具有黃嘌呤氧化酶抑制活性的小分子肽及其應(yīng)用的制作方法
1.本發(fā)明涉及具有黃嘌呤氧化酶抑制活性的小分子肽及其應(yīng)用，屬于生物活性肽技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2.高尿酸血癥是由嘌呤代謝紊亂引起的一種常見代謝疾病，以血清尿酸水平升高為特征。過高的尿酸水平可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)，甚至導(dǎo)致心血管疾病、高血壓和ⅱ型糖尿病等。尿酸的產(chǎn)生和代謝是一個復(fù)雜的過程，參與嘌呤代謝的酶可以調(diào)節(jié)體內(nèi)尿酸的產(chǎn)生，尿酸轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)尿酸的排泄和再吸收。黃嘌呤氧化酶（xo）是嘌呤分解代謝的關(guān)鍵酶，它催化次黃嘌呤生成黃嘌呤，然后生成尿酸，同時過高的xo水平也會導(dǎo)致尿酸在體內(nèi)沉積，xo抑制劑可阻斷尿酸的生物合成。因此xo是高尿酸血癥的重要靶點。
3.近年來，各種合成的xo抑制劑如別嘌呤醇、非布索坦等被開發(fā)出來用于臨床高尿酸血癥。雖然合成的xo抑制劑作為抗高尿酸血癥藥物非常有效，但它們不可避免地會引起各種不良副作用，如過敏反應(yīng)和血壓升高，甚至心血管疾病和慢性腎臟疾病等。因此，迫切需要探索或開發(fā)具有較少不良副作用的xo抑制劑。
4.近幾十年來，多肽由于其易吸收、無毒、高特異性和多種生物活性等特點引起了廣泛的關(guān)注。越來越多的生物活性肽，如ace抑制肽和抗菌肽等從水產(chǎn)品中獲得，然而從水產(chǎn)品中獲取xo抑制肽的研究卻較少。此外，傳統(tǒng)的xo抑制肽純化方法主要包括凝膠過濾、離子交換、反相高效液相譜等，耗時長且純化過程繁瑣，因此迫切需要一種更加簡便可行的篩選xo抑制肽的研究方法。隨著科學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步，結(jié)合高性能計算機(jī)輔助設(shè)計篩選活性肽的研究逐漸發(fā)展，比如利用分子對接技術(shù)不僅能減少篩選強(qiáng)度、降低篩選周期，還能提高篩選成功的概率。但是利用計算機(jī)模擬蛋白質(zhì)酶解卻受限于蛋白序列的長度，不適用于序列較大的蛋白質(zhì)酶解，這大大降低了篩選xo抑制肽的效率。因此，酶解與分子對接相結(jié)合可能是一種替代傳統(tǒng)酶解篩選xo抑制肽更可行、更有效的方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
5.針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了6種具有黃嘌呤氧化酶抑制活性的小分子肽，及其應(yīng)用。本發(fā)明主要是利用分子對接技術(shù)對蝦酶解產(chǎn)物中xo抑制肽進(jìn)行篩選，并通過分子對接闡明其高xo抑制活性的作用位點，確定其半抑制濃度。
6.本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：具有黃嘌呤氧化酶抑制活性的小分子肽，為以下6種，氨基酸序列分別為：aeaqmwr，如seq id no.1所示；efgmggw，如seq id no.2所示；agginlar，如seq id no.3所示；mafgdkf，如seq id no.4所示；rwpgdmdr，如seq id no.5所示；
fnhhmf，如seq id no.6所示。
7.上述6種小分子肽，在作為或制備黃嘌呤氧化酶抑制劑中的應(yīng)用；在作為或制備具有抑制尿酸水平功效的藥物中的應(yīng)用。
8.本發(fā)明通過實驗研究，從南美白對蝦的酶解液（胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶）中篩選得到了6種具有黃嘌呤氧化酶抑制活性的小分子肽，這些小分子肽具有作為黃嘌呤氧化酶抑制劑、抑制尿酸水平的功能性產(chǎn)品的潛力，可用于制備具有抑制尿酸水平功效的藥物。其中aeaqmwr、efgmggw及agginlar表現(xiàn)出更高的xo抑制活性，其預(yù)防高尿酸血癥的潛在價值可能更大。本發(fā)明是對傳統(tǒng)復(fù)雜的xo抑制肽篩選方法的革新，采用了傳統(tǒng)酶解鑒定+分子對接相結(jié)合的篩選方法，提高了xo抑制肽的篩選工作效率。
9.本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義。
附圖說明
10.圖1：南美白對蝦酶解液中xo抑制肽的分離純化，其中，圖1：酶解液及超濾分離酶解液得到的不同分子量組分的xo抑制活性示意圖。
11.圖2：采用sephadex g-15凝膠層析柱純化組分b（得到5個洗脫峰）示意圖。
12.圖3：葡聚糖凝膠柱純化后得到的各組分（組分b1、b2、b3、b4、b5）的xo抑制活性示意圖。
13.圖4：b-3組分的lc
??
