過氧化氫酶制備的發酵工藝的制作方法
1.本發明涉及酶發酵制備工藝技術領域，具體為過氧化氫酶制備的發酵工藝。
背景技術：
2.過氧化氫酶(cat)，是一種催化過氧化氫分解成氧和水的酶，存在于細胞的過氧化物體內，過氧化氫酶是過氧化物酶體的標志酶,約占過氧化物酶體酶總量的40％。過氧化氫酶的應用較為廣泛，過氧化氫酶在食品工業中也被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的過氧化氫；除此之外，過氧化氫酶也被用于食品包裝，防止食物被氧化；在紡織工業中，過氧化氫酶被用于除去紡織物上的過氧化氫，以保證成品是不含過氧化物的，在實驗室中還常常被用作了解酶對反應速率影響的工具。
3.過氧化氫酶存在于所有已知的動物的各個組織中，特別在肝臟中以高濃度存在，但是會受限于原料來源，而微生物生產過氧化氫酶原料充足，所以越來越多的過氧化氫酶通過微生物發酵獲得，而微生物的生長離不開碳源、氮源等營養物質，同時過氧化氫酶的合成受發酵條件的影響條件不同所產生的酶量不同，因此提高其產酶水平需要進行發酵條件的優化。
4.因為過氧化氫酶的應用廣泛，具有較為重要的作用，而目前制備過氧化氫酶的工藝多種多樣，所以如何提高過氧化氫酶的酶量，需要優化發酵條件。鑒于此，我們提出過氧化氫酶制備的發酵工藝。
技術實現要素：
5.為了彌補以上不足，本發明提供了過氧化氫酶制備的發酵工藝。
6.本發明的技術方案是：
7.過氧化氫酶制備的發酵工藝，具體工藝過程包括：
8.菌種培養，所述菌種培養包括制備菌種培養基，并且基于菌種培養基能夠培養菌數量，且制備得到發酵種液；
9.種液菌種產酶優化，所述種液菌種產酶優化包括向發酵培養基中添加能夠優化過氧化氫酶產量和酶體活力的碳源和氮源營養物質，且向發酵培養基中添加能夠影響酶體活力的金屬離子。
10.優選的，菌種培養基的培養液各成分及制備工藝為：將5g蛋白胨、10g葡萄糖、20g瓊脂和水1000ml充分混勻，并添加1％濃度的孟加拉紅水溶液3.3ml。
11.優選的，將所有菌種培養基在使用前保持密閉狀態經過125攝氏度高溫蒸汽殺菌，并自然冷卻至室溫待用。
12.優選的，將待培育的原始菌種放入蒸汽殺菌并冷卻后的菌種培養基內培養24小時，保持溫度范圍20-30攝氏度，篩選得到能夠產生過氧化氫酶的菌種。
13.優選的，發酵種液的制備具體工藝為：從菌種培養基中篩選挑取培養完成的菌體，并將菌體轉接入含50ml菌種培養基培養液的250ml搖瓶中，將搖瓶放置在全溫空氣搖床上
進行菌種培養，使得菌種充分混合混勻，得到發酵種液。
14.優選的，發酵種液制備條件具體為：200r/min，20-30℃培養24h，ph值為7.0。
15.優選的，發酵培養基在菌種培養基的組成成分基礎上，添加碳源、氮源和金屬離子，并使其組分充分混勻形成發酵培養基培養液。
16.優選的，將發酵種液按1.5％-2.5％的接種量取出菌懸液，并將該菌懸液轉接入含有發酵培養基培養液的發酵罐中，發酵形成含有過氧化氫酶菌體細胞的發酵液。
17.優選的，控制發酵溫度20-30℃，200r/min條件下發酵24-72h。
18.優選的，將發酵后形成的發酵液中加入20ml的50mmol/l的磷酸鹽緩沖液來重懸菌體，并在冰浴中用超聲破碎含有過氧化氫酶的菌體細胞，經過離心機離心處理后過濾上清液，該上清液即為含有過氧化氫酶的粗酶液。
19.與現有技術相比，本發明的有益效果是：
