一種中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默載體、沉默體系及其構建方法和應用

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默載體、沉默體系及其構建方法和應用。

中國石蒜(Lycoris chinensis Traub)是石蒜屬重要的觀賞植物，具有花艷麗、花型優美，花莖挺拔高大等觀賞特性，而且對環境要求不高，適應性強，是園林綠化的很好選擇。分子育種是今后花卉育種研究的趨勢及常用手段，可以為提高觀賞性狀、改良花期、培育新種質創造優良的條件，但是目前石蒜屬植物遺傳轉化體系尚未成熟，難以對基因功能展開研究。

病毒介導的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是一種基于轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)的技術，利用植物采用的天然防御機制來防止入侵病毒。被病毒感染的植物會誘導雙鏈RA介導的PTGS，從而降解病毒RA。攜帶宿主靶基因部分序列的重組病毒被用來感染并在整個植物中傳播。病毒基因轉錄物與植物靶基因一起被內源性PTGS識別和降解，導致靶基因表達減少。與其他轉基因技術相比，VIGS技術可以避免植物轉化，有周期較短、所需成本低以及操作簡單等優勢。目前已應用于多種植物進行基因功能驗證，但該體系目前在中國石蒜未建立和應用。

本發明的目的在于提供一種中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默載體、沉默體系及其構建方法和應用，驗證中國石蒜基因功能。

本發明提供了一種中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默載體，所述沉默載體包括中國石蒜LcCLA基因的特異性片段，所述特異性片段的核苷酸序列如SEQ ID O.1所示。

本發明提供了所述中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默載體的構建方法，包括以下步驟：

將所述特異性片段連接到pTRV2上，構建得到沉默載體pTRV2-LcCLA。

優選的，所述特異性片段通過PCR擴增得到；所述PCR擴增所用的引物對包括上游引物CLA1-XbaI-F和下游引物CLA1-KpnI-R；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID O.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID O.5所示。

本發明還提供了一種中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默體系，所述沉默體系包括：含有pTRV1的農桿菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的農桿菌菌液的混合液；所述含有pTRV1的農桿菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的農桿菌菌液的體積比為1:1。

本發明還提供了所述沉默載體或所述沉默體系在鑒定中國石蒜LcCLA基因功能中的應用。

本發明還提供了一種鑒定中國石蒜LcCLA基因功能的方法，包括如下步驟：

利用所述沉默體系侵染中國石蒜的葉片后繼續培養，觀察葉片表型變化。

優選的，所述侵染的方式包括：采用針頭注射的方式將所述沉默體系注入葉片尖端葉脈導管。

優選的，利用所述沉默體系侵染中國石蒜的葉片前，還包括對所述沉默體系進行暗培養，利用暗培養后的沉默體系侵染中國石蒜的葉片；所述暗培養的溫度為24～26℃，時間為3～5h。

優選的，所述侵染后，培養中國石蒜的方式包括17～19℃的黑培養2d后正常培養。

優選的，其特征在于，所述農桿菌包括農桿菌GV3101。

本發明提供了一種中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默載體，所述沉默載體包括中國石蒜LcCLA基因的特異性片段，所述特異性片段的核苷酸序列如SEQ ID O.1所示。本發明通過中國石蒜鱗莖轉錄組測序獲得如SEQ ID O.1所示的LcCLA基因的特異性片段，首次構建中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默載體，能夠有效降低中國石蒜中LcCLA基因的表達水平。

本發明將含有LcCLA基因特異性片段的pTRV2病毒沉默表達載體質粒轉化到農桿菌體內，將含有pTRV1的農桿菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的農桿菌菌液混合，得到沉默體系(即農桿菌菌液混合液)，采用針頭注射的方式利用沉默體系侵染中國石蒜葉片，誘導中國石蒜內源LcCLA發生沉默，有效降低了中國石蒜LcCLA基因的表達水平，獲得病毒誘導的基因沉默性狀，能夠驗證中國石蒜LcCLA基因功能，在中國石蒜的功能基因研究中具有應用價值。

