一種生物堿化合物及其應用的制作方法
1.本發明屬生物醫藥和食品技術領域，具體涉及一種從冠突散囊菌中提取分離的化合物及其在制備脂肪肝疾病藥物、或者具有緩解脂肪肝的功能食品中的應用。
背景技術：
2.微生物在藥物開發中發揮了十分重要的作用，如青霉素、鏈霉素、阿維菌素、洛伐他汀等等。從1928年弗萊明發現青霉素開始，青霉素作為一種救命藥物進入了人類的生活，第二次世界大戰，青霉素實現了產業化，人們利用遺傳學方法不斷改進培養基和發酵條件，使微生物按著人們要求的合成路線大量地生產青霉素。微生物為人類的健康和藥物的開發做出了重要的貢獻。
3.非酒精性脂肪肝是一種無過量飲酒史、肝實質細胞脂肪變性和脂肪堆積為特征的臨床病理綜合征。它與高血脂癥及胰島素抵抗密切相關，可進一步發展為脂肪性肝炎、肝硬化和肝細胞癌等。目前為止還沒有批準非酒精性脂肪肝的藥物，該領域藥物研發工作十分活躍，具有廣闊的應用前景。
4.茯磚茶屬于六大茶類中黑茶的一種，在微生物的作用下，這種發酵茶發生了深度的生理生化變化，從而形成了獨特的風味。
技術實現要素：
5.本發明從冠突散囊菌中提取分離出一種生物堿性化合物，其在制備脂肪肝疾病藥物，或具有緩解脂肪肝的功能食品。
6.本發明首先提供一種化合物，其結構式如下；。
7.進而，本發明還提供所述化合物及其類似物、衍生物、前藥、代謝物及其活性鹽,其中代表性的酸加成鹽包括但不限于乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽(異硫代硫酸鹽，isothionate)、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、 2-萘磺酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽、碳酸氫鹽、對甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。同樣，堿性含氮基團可用以下物質季銨化：低級烷基鹵化物如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化
物；硫酸二烷基酯如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；長鏈鹵化物如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物；芳基烷基鹵化物如芐基溴和苯乙基溴等。
8.可將本發明的化合物形成藥學上可接受的酸加成鹽的酸實例包括無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸，以及有機酸如草酸、馬來酸、琥珀酸和檸檬酸。
9.本發明提供的化合物及其類似物、衍生物、前藥、代謝物及其活性鹽在制備脂肪肝疾病藥物、以及作為食品添加劑用于開發緩解脂肪肝以制備功能食品中的應用。
10.本發明還提供冠突散囊菌（eurotium cristatum）sxhbtbu1934，其保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：cgmcc no.21026。
11.進一步提供利用所述的冠突散囊菌（eurotium cristatum）sxhbtbu1934制備如下式化合物的方法，將所述的冠突散囊菌發酵培養，在發酵產物中提取所述化合物：。
12.優選地，將所述的冠突散囊菌（eurotium cristatum）sxhbtbu1934接種到滅菌的含有茶葉、大米、玉米、糙米、小麥、橘子皮、柚子皮的培養基上，在25-32
°
c靜置發酵培養7-30天；然后在發酵產物中提取所述化合物。
13.更具體地，取發酵后的產物用乙醇浸泡過夜，抽濾后用旋轉蒸發儀蒸干，再用乙酸乙酯：去離子水進行萃取，萃取三次得到有機層繼續蒸干，稱重后溶解到二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中，以重量比為發酵粗提物：柱層析硅膠（100-200目）=1：1.3—1.7拌樣品，進行減壓柱層析分離；柱層析用正己烷、二氯甲烷不同配比的有機溶劑體系洗脫，體積比為2:98的正己烷:二氯甲烷，獲得樣品；利用凝膠sephadex lh-20柱譜進行分離，洗脫劑為正己烷：二氯己烷（體積比為2：1），得到餾分3；優選地，還利用反相高效液相譜進行純化，譜柱為agilent反相c18譜柱，流動相為40%乙腈的水溶液-100%乙腈（時間為20分鐘），得到純的所述化合物。
