp-403k裝柱器對微柱(400μm，i.d)進行填充。更進一步的，是將制備好的固定相5mg溶于500μl pbs中，置于樣品瓶中，以15rpm的恒定轉速進行磁力攪拌；采用高壓氮氣作為壓力源，在5mpa壓力下填充入內徑為400μm的毛細管譜柱中。
18.本發明的第二方面，提供一種如上所述的原位合成膜蛋白親和譜柱在靶向膜蛋白的復雜體系活性成分篩選中的應用。
19.進一步的，所述的膜蛋白為pdgfrβ，所述的活性成分為靶向pdgfrβ逆轉肝纖維化的活性化合物。
20.更進一步的，所述的原位合成膜蛋白親和譜柱在篩選肝纖維化化合物中的
應用。
21.本發明的第三方面，提供一種如上所述的原位合成膜蛋白親和譜柱在配體與膜蛋白特定區域親和力測定中的應用。
22.相對于現有技術，本發明優點在于：
23.1、本發明采用cell-free蛋白表達和共價固定化親和譜技術，構建新的原位合成膜蛋白生物譜柱。本發明制備的譜柱首次實現將單一的具有天然四級結構的膜蛋白單向插入鍵合脂質體的固定相上。
24.2、原位合成膜蛋白親和譜柱的制備不需要培養細胞或制備重組蛋白；可快速合成單一的、高純的、含量穩定可控的膜蛋白；且膜蛋白在固定相上可保持天然的跨膜結構和一致的朝向；靈活的cdna構建為藥物結合位點的分析提供了可能性。
25.3、原位合成膜蛋白親和譜柱可應用于靶向膜蛋白的復雜體系活性成分篩選、配體與膜蛋白特定區域親和力的測定。
26.4、原位合成膜蛋白親和譜固定相的制備方法適用于大部分膜蛋白，可應用于靶向膜蛋白的先導化合物篩選和與活性組分間的平衡解離常數測定，可為膜蛋白親和生物譜或其他生物固定相的快速制備提供一種實用的方法。
附圖說明
27.圖1為cell-free原位合成膜蛋白pdgfrβ親和生物譜柱的制備及其應用的模式圖。
28.圖2為pdgfrβ微柱的有效性、特異性和蛋白朝向的評價結果。其中，a為pdgf-bb和地塞米松在空載柱上的保留行為；b為pdgf-bb和地塞米松在pdgfrβ柱上的保留行為；c為flag和his標簽抗體在pdgfrβ柱上的保留行為。
29.圖3為pdgfrβ-offline-uplc/ms系統從丹參和五味子提取物中篩選靶向pdgfrβ的親和組分結果。其中，a為丹參和五味子提取物在pdgfrβ柱上的保留行為譜圖；b為丹參和五味子提取物在pdgfrβ柱上有保留和無保留組分的質譜結果；c為丹酚酸b和戈米辛d標準品在pdgfrβ柱的保留行為譜圖。
30.圖4為丹酚酸b、戈米辛d與pdgfrβ相互作用的親和力分析結果。其中，a為前沿譜法測定丹酚酸b與pdgfrβ的親和力結果；b為前沿譜法測定戈米辛d與pdgfrβ的親和力結果。dxms為地塞米松，sal b為丹酚酸b、gom d為戈米辛d。
具體實施方式
31.下面結合實施例和附圖對本發明做進一步詳細說明。所述是對本發明的解釋而不是限定。
32.實施例1：
33.肝纖維化是肝病終末期許多復雜疾病的基礎，也是一個可逆的病理過程。而pdgfrβ是肝纖維化藥物發展的重要靶點之一。本發明制備的原位合成膜蛋白親和譜柱可應用于篩選靶向pdgfrβ逆轉肝纖維化的活性化合物，為肝纖維化提供特異性高、療效好的先導化合物。
34.原位合成pdgfrβ親和譜柱的制備，包含以下步驟：
35.1)脂質體和質粒的制備