為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為實施例1葉片尖端針頭注射法和對比例1葉片滲透法；

圖2為實施例1中沉默載體侵染中國石蒜葉片后出現的葉片白化表型性狀；

圖3為中國石蒜LcCLA基因沉默后的cDA片段檢測圖；

圖4為采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測中國石蒜LcCLA的表達情況。

本發明提供了一種中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默載體，所述沉默載體包括中國石蒜LcCLA基因的特異性片段，所述特異性片段的核苷酸序列如SEQ ID O.1所示，具體為：5’-TTGACGGGCAGGAGGGACAAAATGCCCACAATGAGACAAACAAACGGATTAGCTGGGTTTACCAAACGCTCCGAGAGCGAGCATGATTGCTTCGGTACTGGCCACAGCTCAACCAGCATCTCAGCAGCACTAGGAATGGCAGTTGGAAGAGACTTGAAGGGAGGAAAGAACAATGTGATTGCAGTGATAGGAGATGGAGCCATGACAGCAGGCCAAGCTTATGAAGCAATGAATAATGCAGGGTATTTGGATTCTGATATGATTGTAATATTAAATGATAATAAGCAGGTTTCTCTGCCGACTGCAAATCTTGATGGGCCTATACCACCTGTTGGAGCTTTAAGCAGTGCTCTTAGTAAATTGCAGTCTAGCAGGCCTCTTAGAGAACTCAGGGAGGTGGCAAAGGGAGTAACAAAACAGCTTGGTGGGGGGATGCACGAATTAGCAGCAAAAGTTGATGAATATGCTCGAGGAATGATCAGTGGATCGGGTTCCACCTTGTTCGAGGAGCTTGGCCTTTACTACATAGGTCCAGTTGATGGCCACAACATTGACGACCTTGTCACAATTCTCAAAGAAGTGAAGAGCACAAAAACAACTGGTCCAGTTCTAATCCATGTCATAACAGAGAAAGGAAGAGGATATCCCTATGCAGAAAGAGCTGCTGATAAGTACCATGGTGTGGTGAAGTTTGACCCAGCAACGGGAAAACAGTTCAAAACCAGTTCTCAGACTCAGTCCTATACCAATTATTTTGCTGAGGCTTTGATAGCCGAAGCTGAAGTAGACAAGGACATTGTTGCAATTCATGCTGCAATGGGGGGAGGAACTGGCCTAAACTGCTTCCTCCGC-3’。

本發明通過對中國石蒜鱗莖轉錄組進行測序，獲得了LcCLA基因特異性片段(即CDS序列)，其具體核苷酸序列如SEQ ID O.1所示。以LcCLA基因特異性片段為目的片段構建LcCLA基因VIGS沉默載體，能夠驗證中國石蒜LcCLA基因的功能。

本發明還提供了所述中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默體系的構建方法，包括以下步驟：

將所述特異性片段連接到pTRV2上，構建得到沉默載體pTRV2-LcCLA。

在本發明中，所述特異性片段優選通過PCR擴增得到，且所述PCR擴增所用的引物對優選包括上游引物CLA1-XbaI-F和下游引物CLA1-KpnI-R。本發明所述上游引物CLA1-XbaI-F的核苷酸序列優選如SEQ ID O.4所示(5’-CTAGTCTAGATTGACGGGCAGGAGGGAC-3’)，下游引物的核苷酸序列優選如SEQ ID O.5所示(5’-CGGGGTACCGCGGAGGAAGCAGTTTAGGC-3’)。本發明對所述PCR擴增時使用的模板來源不作具體限定，可采用合成的方式獲得所述特異性片段，也可以中國石蒜的RA經反轉錄后得到的cDA為模板。本發明實施例中優選以cDA為模板，但是不能僅將其認定為本發明的全部保護范圍。

