一種單細胞全序列標記的方法及其應用與流程
1.本發明屬于基因測序領域，具體涉及一種單細胞全序列標記的方法及其應用。
背景技術：
2.眾所周知復雜的生命機體由許多性質特異的細胞組成，在特定的狀態下每個細胞表達的核酸和蛋白的種類與數量都有所不同，所以在單細胞水平上檢測核酸和蛋白指標對生物醫學研究有重要意義。單細胞測序從檢測指標來看主要有單細胞基因組測序、單細胞rna測序、單細胞表觀基因組測序及空間單細胞測序；從檢測通量來看主要分為低通量單細胞測序（一次檢測1-500細胞）和高通量單細胞測序（一次檢測1000-10000細胞）。
3.目前商業化的高通量單細胞rna測序以分析單細胞中rna的表達量為主，并沒有實現對rna全長序列的檢測，而且，相對于低通量單細胞rna測序技術smart-seq或quartz-seq，目前商業化高通量的單細胞rna測序單個細胞檢出的基因數偏低，存在低表達rna漏檢問題。
技術實現要素：
4.本發明的目的在于提供一種單細胞全序列標記的方法及其應用，旨在后續的檢測步驟中，能夠獲取高通量單細胞的全序列信息以及提高基因檢測數。
5.為達到上述目的，本發明提供一種單細胞全序列標記的方法，包括以下步驟：步驟s1:提供待檢測rna，所述待檢測rna來自多個細胞；步驟s2:采用步驟（a）或步驟（b）中的任一方式獲取雙鏈產物：步驟（a）:將逆轉錄反應體系加入所述待檢測rna中，進行逆轉錄反應后，得到的mrna/cdna雜合鏈即為所述雙鏈產物；步驟（b）:將逆轉錄反應體系加入所述待檢測rna中，進行逆轉錄反應后，得到cdna第一鏈，以所述cdna第一鏈為模板進行二鏈合成，得到所述雙鏈產物；步驟s3:將所述雙鏈產物用轉座酶進行轉座反應，得到多個細胞的多個片段化產物；步驟s4:將多個所述片段化產物與多個細胞標簽一一對應連接，其中，同一細胞的多個片段化產物與相同的所述細胞標簽連接，不同細胞的多個片段化產物與不同的所述細胞標簽連接，得到標記的單細胞全序列。
6.可選地，所述步驟（b）包括以下步驟：步驟s201:將逆轉錄反應體系加入所述待檢測rna中，進行逆轉錄反應后，得到cdna第一鏈；步驟s202:以所述cdna第一鏈為模板，采用含有隨機序列的引物或經過消化后的rna鏈起始二鏈合成，得到所述雙鏈產物。
7.可選地，所述步驟s1包括以下步驟：步驟s101:提供富集體；
步驟s102:提供含目的rna的細胞rna，將所述細胞rna中的目的rna富集于所述富集體上，得到所述待檢測rna。
8.可選地，所述富集體偶聯有逆轉錄引物和模板轉換序列同源序列，且所述步驟（b）包括以下步驟：步驟s201:將逆轉錄反應體系加入所述待檢測rna中，進行逆轉錄反應后，得到cdna第一鏈，所述逆轉錄反應體系含有模板轉換序列和逆轉錄酶，所述模板轉換序列含有與所述模板轉換序列同源序列相同的序列；步驟s202:以所述cdna第一鏈為模板，以所述模板轉換序列同源序列為引物進行原位擴增，得到所述雙鏈產物。
9.可選地，所述步驟s1包括：步驟s101:提供多個待檢測細胞以及多個檢測區域，將多個所述待檢測細胞一一對應地沉積在多個所述檢測區域；步驟s102:將各所述檢測區域中，將各待檢測細胞進行裂解后富集目的rna，得到所述待檢測rna。
10.可選地，所述步驟s3中，所述轉座酶含有轉座子序列；所述步驟s4包括：步驟s401:提供多個標記微珠，各所述標記微珠包括一個微珠本體和多條含有相同所述細胞標簽的功能序列，且不同所述標記微珠的所述功能序列的所述細胞標簽不同，各所述功能序列還包括與所述轉座子序列連接的接頭1’，所述接頭1’連接在所述細胞標簽的一端，所述微珠本體連接在所述細胞標簽的另一端，且與所述細胞標簽可條件性斷裂；步驟s402:將多個細胞的多個所述片段化產物與多個所述標記微珠混合，使所述接頭1’與所述轉座子序列連接，并施加條件，使所述微珠本體與所述細胞標簽斷裂，得到標記的單細胞全序列，其中，同一細胞的多個所述片段化產物對應地與同一所述標記微珠混合，不同細胞的多個所述片段化產物與不同的所述標記微珠混合。