ms/ms圖譜。
14.圖5：3種多肽的分子對接結(jié)果示意圖，其中，a-c：3種多肽aeaqmwr、efgmggw及agginlar分別與xo的分子對接結(jié)果，綠代表hydrogen bond；淺藍(lán)代表carbon hydrogen bond；橙代表attractive charge、pi-cation和salt-bridge；紅代表unfavorable donor-donor；粉代表alkyl and pi-alkyl；玫瑰紅代表pi-pi stacked。
具體實施方式
15.下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。
16.下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法、檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實驗方法、檢測方法。
17.實施例1 南美白對蝦的模擬胃腸道消化將南美白對蝦的蝦肉切碎后按1:9（w/v，g/ml）的比例與水混合，調(diào)整其ph至3.0。加入1.5%（w/w）的胃蛋白酶，37℃震蕩反應(yīng)4 h；然后調(diào)節(jié)酶解液ph至6.5，加入胰蛋白酶和α-糜蛋白酶，添加量均為1%（w/w），37℃繼續(xù)反應(yīng)1.5 h；煮沸滅酶10 min，得到酶解液，凍干保存。
18.實施例2 采用高效液相譜法驗證活性肽的體外xo抑制活性取樣品或100 mmol/l pbs緩沖液（ph 7.4），加入終濃度為0.7 mmol/l的黃嘌呤和0.15 u/ml的xo，37℃孵育15 min，加入1 mol/l鹽酸終止反應(yīng)。
19.譜柱為 agilent xdb c 18（250 mm
×
4.6 mm，5μm），流動相為85%的10 mmol/l
水溶液和15%甲醇，流速為1.0 ml/min。
20.最終混合物中尿酸的含量由290 nm處的吸光度測定。酶促反應(yīng)中xo抑制活性計算為：[(空白尿酸含量
?
樣品尿酸含量)/空白尿酸含量]
×
100%。
[0021]
實施例3 南美白對蝦酶解液的超濾分離及活性測定通過兩種分子量分別為10 kda和5 kda的超濾膜分離酶解液，收集不同分子量的組分測定其xo抑制活性，結(jié)果如圖1所示。酶解液（組分a）被超濾為三個組分（組分b、c、d），其中，組分b（《5 kda）具有較高的xo抑制活性（50.46
±
0.68%，ic
50
=19.82
±
0.27 mg/ml），高于組分c（5～10 kda）和組分d（10 kda）。
[0022]
實施例4 葡聚糖凝膠過濾層析及其組分活性分析葡聚糖凝膠g-15加入適量超純水煮沸2 h，除去浮沫及雜質(zhì)；再加入超純水?dāng)嚢琛㈧o置。除去上層雜質(zhì)，重復(fù)以上操作直至上層無雜質(zhì)。吸掉凝膠上層多余的水，將填料以玻璃棒引流至16 mm
×
80 cm層析柱，避免分層和氣泡出現(xiàn)，柱子填好后用純水沖洗，直至層析柱高度不再發(fā)生變化。
[0023]
以實施例3中測定得到的組分b作為樣品進(jìn)行上樣。上樣濃度及體積為：50 mg/ml，5 ml；收集出峰的組分（流動相為超純水，洗脫速度為2 ml/min），凍干測定不同組分的活性。
[0024]
酶解液經(jīng)凝膠譜柱的分離結(jié)果如圖2所示，依次收集洗脫峰b1～b5，凍干后復(fù)配成多肽溶液，測定各組分的xo抑制率，結(jié)果如圖3所示。洗脫峰b-3所對應(yīng)的洗脫液的抑制率最高，因此選擇洗脫峰b-3所對應(yīng)的洗脫液進(jìn)行下一步的實驗。
[0025]
實施例5 b-3組分肽段組成的lc-ms/ms質(zhì)譜鑒定（1）多肽提取b-3組分肽段脫鹽后真空干燥，以0.1％三氟乙酸溶液復(fù)溶，測定肽段濃度，以備lc-ms分析。
[0026]