本發明對所述連接的方式沒有嚴格要求，采用常規的基因重組技術，例如在所述引物對的上游引物CLA1-XbaI-F的5’末端添加XbaI酶切位點，在所述引物對的下游引物CLA1-KpnI-R的5’末端添加KpnI酶切位點，通過酶切酶連的方式將PCR擴增得到的特異性片段插入到pTRV2即可。本發明對載體pTRV2的來源沒有嚴格要求，常規購買即可。本發明具體實施過程中使用的載體pTRV2購買自https://www.addgene.org/148969/。

本發明還提供了一種中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默體系，包括：含有pTRV1的農桿菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的農桿菌菌液的混合液；所述含有pTRV1的農桿菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的農桿菌菌液的體積比為1:1。

本發明將含有pTRV1的農桿菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的農桿菌菌液混合，得到的侵染液即為所述沉默體系，本發明通過限定含有pTRV1的農桿菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的農桿菌菌液的體積比為1:1，能夠提高侵染效果。

在本發明中，對所述含有pTRV1的農桿菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的農桿菌菌液的制備方法不做嚴格要求，利用常規方式，如電轉法或熱激法等方式將pTRV1和pTRV2-LcCLA分別轉入農桿菌，培養獲得即可。本發明所述農桿菌優選為農桿菌GV3101。

本發明還提供了所述沉默載體或沉默體系在鑒定中國石蒜LcCLA基因功能中的應用。本發明所述沉默載體或沉默體系能夠有效降低中國石蒜中LcCLA基因的表達水平，獲得病毒誘導的基因沉默植株，驗證中國石蒜LcCLA基因功能。

本發明還提供了一種鑒定中國石蒜LcCLA基因功能的方法，包括如下步驟：

利用所述沉默體系侵染中國石蒜的葉片后繼續培養，觀察葉片表型變化。

本發明利用所述沉默體系侵染中國石蒜的葉片前，優選對所述沉默體系進行暗培養，利用暗培養后的沉默體系侵染中國石蒜的葉片。本發明所述暗培養的溫度為優選為25℃；所述暗培養的時間優選為3～5h，進一步優選為4h。本發明對所述暗培養的方式不作具體限定，采用常規培養方式即可，如在100rpm的搖床上進行培養。本發明對所述沉默體系進行暗培養能夠誘導農桿菌的侵染能力，提高所述沉默體系的侵染效率。

暗培養結束后，本發明利用暗培養后的沉默體系侵染中國石蒜的葉片。本發明所述侵染的方式優選為針頭注射，具體為采用針頭注射的方式將所述暗培養后的侵染液注入葉片尖端葉脈導管，用手指緊捏針頭部位，將菌液慢慢推入，直至浸潤整個葉片。本發明所述暗培養后的沉默體系的注射量優選為1～2mL；所述暗培養后的沉默體系的侵染時間優選為15～20s，進一步優選為16～18s。本發明針對石蒜屬植物特殊的葉片結構，采用針頭直接注射方法，直接沿平行葉脈將菌液完整浸潤整片葉子，有效避免了葉面滲透法難以穿透葉表面蠟質的難題，在較短的時間內，利用少量的沉默體系即可實現侵染，并用于后續中國石蒜LcCLA基因功能驗證。

侵染結束后，本發明對侵染后的中國石蒜的葉片進行培養。本發明所述培養優選包括首先于17～19℃，進一步優選18℃暗培養2d后正常培養。本發明所述正常培養具體為：光暗交替培養，具體的，光培養16h后暗培養8h；所述光培養的光照強度為4000lx，光培養的溫度為24～26℃；所述暗培養的溫度為21～23℃。本發明所述正常培養時，保持空氣相對濕度70％-80％。