20.該過氧化氫酶制備的發酵工藝，通過菌種培養過程可以初步培育篩選原始菌種，得到狀況良好具有正常活性的菌種，并通過菌種培養基快速繁育菌種形成含有大量菌的發酵種液，通過發酵種液中添加碳源和氮源營養物質，可以為發酵過程菌體細胞提供充足能量并促進其產酶，同時碳源、氮源和金屬離子可以有效提高發酵得到的過氧化氫酶體的活力，即該工藝可以提高過氧化氫酶的產量，并使其具有更好的酶活性。
具體實施方式
21.下面將結合本發明實施例中的內容，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
22.實施例1
23.過氧化氫酶制備的發酵工藝，具體工藝過程包括：
24.菌種培養，菌種培養包括制備菌種培養基，并且基于菌種培養基能夠培養菌數量，且制備得到發酵種液；
25.種液菌種產酶優化，種液菌種產酶優化包括向發酵培養基中添加能夠優化過氧化氫酶產量和酶體活力的碳源和氮源營養物質，且向發酵培養基中添加能夠影響酶體活力的金屬離子。
26.菌種培養基的培養液各成分及制備工藝為：將5g蛋白胨、10g葡萄糖、20g瓊脂和水1000ml充分混勻，并添加1％濃度的孟加拉紅水溶液3.3ml，提供基礎的菌培育能量。
27.將所有菌種培養基在使用前保持密閉狀態經過125攝氏度高溫蒸汽殺菌，并自然冷卻至室溫待用。
28.將待培育的原始菌種放入蒸汽殺菌并冷卻后的菌種培養基內培養24小時，保持溫度范圍20-30攝氏度，篩選得到能夠產生過氧化氫酶的菌種，主要篩除培育過程中失活或者活性較低的菌種，提高后期發酵效率，本實施例溫度為25攝氏度。
29.發酵種液的制備具體工藝為：從菌種培養基中篩選挑取培養完成的菌體，并將菌體轉接入含50ml菌種培養基培養液的250ml搖瓶中，將搖瓶放置在全溫空氣搖床上進行菌種培養，使得菌種充分混合混勻，得到發酵種液。
30.發酵種液制備條件具體為：200r/min，20-30℃培養24h，ph值為7.0，本實施例溫度為25攝氏度。
31.發酵培養基在菌種培養基的組成成分基礎上，添加碳源、氮源和金屬離子，并使其組分充分混勻形成發酵培養基培養液。
32.將發酵種液按1.5％-2.5％的接種量取出菌懸液，并將該菌懸液轉接入含有發酵培養基培養液的發酵罐中，發酵形成含有過氧化氫酶菌體細胞的發酵液，1.5％-2.5％的選取量影響初始發酵的菌數量，過高的量無法充分發酵，過少會造成浪費，影響生產發酵的效率，本實施例選取1.5％。
33.控制發酵溫度20-30℃，200r/min條件下發酵24-72h，具體為25攝氏度下發酵48小時。
34.將發酵后形成的發酵液中加入20ml的50mmol/l的磷酸鹽緩沖液來重懸菌體，并在冰浴中用超聲破碎含有過氧化氫酶的菌體細胞，經過離心機離心處理后過濾上清液，該上清液即為含有過氧化氫酶的粗酶液
35.需要說明的是，碳源可選種類為麥芽糖、淀粉、葡萄糖、甘油和蔗糖作為碳源物質；氮源可選硫酸銨、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作為氮源，金屬離子可添加mgcl2、cacl2、mgcl2、kh2po4或nacl獲得。
36.本實施例選用黃曲霉作為發酵菌種，并且本實施例中碳源添加量為5g/l，氮源添加量為5g/l，并添加0.001mol/l的金屬離子，本實施例優選麥芽糖作為碳源，牛肉膏作為氮源和cacl2作為提供金屬離子的物質。
37.對比例1
38.過氧化氫酶制備的發酵工藝，具體工藝過程包括：