36.25ml燒瓶中，dopc、dope、nbd-dopg以摩爾比80:20:1溶解于氯仿/甲醇(1:1，v/v)，終濃度為20mg/ml。溶劑通過真空蒸餾蒸發。然后將薄脂膜懸浮于磷酸鹽緩沖液，得到20mg/ml的脂質混合物，經400w超聲作用10分鐘形成脂質體囊泡，然后用脂質體擠壓器擠壓3-4次，形成直徑小于100nm的脂質囊泡。
37.構建pdgfrβ質粒。將pdgfrβ克隆到pet28質粒載體，命名為pet28-pdgfrβ，在n端添加flag標簽，c端添加融合熒光“cherry”和6his標簽。
38.2)原位合成pdgfrβ親和固定相的制備
39.采用mpts修飾硅膠(使用前120℃活化)與脂質體渦旋混合制備空載固定相，4℃孵育過夜。將構建的pet28-pdgfrβ質粒和硅膠-脂質體同時加入到表達體系中，在37℃、300rpm的搖床振蕩條件下合成pdgfrβ。3000
×
g離心并洗滌3次得到pdgfrβ插入式固定相。
40.3)原位合成pdgfrβ親和生物譜柱的制備
41.采用sp-403k裝柱器對微柱(400μm，i.d)進行填充。將制備好的固定相5mg溶于500μl pbs中，置于樣品瓶中，以15rpm的恒定轉速進行磁力攪拌。采用高壓氮氣作為壓力源，在5mpa壓力下填充入內徑為400μm的毛細管譜柱中。
42.4)原位合成pdgfrβ親和譜柱的效果驗證
43.本發明選取pdgfrβ細胞外結合的配體pdgf-bb作為陽性對照藥物，地塞米松作為陰性對照藥物，用于驗證原位合成pdgfrβ親和生物譜柱的有效性與選擇性。
44.pdgfrβ微柱搭載于agilent 1200系列，配有微升泵和紫外檢測器。流動相為1mm pbs(ph 7.4)，流速10μl/min，柱溫37℃。檢測波長為210～280nm。進樣量為0.1μl。譜數據由chemstation b.04.03收集，并導入origin 8.0制作圖。
45.檢測結果如圖2所示：其中，a為pdgf-bb和地塞米松在空載譜柱上的保留行為；b為pdgf-bb和地塞米松在pdgfrβ柱上的保留行為；c為flag和6his標簽抗體在pdgfrβ柱上的保留行為。
46.上述結果表明pdgf-bb在pdgfrβ柱上表現出較強的保留行為，在35.4min時達到峰值，在陰性對照柱上沒有保留，而地塞米松在兩者上都沒有保留；此外，flag標簽的抗體保留在pdgfrβ柱上，而6his標簽的抗體沒有保留。說明表達的pdgfrβ不僅具有識別和結合配體的活性，且呈現n端朝外單向插入脂質雙層膜的狀態，確保制備的pdgfrβ親和生物譜柱具有良好的篩選活性。
47.實施例2：
48.到目前為止，大多數開發的pdgfrβ抑制劑是激酶抑制劑，特異性較差。作用于pdgfrβ胞外區配體結合域的藥物有望獲得更高的特異性和更低的毒性。丹參、五味子是臨床具有一定抗肝纖維化作用的中藥。本發明制備的原位合成膜蛋白親和譜柱可應用于從丹參、五味子提取物中篩選靶向pdgfrβ胞外區配體結合域的潛在活性成分。原位合成pdgfrβ親和譜固定相的制備方法同實施例1。
49.本發明選取丹參和五味子提取物，用于原位合成pdgfrβ親和譜柱篩選靶向pdgfrβ的抗肝纖維化潛在活性成分的應用。
50.pdgfrβ微柱裝載于agilent 1200系列，配有微升泵和紫外檢測器。流動相為1mm pbs(ph 7.4)，流速10μl/min，柱溫37℃。檢測波長為210～280nm。進樣量為0.1μl。譜數據
由chemstation b.04.03收集，并導入origin 8.0制作圖。