正常培養8～13d(即侵染10～15d)后，本發明觀察葉片表型變化和/或取樣測定葉片中LcCLA基因的表達情況，實現中國石蒜LcCLA基因功能的鑒定，具體鑒定方法為：當葉片失綠，變白或淺黃時，表明中國石蒜LcCLA基因發揮功能。

為了進一步說明本發明，下面結合附圖和實施例對本發明提供的技術方案進行詳細地描述，但不能將它們理解為對本發明保護范圍的限定。

以下實施例中所采用的分子生物學實驗技術包括RA提取和反轉錄、PCR擴增等實驗，如無特殊說明，通常按照常規方法操作。

實施例1

(1)LcCLA基因特異性片段的克隆

根據中國石蒜轉錄組進行序列拼接、注釋及比對分析后發現LcCLA具有完整ORF(全長1980bp)。用RA提取試劑盒(購于北京華越洋生物科技有限公司，貨號0416-50gk)提取中國石蒜葉片總RA，用oligo(dT)18(購于Thermo Fisher，貨號SO131)反轉錄后，根據中國石蒜轉錄組設計全長引物CLA1-F(記為SEQ ID O.2)：5’-TTGACGGGCAGGAGGGAC-3’和CLA1-R(記為SEQ ID O.3)：5’-GCGGAGGAAGCAGTTTAGGC-3’，PCR擴增獲得LcCLA特異條帶，進行瓊脂糖凝膠電泳、切膠純化、克隆測序，從而獲得最終序列。

(2)載體構建

根據步驟(1)最終序列設計用于擴增LcCLA基因CDS結構域上的特異性片段的引物CLA1-XbaI-F和CLA1-KpnI-R，在上游引物的5’末端添加XbaI酶切位點，下游引物的5’末端添加KpnI酶切位點，PCR擴增LcCLA基因特異性片段。

用RA提取試劑盒(購于北京華越洋生物科技有限公司，貨號0416-50gk)提取中國石蒜葉片總RA，用oligo(dT)18(購于Thermo Fisher,貨號SO131)進行反轉錄，獲得cDA模板。

PCR反應體系(20μL)為：cDA模板1μL、上下游引物(10μM)各1μL、dTPs(10mM)0.4μL、5×Phusion HF緩沖液4μL、Phusion DA聚合酶0.2μL，補加雙蒸水至20μL。擴增條件為：98℃預變性30s；98℃變性5s，60℃退火20s，72℃延伸10s，35個循環；72℃終延伸7mim，得到LcCLA共852bp的特異性序列(SEQ ID O.1)，4℃保存。

PCR切膠純化后加A尾，連接T載體(購于TaKaRa，貨號D101A)后轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆搖菌并至通用生物公司測序。選取測序結果與已知序列一致的克隆，搖菌并提取質粒，命名為pMD19-LcCLA。然后用XbaI/KpnI雙酶切pMD19-LcCLA和pTRV2載體質粒，并分別回收酶切產物，連接、轉化和篩選陽性克隆；從而獲得VIGS重組載體pTRV2-LcCLA。

(3)侵染液制備及侵染方法

①侵染Buffer的配置：100mL滲透液含1mL MgCl2溶液(1mol/L)，1mL MES溶液(1mol/L)，200μL乙酰丁香酮溶液(1mol/L)，調節pH至5.6，用滅菌蒸餾水定容，需要現配現用。

②菌液準備：將獲得的重組載體pTRV2-LcCLA質粒、pTRV2空載體質粒和pTRV1(購買自https://www.addgene.org/148968/)質粒采用凍融法轉化農桿菌GV3101。將轉化農桿菌GV3101的pTRV1質粒、pTRV2質粒和pTRV2-LcCLA質粒分別在LB(Kan，50μg/mL；Rif，25μg/mL)瓊脂板劃板培養。28℃培養48h后挑取新鮮培養的含pTRV1質粒、pTRV2質粒和pTRV2-LcCLA質粒的農桿菌GV3101轉化子單菌落加入到3mLYEB液體培養基(Kan，50μg/mL；Rif，25μg/mL)中，在28℃、170rpm/min搖床中培養16h。取1mL培養的菌液加入到100mLYEB液體培養基(Kan，50μg/mL；Rif，25μg/mL)中，28℃，170rpm/min，培養20-24h。檢測菌液OD600為1.0左右時，取40mL，4000rpm離心10min收集菌體細胞，加入適當體積的侵染Buffer重懸至終濃度為2.0(OD600)。