11.此外，本發明還提供一種高通量單細胞全序列轉錄組文庫構建的方法，包括以下步驟：采用上述方法獲取標記的單細胞全序列；將所述標記的單細胞全序列進行index pcr，對所述標記的單細胞全序列進行富集并引入測序接頭序列及文庫標簽，得到所述高通量單細胞全序列轉錄組文庫。
12.此外，本發明還提供一種高通量單細胞全序列的測序方法，包括以下步驟：采用上述方法構建高通量單細胞全序列轉錄組文庫；采用測序平臺對所述高通量單細胞全序列轉錄組文庫進行測序。
13.此外，本發明還提供一種實現上述高通量單細胞全序列轉錄組文庫構建的方法的試劑盒，包括：逆轉錄體系，所述逆轉錄體系用于對rna進行逆轉錄，得到dna雙鏈或mrna/cdna雜合鏈；轉座酶體系，所述轉座酶體系用于對所述dna雙鏈或所述mrna/cdna雜合鏈進行切割，獲得片段化產物；標記體系，所述標記體系可使同一細胞的多個所述片段化產物與相同的細胞標簽連接，不同細胞的多個所述片段化產物與不同的細胞標簽連接，得到標記產物；
index pcr體系，所述index pcr體系用于對所述標記產物進行富集并引入測序接頭序列及文庫標簽，形成所述高通量單細胞全序列轉錄組文庫。
14.本發明中，通過轉座酶將雙鏈產物片段化并引入轉座子序列，片段化產物連接特異性的細胞標簽，以此實現單個細胞基因序列的細胞標簽標記，便于后續實現單細胞全序列的檢測，也提高了單細胞基因獲取總量。
附圖說明
15.為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅為本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。
16.圖1為本發明一實施例單細胞全序列標記的方法流程圖；圖2為本發明反應原理圖；圖3為標記微珠圖；圖4為建庫產物示意圖；圖5為實施例1和對比例1的獲取的核酸分布；圖6為實施例2獲取的核酸分布；圖7為實施例1~2以及對比例1測得的基因數目。
17.本發明目的的實現、功能特點及優點將結合實施例，參照附圖做進一步說明。
具體實施方式
18.為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。
19.需要說明的是，實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。另外，全文中出現的“和/或”的含義，包括三個并列的方案，以“a和/或b”為例，包括a方案、或b方案、或a和b同時滿足的方案。此外，各個實施例之間的技術方案可以相互結合，但是必須是以本領域普通技術人員能夠實現為基礎，當技術方案的結合出現相互矛盾或無法實現時應當認為這種技術方案的結合不存在，也不在本發明要求的保護范圍之內。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
20.鑒于現有的高通量單細胞測序，無法獲取全序列信息，且獲取單細胞基因數總量低的技術缺陷，參見圖1和圖2，本發明提供一種單細胞全序列標記的方法，包括以下步驟：步驟s1:提供待檢測rna，所述待檢測rna來自多個細胞；步驟s2:采用步驟（a）或步驟（b）中的任一方式獲取雙鏈產物：步驟（a）:將逆轉錄反應體系加入所述待檢測rna中，進行逆轉錄反應后，得到的mrna/cdna雜合鏈即為所述雙鏈產物；步驟（b）:將逆轉錄反應體系加入所述待檢測rna中，進行逆轉錄反應后，得到cdna
第一鏈，以所述cdna第一鏈為模板進行二鏈合成，得到所述雙鏈產物；步驟s3:將所述雙鏈產物用轉座酶進行轉座反應，得到多個細胞的多個片段化產物；步驟s4:將多個所述片段化產物與多個細胞標簽一一對應連接，其中，同一細胞的多個片段化產物與相同的所述細胞標簽連接，不同細胞的多個片段化產物與不同的所述細胞標簽連接，得到標記的單細胞全序列。