14.附圖說明
15.圖1 基于鈣調蛋白基因序列構建的系統發育樹。
16.圖2是化合物的反相高效液相譜圖。
17.圖3是化合物的質譜圖。
18.圖4是化合物的核磁共振氫譜圖。
19.圖5是化合物的核磁共振碳譜圖。
20.圖6化合物在hepg2細胞模型中對脂質堆積的半抑制濃度。
21.生物材料保藏信息：本發明中的冠突散囊菌（eurotium cristatum）sxhbtbu1934，其保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為cgmcc，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中科院微生物研究所，保藏時間為：2020年12月21日，保藏號為：cgmcc no.21026。
22.具體實施方式
23.下面通過具體實施例來進一步闡述本發明，以期對本發明有更好的理解，但并不構成對本發明的限制。
24.實施例11.真菌的分離根據文獻（楊瑞娟，王橋美，彭文書，季愛兵，張文杰，嚴亮，8 種市售“金花”茶中微生物的分離鑒定，熱帶農業科學，2019,39（10），81-88）的方法，從陜西省西安市新咸西區市售茯茶中分離到冠突散囊菌（eurotium cristatum）sxhbtbu1934。
25.具體過程如下：菌株分離：分離菌株的來源：所用茯磚茶購買于陜西省西安市新咸西區市場。
26.采用的培養基：麥芽提取物瓊脂培養基（mea，每升培養基）：麥芽浸粉（malt extract）30. 0 g，蛋白胨（peptone）5. 0 g，瓊脂（agar）15. 0 g， ph 6.0；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（sda，每升培養基）：蛋白胨（peptone）5. 0 g，胰蛋白胨（tryptone），葡萄糖（glucose）40. 0 g，瓊脂（agar）15. 0 g，ph 4.0
???
6.0（調到6.0就行，不能太低）；培養基滅菌放置不燙手背時（溫度約為40
°
c左右），同時加入氯霉素和鏈霉素至終濃度為0.2 mg/ml（提前配置好，用0.22
μ
m微孔濾膜過濾，-20℃存儲），混勻后倒平板，用于抑制細菌生長。
27.分離方法：稱取10g茯磚茶，加入100ml無菌水，浸泡10分鐘，震搖使茶葉分散開。取200 μl的懸液（3個稀釋度10-3
、10-4
、10-5
），涂布在分離培養基mea和sda上，倒置于28
°
c培養。培養第二天后，觀察平板真菌菌落出菌情況，并及時挑出，隨后每天觀察一次，出現新真菌菌落及時挑取。
28.菌株鑒定：菌株在mea平皿培養基上培養7天后，菌落近似于圓形，中心有凸起，呈現棕褐，顏從中心向外顏變淺，由褐變為棕、金黃到淺黃，菌落有少量液滴滲出，菌絲向四周延伸，菌絲形態明顯，邊緣較為整齊；菌落背面光滑無脊，隨著培養時間延長，產生的素使培養基呈現黑褐。
29.從生長7天的培養皿上用接種針切取約1
?
cm2菌體于離心管中，加入800
?
μl dna提取試劑，加入一顆鋼珠（便于細胞破碎），將離心管對稱置于scientz-48高通量組織研磨器中，破碎菌體細胞，獲得待測菌株基因組dna,并對其進行pcr擴增。采用真菌通用引物mdad1
（5
’?
gccgactctttgactgaagagc-3’）和cmdq1（5
’?
gcatcatgagctggacgaattc-3’）擴增鈣調蛋白基因序列。
30.pcr擴增體系（50
?
μl）：10
×
buffer 5
?
μl，2.5 mmdntp5
?
μl，25mm mgcl25
?
μl，模板dna 5
?
μl，引物its4和its5各0.5
?
μl，taq dna聚合酶0.5
?