51.每0.5min將丹參和五味子各組分收集到96孔板中，分別收集無保留組分和有保留組分，樣品氮氣吹干后，用20μl甲醇重新溶解樣品，引入agilent 1290uplc-qtof/ms進行分析。譜柱為xbridgetm c18(100
×
2.1mm i.d.，2.5μm，waters，ireland)，流動相為溶劑a(0.1％甲酸)和溶劑b(乙腈)，流速為0.8ml
·
min-1
，采用線性梯度洗脫。
52.檢測結果如圖3所示：其中，a為丹參和五味子提取物在pdgfrβ柱上的譜結果；b為在pdgfrβ柱上有保留和無保留成分的質譜結果；c為丹酚酸b和戈米辛d標準品在pdgfrβ柱的保留行為譜結果。
53.上述結果表明原位合成pdgfrβ親和生物譜柱成功應用于丹參和五味子提取物中篩選靶向于pdgfrβ胞外域的潛在活性成分，篩選到的親和組分分別為丹酚酸b和戈米辛d。
54.實施例3
55.前沿譜主要應用于研究蛋白質與配體之間的相互作用。該方法是將待測化合物配成不同濃度梯度的溶液作為流動相注入生物譜柱中，直至出現突破曲線。化合物與蛋白之間的結合作用表現為達到突破曲線的時間隨濃度的降低而增加。如果化合物與蛋白之間不存在特異性結合作用，則無論配體濃度如何，突破時間都保持不變。本發明制備的原位合成膜蛋白親和生物譜柱可應用于潛在活性成分與pdgfrβ的親和力測定。原位合成pdgfrβ親和譜固定相的制備方法和譜分析方法同實施例1和2。
56.本發明選取丹酚酸b和戈米辛d，用原位合成pdgfrβ親和生物譜柱測定化合物與pdgfrβ相的親和力大小。
57.將丹酚酸b和戈米辛d溶于dmso至50mm作為儲備液，并用pbs稀釋至100、50、25、10、5、1μm的梯度濃度，得到譜流動相。微模式下流速為10μl/min。先用1mm的pbs平衡譜柱，然后將一定濃度的化合物的流動相通過譜柱，形成穩定的突破曲線。在兩種不同濃度之間，用pbs沖洗系統直至紫外吸收恢復至基線。同時用填充空載固定相的譜柱作為對照柱，以消除非特異性相互作用，獲得死時間t0。當非特異性相互作用與特異性相互作用相比可以忽略不計時，捕獲的化合物總量(定義為q)和配體濃度(定義為[l])可以形成等式，計算kd值。
[0058]
檢測結果如圖4所示：其中，a為丹酚酸b在pdgfrβ柱上的前沿譜親和力測定結果；b為戈米辛d在pdgfrβ柱上的前沿譜親和力測定結果。
[0059]
上述結果表明丹酚酸b和戈米辛d與pdgfrβ具有典型的單位點相互作用模式，kd值分別為13.44μm和7.39μm。進一步說明原位合成pdgfrβ親和生物譜柱可提供具有生物活性的朝向一致的pdgfrβ，用于分析化合物與蛋白之間的親和力大小。
[0060]
以上已對本發明創造的較佳實施例進行了具體說明，但本發明創造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發明創造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本技術權利要求所限定的范圍內。
技術特征：