21.本發明中，在轉座酶的作用下，將雙鏈產物進行片段化并引入轉座子序列，片段化的雙鏈產物連接上特異性的細胞標簽，以此實現單個細胞基因序列的細胞標簽標記，便于后續實現單細胞全序列的檢測，同時也提高了單細胞基因獲取總量。
22.在一些實施例中，所述步驟s1包括：步驟s101:提供富集體；步驟s102:提供含目的rna的細胞rna，將所述細胞rna中的目的rna富集于所述富集體上，得到所述待檢測rna。通過富集，可以對樣品中的rna進行提取，去除非目的基因。
23.在一些實施例中，所述富集體含有富集本體以及連接于所述富集本體上的捕獲探針，所述捕獲探針可特異性結合rna，以此捕獲待檢測rna。具體地，所述捕獲探針為oligo-(dt)n，n的數量在10~100之間，該序列對應的真核細胞中的poly a結構。
24.在一些實施例中，所述捕獲探針末端有封閉基團修飾，使其僅為富集作用，不進行逆轉錄反應，在逆轉錄反應體系中加入感興趣基因的特異性引物進行延伸。以此可選擇性地獲取感興趣基因的全序列文庫，而不再需要通過捕獲方法得到。
25.需要說明的是，所述富集本體的材質可以為柔性材質也可以為硬性材質。
26.在一些實施例中，所述步驟s102包括：步驟s1021:提供多個待檢測細胞；步驟s1022:將多個待檢測細胞進行裂解，釋放出rna，然后采用所述富集體富集目的rna，得到所述待檢測rna。通過上述步驟可以使待檢測細胞中rna進行充分釋放。
27.在一些實施例中，所述步驟s1包括：步驟s101:提供多個待檢測細胞以及多個檢測區域，將多個所述待檢測細胞一一對應地沉積在多個所述檢測區域；步驟s102:將各所述檢測區域中，將各待檢測細胞進行裂解后富集目的rna，得到所述待檢測rna。
28.具體地，通過提供一個微流控芯片，所述微流控芯片設有多個沉積孔，每個沉積孔為一個沉積區域。該微孔芯片可以含有100個到10000000個沉積區域，同一張芯片的每個微孔的直徑是相同的，其直徑可以在10-200um之間。投入微孔芯片的細胞數不應超過沉積區域數的1/5，可以通過重力使細胞自然沉降到沉積區域。
29.步驟s20中，采用步驟（a）得到所述雙鏈產物時，可在不降低基因數的情況下，還進一步的縮短建庫流程；需要說明的是，由于rna易降解，逆轉錄后需立即進行轉座酶處理；采用步驟（b）得到的所述雙鏈產物時，采用該方得到雙鏈產物為dna，相較rna更穩定，易于保存，實驗靈活度更高。
30.在一些實施例中，所述富集體偶聯有逆轉錄引物和模板轉換序列同源序列；參見圖2，所述步驟s2包括以下步驟：
步驟s201:將逆轉錄反應體系加入所述待檢測rna中，進行逆轉錄反應后，得到cdna第一鏈，所述逆轉錄體系含有模板轉換序列和逆轉錄酶，所述模板轉換序列包含與所述模板轉換序列同源序列相同的序列；所述逆轉錄酶具有模板轉換功能；步驟s202:以所述cdna第一鏈為模板，所述模板轉換同源序列為引物進行原位擴增，得到雙鏈產物。
31.本發明術語所述的“模板轉換功能”是指逆轉錄酶的末端轉移酶活性會在新合成的cdna的3’末端添加一些額外的堿基。
32.本發明術語所述的“模板轉換序列”是指與cdna的3’末端添加的額外的堿基部分互補配對，并作為模板進行延伸的序列，以此實現另一端通用引物的添加，便于后續進行pcr反應。
33.參見圖2，采用該方法形成的雙鏈dna，其兩端均與富集體連接，相較于傳統的雙鏈dna，省略了轉座反應后的純化步驟，簡化實驗流程。采用該方法得到的雙鏈dna，由于進行擴增反應，基因拷貝數增加，避免在index pcr后的純化過程中基因的丟失，可提高檢測基因數和檢測靈敏度。