μl，ddh2o34.5
?
μl。反應程序：94
?
℃預變性4 min，94
?
℃變性1
?
min，55 ℃退火4 min，72
?
℃延伸1.5 min，共37個循環，72
?
℃延伸10 min，最后于25
?
℃下保存。
31.菌株鈣調蛋白基因序列與nrrl4222相似度為100%，因此鑒定菌種為冠突散囊菌（eurotium cristatum），根據鈣調蛋白基因序列進行構建系統發育樹如圖1所示。該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：cgmcc no.21026，保藏時間為：2020年12月21日。
32.真菌的發酵培養將經活化的冠突散囊菌制成孢子懸浮液，再接種到滅菌的茶葉（茶葉重量30%蒸餾水）、大米（加大米重量100%的蒸餾水）、玉米（加玉米重量100%的蒸餾水）、糙米（加糙米重量100%的蒸餾水）、小麥（加小麥重量100%的蒸餾水）、橘子皮（加橘子皮重量40%的蒸餾水）、柚子皮（加柚子皮重量40%的蒸餾水）等任何適合冠突散囊菌生長的培養基上，在25-32
°
c（本實施例中28
°
c）靜置發酵培養7-30天（本實施例中培養19天）。
33.活性化合物的制備發酵后的產物利用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、乙醚、超臨界萃取等方法（但不限于以上方法）進行提取，獲得提取物。
34.具體方法如下：上述茶葉、大米、玉米、糙米、小麥、橘子皮、柚子皮等培養基上發酵7-30天（本實施例中培養19天）。各種培養基都用液相譜分析過，都產這個化合物發酵產物（包括菌和培養基）加入乙醇浸泡過夜，抽濾后用旋轉蒸發儀蒸干，再用乙酸乙酯：去離子水=1：1進行萃取，萃取三次得到有機層繼續蒸干，稱重后溶解到二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中，以重量比為發酵粗提物：柱層析硅膠（100-200目）=1：1.5拌樣品，待有機溶劑揮干后進行減壓柱層析分離。
35.柱層析用正己烷、二氯甲烷不同配比的有機溶劑體系洗脫，體積比分別為100%正己烷（餾分1）、1:99（正己烷:二氯甲烷，獲得樣品a，餾分2）、2:98（正己烷:二氯甲烷，獲得樣品，餾分3）、3:97（正己烷:二氯甲烷，獲得樣品，餾分4）、4:96（正己烷:二氯甲烷，獲得樣品，餾分5）、5:95（正己烷:二氯甲烷，獲得樣品，餾分6）、6:94（正己烷:二氯甲烷，獲得樣品，餾分7）、8:92（正己烷:二氯甲烷，獲得樣品，餾分8）、10:90（正己烷:二氯甲烷，獲得樣品，餾分9）進行洗脫，得到極性從小到大的8個餾分。
36.樣品b利用凝膠sephadex lh-20柱譜進行分離，洗脫劑為正己烷：二氯己烷（體積比為2：1），每10ml收集1個餾分，根據高效液相譜分析結果進行合并后，得到5個餾分。
37.其中餾分3利用反相高效液相譜進行純化，譜柱為agilent反相c18譜柱，流動相為40%乙腈的水溶液-100%乙腈（時間為20分鐘），得到一種化合物。
38.化合物的結構鑒定采用hplc對制得的該化合物進行純度鑒定（圖2），純度大于98%的樣品利用質譜和核磁共振技術進行結構鑒定，核磁共振用bruker avance drx-500核磁共振儀測定；質譜利用沃特世waters g2-xs質譜儀測定。
39.該目標化合物的質譜圖見圖3，其正離子模式的高分辨準分子離子峰為[m+h]
+
m/z408.2289。
[0040]