（2）lc-ms/ms分析采用easy-nlc 1200系統(tǒng)（thermo fisher scientific）和 q-exactive hf-x質(zhì)譜（thermo scientific）進(jìn)行多肽檢測。多肽被裝入內(nèi)部填充的c 18毛細(xì)管捕集柱（100μm
×
20 mm， 5μm）中，并用 c 18分離柱（75μm
×
150 mm，3μm）分離。a流動相為0.1%甲酸（v/v）水溶液，b流動相為含0.1%甲酸（v/v）和 80%乙腈（v/v）的水溶液。梯度為：2%～5% b流動相0～2 min，5%～28% b流動相2～44 min，28%～40% b流動相44～51 min，40%～100% b流動相51～53 min，b流動相保持100% 53～60 min。掃描范圍設(shè)置為300～1800 m/z，初級ms分辨率為60000@m/z 200，agc目標(biāo)為3e6，一級最大it為50 ms。二次ms分辨率為15000@ m/z 200，agc靶為1e5，二次最大it為50 ms，ms2激活類型為hcd，隔離窗口為1.6 m/z，歸一化碰撞能量為28。利用質(zhì)譜檢測的原始文件，用maxquant1.6.1.0 檢索uniprot protein database，最終得到150個蛋白組和585個肽段。樣品質(zhì)譜basepeak圖如圖4所示。
[0027]
實施例6 肽段篩選、合成及驗證（1）配體的處理采用chem3d pro 14 .0軟件繪制多肽的分子結(jié)構(gòu)式，保存為mo12文件。
[0028]
（2）對受體處理從pdb數(shù)據(jù)庫中下載xo的晶體結(jié)構(gòu)1n5x，采用discovery studio（ds）2019軟件的
cdocker將1n5x中的b鏈刪除，并抽離配體非布索坦（tei）保存?zhèn)溆谩?br>[0029]
（3）分子對接使用discoverystudio（ds）2019軟件的cdocker模塊進(jìn)行分子對接。對接坐標(biāo)為x=96.6635,y=54.963,z=39.4334，對接半徑為15
?
。其他參數(shù)保持默認(rèn)值。對于每個配體，使用ds2019軟件生成10個最佳位姿，通過-cdockerenergy、-cdockerinteractionenergy的數(shù)值確定其結(jié)合程度，篩選出能量值最高的15種多肽，合成驗證其xo抑制活性，結(jié)果如表1所示。
[0030]
表1篩選的多肽信息
注：
①
由于分子對接結(jié)果具有隨機(jī)性，表中顯示的得分為10個最佳位姿的平均值；
②
多肽的毒性通過http://crdd.osdd.net/raghava//toxinpred/計算；
③“?”
表示未檢出活性。
[0031]
（4）多肽合成及活性驗證表1中具有xo抑制活性的6個肽段，均由生工生物工程（上海）股份有限公司采用fmoc固相合成方法合成。多肽活性驗證參照實施例2中的方法。
[0032]
如表1所示，6個肽段均具有xo抑制活性，其中，aeaqmwr，efgmggw及agginlar表現(xiàn)出更高的xo抑制活性，所以決定對這3種多肽進(jìn)一步進(jìn)行活性位點分析。
[0033]
分子對接結(jié)果表明（圖5），傳統(tǒng)氫鍵作用、相互吸引電荷作用和鹽橋作用在xo抑制肽與xo的關(guān)鍵殘基glu802、glu1261和arg880的相互作用中起重要作用。此外，多肽aeaqmwr的活性高于其他肽，這可能和aeaqmwr與xo中的關(guān)鍵金屬原子mos3004連接有關(guān)。
[0034]
給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供上述實施例，以完全公開和描述如何實施和使用所主張的實施方案，而不是用于限制本文公開的范圍。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的修飾將在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