39.菌種培養，菌種培養包括制備菌種培養基，并且基于菌種培養基能夠培養菌數量，且制備得到發酵種液；
40.種液菌種產酶優化，種液菌種產酶優化包括向發酵培養基中添加能夠優化過氧化氫酶產量和酶體活力的碳源和氮源營養物質，且向發酵培養基中添加能夠影響酶體活力的金屬離子。
41.菌種培養基的培養液各成分及制備工藝為：將5g蛋白胨、10g葡萄糖、20g瓊脂和水1000ml充分混勻，并添加1％濃度的孟加拉紅水溶液3.3ml，提供基礎的菌培育能量。
42.將所有菌種培養基在使用前保持密閉狀態經過125攝氏度高溫蒸汽殺菌，并自然冷卻至室溫待用。
43.將待培育的原始菌種放入蒸汽殺菌并冷卻后的菌種培養基內培養24小時，保持溫度范圍20-30攝氏度，篩選得到能夠產生過氧化氫酶的菌種，主要篩除培育過程中失活或者活性較低的菌種，提高后期發酵效率，本對比例溫度為25攝氏度。
44.發酵種液的制備具體工藝為：從菌種培養基中篩選挑取培養完成的菌體，并將菌體轉接入含50ml菌種培養基培養液的250ml搖瓶中，將搖瓶放置在全溫空氣搖床上進行菌種培養，使得菌種充分混合混勻，得到發酵種液。
45.發酵種液制備條件具體為：200r/min，20-30℃培養24h，ph值為7.0，本對比例溫度為25攝氏度。
46.發酵培養基在菌種培養基的組成成分基礎上，添加碳源、氮源和金屬離子，并使其
組分充分混勻形成發酵培養基培養液。
47.將發酵種液按1.5％-2.5％的接種量取出菌懸液，并將該菌懸液轉接入含有發酵培養基培養液的發酵罐中，發酵形成含有過氧化氫酶菌體細胞的發酵液，1.5％-2.5％的選取量影響初始發酵的菌數量，過高的量無法充分發酵，過少會造成浪費，影響生產發酵的效率，本對比例選取1.5％。
48.控制發酵溫度20-30℃，200r/min條件下發酵24-72h，具體為25攝氏度下發酵48小時。
49.將發酵后形成的發酵液中加入20ml的50mmol/l的磷酸鹽緩沖液來重懸菌體，并在冰浴中用超聲破碎含有過氧化氫酶的菌體細胞，經過離心機離心處理后過濾上清液，該上清液即為含有過氧化氫酶的粗酶液
50.需要說明的是，碳源可選種類為麥芽糖、淀粉、葡萄糖、甘油和蔗糖作為碳源物質；氮源可選硫酸銨、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作為氮源，金屬離子可添加mgcl2、cacl2、mgcl2、kh2po4或nacl獲得。
51.本對比例選用黃曲霉作為發酵菌種，并且本對比例中碳源添加量為5g/l，氮源添加量為5g/l，并添加0.001mol/l的金屬離子，本對比例優選淀粉作為碳源，牛肉膏作為氮源和cacl2作為提供金屬離子的物質。
52.對比例2
53.過氧化氫酶制備的發酵工藝，具體工藝過程包括：
54.菌種培養，菌種培養包括制備菌種培養基，并且基于菌種培養基能夠培養菌數量，且制備得到發酵種液；
55.種液菌種產酶優化，種液菌種產酶優化包括向發酵培養基中添加能夠優化過氧化氫酶產量和酶體活力的碳源和氮源營養物質，且向發酵培養基中添加能夠影響酶體活力的金屬離子。
56.菌種培養基的培養液各成分及制備工藝為：將5g蛋白胨、10g葡萄糖、20g瓊脂和水1000ml充分混勻，并添加1％濃度的孟加拉紅水溶液3.3ml，提供基礎的菌培育能量。
57.將所有菌種培養基在使用前保持密閉狀態經過125攝氏度高溫蒸汽殺菌，并自然冷卻至室溫待用。