1.一種原位合成膜蛋白親和生物譜柱，其特征在于，所述膜蛋白親和生物譜柱是在硅膠-脂質體載體上原位合成膜蛋白；其制備方法為：采用mpts修飾硅膠與脂質體真空渦旋混合制備空載固定相，再將膜蛋白的cdna和附著脂質體的硅膠同時加入cell-free表達體系中合成膜蛋白，得到膜蛋白插入式固定相；將制備好的固定相裝入譜柱中，獲得原位合成膜蛋白親和譜柱。2.根據權利要求1所述的原位合成膜蛋白親和生物譜柱，其特征在于，所述的原位合成膜蛋白親和譜柱的制備方法包含以下步驟：a)dopc、dope、nbd-dopg以摩爾比80:20:1溶解于1:1(v/v)的氯仿/甲醇，終濃度為20mg/ml，真空旋蒸；將薄脂膜懸浮于磷酸鹽緩沖液，得到20mg/ml的脂質混合物，超聲10分鐘形成脂質體囊泡，然后用脂質體擠壓機擠壓形成直徑小于100nm的囊泡；b)采用mpts修飾硅膠與脂質體渦旋混合、4℃過夜孵育制備空載固定相；將膜蛋白的cdna和包裹脂質體的硅膠同時加入cell-free表達體系中，在37℃，300rpm振蕩下合成膜蛋白；離心并洗滌得到膜蛋白原位合成的生物固定相；c)將制備好的固定相用裝柱機裝入微柱柱芯中，即得到所述的原位合成膜蛋白親和生物譜柱。3.根據權利要求1所述的原位合成膜蛋白親和生物譜柱，其特征在于，所述的膜蛋白為pdgfrβ。4.根據權利要求2所述的原位合成膜蛋白親和生物譜柱，其特征在于，所述的步驟b中3000
×
g離心并洗滌3次得到膜蛋白原位合成的插入式固定相。5.根據權利要求2所述的原位合成膜蛋白親和生物譜柱，其特征在于，所述的步驟c采用sp-403k裝柱器對微柱(400μm，i.d)進行填充。6.根據權利要求5所述的原位合成膜蛋白親和生物譜柱，其特征在于，是將制備好的固定相5mg溶于500μl pbs中，置于樣品瓶中，以15rpm的恒定轉速進行磁力攪拌；采用高壓氮氣作為壓力源，在5mpa壓力下填充入內徑為400μm的毛細管譜柱中。7.一種如權利要求1所述的原位合成膜蛋白親和譜柱的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：a)dopc、dope、nbd-dopg以摩爾比80:20:1溶解于1:1(v/v)的氯仿/甲醇，終濃度為20mg/ml，真空旋蒸；將薄脂膜懸浮于磷酸鹽緩沖液，得到20mg/ml的脂質混合物，超聲10分鐘形成脂質體囊泡，然后用脂質體擠壓機擠壓形成直徑小于100nm的囊泡；b)采用mpts修飾硅膠與脂質體渦旋混合、4℃過夜孵育制備空載固定相；將膜蛋白的cdna和包裹脂質體的硅膠同時加入表達體系中，在37℃，300rpm振蕩下合成膜蛋白；離心并洗滌得到膜蛋白原位合成的生物固定相；c)將制備好的固定相用裝柱機裝入微柱柱芯中，即得到所述的原位合成膜蛋白親和生物譜柱。8.一種如權利要求1-6任一所述的原位合成膜蛋白親和譜柱在靶向膜蛋白的復雜體系活性成分篩選中的應用。9.一種如權利要求1-6任一所述的原位合成膜蛋白親和譜柱在配體與膜蛋白特定區域親和力測定中的應用。
技術總結
本發明涉及生物譜領域，具體是一種原位合成膜蛋白親和生物譜柱及其制備方法和應用，所述方法采用cell-free蛋白表達和共價固定化親和譜技術，構建新的原位合成膜蛋白生物譜柱。本發明制備的譜柱首次實現將單一的具有天然四級結構的膜蛋白單向插入鍵合脂質體的固定相上。本發明不需要培養細胞或制備重組蛋白；可快速合成單一的、高純的、含量穩定可控的膜蛋白；且膜蛋白在固定相上可保持天然的跨膜結構和一致的朝向；靈活的cDA構建為藥物結合位點的分析提供了可能性。本發明可應用于靶向膜蛋白的先導化合物篩選和平衡解離常數測定，為膜蛋白固定化親和生物譜或其他生物固相材料的快速制備提供一種實用的方法。物固相材料的快速制備提供一種實用的方法。