該目標化合物的核磁共振氫譜圖如圖4，具體數據δh(cdcl3) ：9.65 (s)，7.47 (s)，7.22 (s)，7.19 (d, j = 8.0 hz)，7.08 (dd, j = 8.0, 8.0 hz)，6.99 (d, j = 8.0 hz)，6.48 (d, j = 12.5 hz)，6.07, (dd, j = 17.5, 10.5 hz)，5.17 (d, j = 10.5 hz)，5.15 (d, j = 17.5 hz)，4.1129 (m)，3.24 (d, j= 14.5 hz)，3.01 (d, j= 4.5 hz)，2.92 (m)，1.60 (d, j= 7.0 hz)，1.55 (s, )，1.51 (s)，1.40 (s)。
[0041]
該目標化合物的核磁共振碳譜圖如圖5，具體數據δ
c (cdcl3) ：19.2，21，25，27.5，27.5，29.8，33.7，39.3，51.8，60.4，64.4，103.2，112.7，112.9，117.8，121.1，122.2，122.7，124，126.3，134.2，144.3，144.6，160.1，165.8；最終確定該目標化合物的分子結構式如下：。
[0042]
4.化合物在hepg2模型上對脂肪累計的影響體外脂肪變性細胞模型因其影響因素少、實驗條件可控而得到廣泛應用于非酒精性脂肪肝病變過程中的肝細胞脂質沉積，多以肝癌細胞株hepg2為研究對象，通過施加不同比例、濃度的油酸和棕櫚酸混合物誘導建造模型。肝內脂質沉積及脂肪變性是指肝細胞內甘油三酯過量堆積，因此肝細胞內脂質堆積情況為評價抗非酒精性脂肪肝活性較敏感的指標。
[0043]
本實驗為在體外模擬非酒精性脂肪肝病發生過程，采用油酸（oa）誘導人肝癌hepg2細胞建立非酒精性脂肪肝細胞模型。應用bodipy熒光法檢測化合物對hepg2細胞內脂質堆積的影響，同時采用比法測定化合物對細胞活性的影響，從而評價化合物的抗非酒精性脂肪肝活性。
[0044]
hepg2細胞常規培養方式，即用含10%胎牛血清、雙抗(100 u/ml青霉素與100 u/ml鏈霉素)的dmem培養基，置于37
?°
c、5% co2培養箱中培養。當細胞密度達到80%時，以1: 3的比例傳代培養。當細胞呈對數增長時鋪板，細胞96孔鋪板（每孔100
μ
g），37℃，過夜培養。
[0045]
細胞培養過夜后，棄去上清，加入含0.25mm油酸的培養液（90
μ
g）孵育24h，造模成功后模型組換成常規細胞培養液。
[0046]
給藥組：油酸誘導成功的模型組加入不同濃度待測化合物10μl/孔（濃度分別為：0.0001
μ
g/ml，0.001
μ
g/ml，0.01
μ
g/ml，0.1
μ
g/ml，1
μ
g/ml，10
μ
g/ml，100
μ
g/ml，1000
μ
g/ml），孵育24 h。
[0047]
正常對照組（未用油酸誘導的細胞）和模型對照組（油酸誘導成功的模型組不加藥物作為對照組）加入生理鹽水10μl/孔。
[0048]
油紅o染方法如下：細胞給藥培養24h后棄去上清，用pbs緩沖液清洗2-3次，加入4%多聚甲醛溶液固定15-20 min。棄去固定液，加入油紅o工作液50 μl/孔，室溫放置1 h。棄去染液，用pbs清洗3-5次，洗去多余的雜質和沉淀。顯微鏡下觀察hepg2細胞形態及脂滴分
布情況，并拍照記錄實驗結果。
[0049]
計算方法：抑制率（%）=實驗結果如圖6所示。經計算，化合物在hepg2細胞模型中對脂質堆積的半抑制濃度ic
50
為0.052
μ
g/ml。
[0050]
因此，本發明從冠突散囊菌中提取分離出一種生物堿性類的新結構化合物，該化合物在體外細胞模型中降低了hepg2細胞內脂質沉積，可用于開發非酒精性脂肪肝疾病藥物。