58.將待培育的原始菌種放入蒸汽殺菌并冷卻后的菌種培養基內培養24小時，保持溫度范圍20-30攝氏度，篩選得到能夠產生過氧化氫酶的菌種，主要篩除培育過程中失活或者活性較低的菌種，提高后期發酵效率，本對比例溫度為25攝氏度。
59.發酵種液的制備具體工藝為：從菌種培養基中篩選挑取培養完成的菌體，并將菌體轉接入含50ml菌種培養基培養液的250ml搖瓶中，將搖瓶放置在全溫空氣搖床上進行菌種培養，使得菌種充分混合混勻，得到發酵種液。
60.發酵種液制備條件具體為：200r/min，20-30℃培養24h，ph值為7.0，本對比例溫度為25攝氏度。
61.發酵培養基在菌種培養基的組成成分基礎上，添加碳源、氮源和金屬離子，并使其組分充分混勻形成發酵培養基培養液。
62.將發酵種液按1.5％-2.5％的接種量取出菌懸液，并將該菌懸液轉接入含有發酵培養基培養液的發酵罐中，發酵形成含有過氧化氫酶菌體細胞的發酵液，1.5％-2.5％的選
取量影響初始發酵的菌數量，過高的量無法充分發酵，過少會造成浪費，影響生產發酵的效率，本對比例選取1.5％。
63.控制發酵溫度20-30℃，200r/min條件下發酵24-72h，具體為25攝氏度下發酵48小時。
64.將發酵后形成的發酵液中加入20ml的50mmol/l的磷酸鹽緩沖液來重懸菌體，并在冰浴中用超聲破碎含有過氧化氫酶的菌體細胞，經過離心機離心處理后過濾上清液，該上清液即為含有過氧化氫酶的粗酶液
65.需要說明的是，碳源可選種類為麥芽糖、淀粉、葡萄糖、甘油和蔗糖作為碳源物質；氮源可選硫酸銨、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作為氮源，金屬離子可添加mgcl2、cacl2、mgcl2、kh2po4或nacl獲得。
66.本對比例選用黃曲霉作為發酵菌種，并且本對比例中碳源添加量為5g/l，氮源添加量為5g/l，并添加0.001mol/l的金屬離子，本對比例優選麥芽糖作為碳源，蛋白胨作為氮源和cacl2作為提供金屬離子的物質。
67.對比例3
68.過氧化氫酶制備的發酵工藝，具體工藝過程包括：
69.菌種培養，菌種培養包括制備菌種培養基，并且基于菌種培養基能夠培養菌數量，且制備得到發酵種液；
70.種液菌種產酶優化，種液菌種產酶優化包括向發酵培養基中添加能夠優化過氧化氫酶產量和酶體活力的碳源和氮源營養物質，且向發酵培養基中添加能夠影響酶體活力的金屬離子。
71.菌種培養基的培養液各成分及制備工藝為：將5g蛋白胨、10g葡萄糖、20g瓊脂和水1000ml充分混勻，并添加1％濃度的孟加拉紅水溶液3.3ml，提供基礎的菌培育能量。
72.將所有菌種培養基在使用前保持密閉狀態經過125攝氏度高溫蒸汽殺菌，并自然冷卻至室溫待用。
73.將待培育的原始菌種放入蒸汽殺菌并冷卻后的菌種培養基內培養24小時，保持溫度范圍20-30攝氏度，篩選得到能夠產生過氧化氫酶的菌種，主要篩除培育過程中失活或者活性較低的菌種，提高后期發酵效率，本對比例溫度為25攝氏度。
74.發酵種液的制備具體工藝為：從菌種培養基中篩選挑取培養完成的菌體，并將菌體轉接入含50ml菌種培養基培養液的250ml搖瓶中，將搖瓶放置在全溫空氣搖床上進行菌種培養，使得菌種充分混合混勻，得到發酵種液。
75.發酵種液制備條件具體為：200r/min，20-30℃培養24h，ph值為7.0，本對比例溫度為25攝氏度。