③侵染液準備：將步驟②中帶有pTRV1載體的農桿菌GV3101菌液分別與攜帶pTRV2的菌液和攜帶pTRV2-LcCLA質粒的菌液的重懸液按體積比1∶1混勻，制成2種混合菌液。將混合的重懸液置于25℃搖床100rpm/min，暗培養4h，用于侵染中國石蒜葉片。

④農桿菌液侵染：如圖1中(a)所示，采用葉片針頭注射法侵染中國石蒜葉片，步驟為：先吸取步驟③中培養好的侵染液，用注射器針頭插入葉片尖端葉脈導管處，并用手指緊捏針頭部位，將菌液慢慢推入，直至浸潤整個葉片。(兩種不同菌液注射時均需要更換手套與注射器)。

注射后培養：侵染后置于18℃的黑暗條件下培養2d，之后在空氣相對濕度70％-80％的條件下，進行光暗交替培養，其中光培養的強度為4000lx，溫度為25℃；暗培養的溫度為22℃，光暗比為16h/8h。

對比例1

同實施例1，區別在于步驟(3)中④進行農桿菌液侵染時，采用如圖1中(b)所示的葉片滲透法進行浸染。

測試例1

農桿菌液侵染效率的比較

實施例1針頭注射法，浸潤一整片葉子只需要1-2mL菌液即可，耗時15-20s；對比例1葉片滲透法屬于傳統的滲透注射法，因石蒜屬植物葉片表層有蠟質，浸潤時菌液難以注射到整個葉片中，想達到浸潤整片葉子的效果，需要制造多個傷口，因此，浸潤過程中極易造成菌液流失，且傷口多也不利于植物正常的生長發育，影響實驗結果，葉片滲透法浸潤一整片葉子至少需要5mL菌液，且耗時1-2min。

本發明針頭注射法更容易浸潤整個葉片，效率更高，操作更簡便，且可以節省更多的菌液。

測試例2。

侵染后中國石蒜LcCLA沉默效率檢測

(1)實施例1侵染10-15d后，觀察注射后的中國石蒜葉片的表型變化，結果如圖2所示，其中，圖2從左到右(a-c)依次為實施例1中國石蒜侵染pTRV1+pTRV2-LcCLA后的葉片，實施例1中國石蒜侵染pTRV1+pTRV2后的葉片以及不侵染正常生長的中國石蒜葉片。根據圖2可以看出，侵染pTRV1+pTRV2-LcCLA后的中國石蒜葉片失綠，葉片變白，說明本發明針頭注射的方式能夠使中國石蒜LcCLA基因沉默，發揮功能。

(2)中國石蒜葉片表型為白時，取其葉片，用華越洋快速通用植物RA提取試劑盒分別提取未注射、注射pTRV1+pTRV2、pTRV1+pTRV2-LcCLA葉片的總RA，每組三個重復，然后以各樣品的1μg總RA為模板，利用Prime Script TM RT reagent Kit with gDAEraser(Perfect Real Time)試劑盒(Takara)去除基因組DA并反轉錄合成cDA第一鏈，于-20℃儲藏備用。

利用PCR檢測注射效率，具體的：所用引物為：LcCLA1-RAi-RT-F(記為SEQ IDO.6)：5’-GTTGCTCATTTCTTGGCACTCA-3’和LcCLA1-RAi-RT-R(記為SEQ ID O.7)：5’-CAGCACCAACGGTCTCCACT-3’，檢測結果見圖3，其中1-3為未注射葉片樣品，4-6為注射pTRV1+pTRV2葉片樣品，7-9為注射pTRV1+pTRV2-LcCLA葉片樣品。根據圖3可以看出1-3未注射葉片孔未見條帶，4-9注射葉片孔在大約250bp處條帶明顯，說明本發明針頭注射法實現了中國石蒜葉片的侵染，注射成功；

通過qRT-PCR檢測基因表達量，以EXP為內參基因，引物序列為EXP1-RT-F(記為SEQID O.8)：5’-TTGATGTTGACAAGGTAAGGTGC-3’和EXP1-RT-R(記為SEQ ID O.9)：5’-AGGCAGGAAATCTCCAAAGC-3’，檢測結果見圖4，其中CK為對照組，為空載體pTRV2侵染的葉片，LcCLA基因相對表達量為1.00；LcCLA為實施例1重組病毒載體pTRV2-LcCLA侵染的葉片，LcCLA基因相對表達量為0.37。與對照CK相比，受到攜帶pTRV2-LcCLA重組病毒載體農桿菌侵染的中國石蒜葉片中LcCLA基因表達量顯著降低，說明本發明沉默體系構建成功。

本發明提供的中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默體系能夠誘導中國石蒜內源LcCLA發生沉默，有效降低了中國石蒜LcCLA基因的表達水平，獲得病毒誘導的基因沉默性狀。

盡管上述實施例對本發明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可以根據本實施例在不經創造性前提下獲得其他實施例，這些實施例都屬于本發明保護范圍。

序列表

<110> 江蘇省中國科學院植物研究所

<120> 一種中國石蒜LcCLA基因VIGS沉默載體、沉默體系及其構建方法和應用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 852

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgacgggca ggagggacaa aatgcccaca atgagacaaa caaacggatt agctgggttt 60

accaaacgct ccgagagcga gcatgattgc ttcggtactg gccacagctc aaccagcatc 120

tcagcagcac taggaatggc agttggaaga gacttgaagg gaggaaagaa caatgtgatt 180

gcagtgatag gagatggagc catgacagca ggccaagctt atgaagcaat gaataatgca 240

gggtatttgg attctgatat gattgtaata ttaaatgata ataagcaggt ttctctgccg 300

actgcaaatc ttgatgggcc tataccacct gttggagctt taagcagtgc tcttagtaaa 360

ttgcagtcta gcaggcctct tagagaactc agggaggtgg caaagggagt aacaaaacag 420

cttggtgggg ggatgcacga attagcagca aaagttgatg aatatgctcg aggaatgatc 480

agtggatcgg gttccacctt gttcgaggag cttggccttt actacatagg tccagttgat 540

ggccacaaca ttgacgacct tgtcacaatt ctcaaagaag tgaagagcac aaaaacaact 600

ggtccagttc taatccatgt cataacagag aaaggaagag gatatcccta tgcagaaaga 660

gctgctgata agtaccatgg tgtggtgaag tttgacccag caacgggaaa acagttcaaa 720

accagttctc agactcagtc ctataccaat tattttgctg aggctttgat agccgaagct 780

gaagtagaca aggacattgt tgcaattcat gctgcaatgg ggggaggaac tggcctaaac 840

tgcttcctcc gc 852

<210> 2

<211> 18

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgacgggca ggagggac 18

<210> 3

<211> 20

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggaggaag cagtttaggc 20

<210> 4

<211> 28

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctagtctaga ttgacgggca ggagggac 28

<210> 5

<211> 29

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggggtaccg cggaggaagc agtttaggc 29

<210> 6

<211> 22

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttgctcatt tcttggcact ca 22

<210> 7

<211> 20

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagcaccaac ggtctccact 20

<210> 8

<211> 23

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgatgttga caaggtaagg tgc 23

<210> 9

<211> 20

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggcaggaaa tctccaaagc 20