76.發酵培養基在菌種培養基的組成成分基礎上，添加碳源、氮源和金屬離子，并使其組分充分混勻形成發酵培養基培養液。
77.將發酵種液按1.5％-2.5％的接種量取出菌懸液，并將該菌懸液轉接入含有發酵培養基培養液的發酵罐中，發酵形成含有過氧化氫酶菌體細胞的發酵液，1.5％-2.5％的選取量影響初始發酵的菌數量，過高的量無法充分發酵，過少會造成浪費，影響生產發酵的效率，本對比例選取1.5％。
78.控制發酵溫度20-30℃，200r/min條件下發酵24-72h，具體為25攝氏度下發酵48小
時。
79.將發酵后形成的發酵液中加入20ml的50mmol/l的磷酸鹽緩沖液來重懸菌體，并在冰浴中用超聲破碎含有過氧化氫酶的菌體細胞，經過離心機離心處理后過濾上清液，該上清液即為含有過氧化氫酶的粗酶液
80.需要說明的是，碳源可選種類為麥芽糖、淀粉、葡萄糖、甘油和蔗糖作為碳源物質；氮源可選硫酸銨、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作為氮源，金屬離子可添加mgcl2、cacl2、mgcl2、kh2po4或nacl獲得。
81.本對比例選用黃曲霉作為發酵菌種，并且本對比例中碳源添加量為5g/l，氮源添加量為5g/l，并添加0.001mol/l的金屬離子，本對比例優選麥芽糖作為碳源，牛肉膏作為氮源和mgcl2作為提供金屬離子的物質。
82.碳源平行對照例
83.該碳源平行對照例具有多組，且與實施例1和對比例1之間的區別僅限于碳源選擇不同，其添加量均為5g/l,如下表所示：
[0084] 葡萄糖淀粉甘油蔗糖麥芽糖酶產量(u/ml)17501685143220382487酶活性(u/mg)34103973320840575226
[0085]
得出結論：添加碳源可以促進過氧化氫酶的產量和活性，選擇合適的碳源有利于合理控制制備工藝成本并生產所需酶活性。
[0086]
氮源平行對照例
[0087]
該氮源平行對照例具有多組，且與實施例1和對比例2之間的區別僅限于氮源選擇不同，其添加量均為5g/l,如下表所示：
[0088] 硫酸銨蛋白胨酵母粉牛肉膏酶產量(u/ml)462146334624642酶活性(u/mg)3951519155586550
[0089]
得出結論：添加氮源可以影響過氧化氫酶的產量和活性，選擇合適的氮源有利于合理控制制備工藝成本并生產所需酶活性。
[0090]
金屬離子平行對照例
[0091]
該金屬離子平行對照例具有多組，且與實施例1和對比例3之間的區別僅限于金屬離子選擇不同，其添加量均為0.001mol/l,如下表所示：
[0092] znclcacl2mgcl2kh2po4nacl酶產量(u/ml)25543862351255694566酶活性(u/mg)42515806548760736118
[0093]
得出結論：添加金屬離子可以影響過氧化氫酶的產量和活性，選擇合適的氮源有利于合理控制制備工藝成本并生產所需酶活性。
[0094]
需要解釋的是，酶活性可以理解為單位數量的過氧化氫酶有效存活率或可以發生反應作用的酶數量，單位數量酶活性越高，其有效性越高。
[0095]
以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的僅為本發明
的優選例，并不用來限制本發明，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