34.參見圖2，在一些實施例中，所述步驟s2包括：步驟s201:將逆轉錄反應體系加入所述待檢測rna中，進行逆轉錄反應后，得到cdna第一鏈；步驟s202:以cdna為模板，采用含有隨機序列的引物或經rnaseh消化后的rna鏈起始cdna二鏈合成。
35.需要說明的是，采用含有隨機序列的引物，其生成的產物為多個cdna片段，多個cdna片段共同構成cdna，且多個cdna片段覆蓋多條cdna第一鏈的序列信息。其具體覆蓋方式可包括：多個cdna片段中的部分可分為若干個集合，每個集合中多個cdna片段經過拼接后，其形成的單鏈信息與其中一條cdna第一鏈一致，多個集合拼接后形成的所有單鏈，其序列信息，包含了所有的cdna第一鏈信息；當然，多個cdna片段中的部分片段也可各自具有完整cdna第一鏈序列信息。具體地，不再一一闡述。
36.在一些實施例中，所述步驟s3中，所述轉座酶含有轉座子序列。轉座子序列可作為接頭，用于后續細胞標簽的連接。
37.具體地，在一些實施例中，所述轉座酶還含有轉座酶體，所述轉座酶含有兩個轉座子序列，其中一個轉座子序列為第一轉座子序列，含有read1 sequence primer的全部或部分序列和第一轉座酶識別序列，所述read1 sequence primer包含與細胞標簽連接的接頭1，所述轉座酶體與所述第一轉座酶識別序列的一端連接，所述read1 sequence primer與所述第一轉座酶識別序列的另一端連接。
38.當然，可以理解的是，另一個轉座子序列為第二轉座子序列，包含第二轉座酶識別序列和read2 sequence primer的全部或部分序列，所述第二轉座酶識別序列與第一轉座酶識別序列相同。
39.在一些實施例中，所述步驟s4包括以下步驟：步驟s401:提供多個標記微珠，參見圖3，各所述標記微珠包括一個微珠本體1和多
條含有相同所述細胞標簽201的功能序列2，且不同所述標記微珠的所述功能序列的所述細胞標簽201不同，各所述功能序列還包括與所述轉座子序列連接的接頭1’，所述接頭1’202連接在所述細胞標簽201的一端，所述微珠本體1與連接在所述細胞標簽201的另一端，且與所述細胞標簽可條件性斷裂；步驟s402:將多個細胞的多個所述片段化產物與多個標記微珠混合，使接頭1’與所述轉座子序列連接，并施加條件，使所述微珠本體與所述細胞標簽斷裂，得到標記的單細胞全序列，其中，同一細胞的多個所述片段化產物對應地與同一個所述標記微珠混合。
40.連接接頭1’與所述轉座子序列，具體地，接頭1與接頭1’連接，使其借助標記微珠引入細胞標簽，可以一次性連接多個細胞標簽，以此提高細胞標簽的連接效率，例如，每個微珠本體上連接10^
5-10^
10
個功能序列，就能實現10^
5-10^
10
個序列的標記。需要說明的是，所述微珠本體的材質可以為柔性材質也可以為硬性材質。
41.在一些實施例中，所述微珠本體與所述細胞標簽之間設有可裂解基團x 203，x可以在特定刺激條件下從微珠上脫落下來，比如光照刺激或者化學刺激。在上述過程中具有微珠本體在微孔中可以溶解消失也可以不溶解。
42.在一些實施例中，參見圖3，所述細胞標簽和所述微珠本體之間還設有引物結合序列204。通過設置引物結合序列，以此完成后續的文庫富集及測序接頭序列和文庫標簽的引入。
43.在一些實施例中，所述步驟s402中，接頭1與接頭1’進行在reverse primer介導下連接，所述reverse primer包括與接頭1互補的第一區域和與接頭1’互補的第二區域。
44.此外，本發明提供一種高通量單細胞全序列轉錄組文庫構建的方法，包括以下步驟：步驟a10:采用上述單細胞全序列標記的方法獲取標記的單細胞全序列；步驟a20:將所述標記的單細胞全序列進行index pcr，在所述index pcr的過程引入測序接頭序列及文庫標簽，得到所述高通量單細胞全序列轉錄組文庫。
45.在一些實施例中，采用擴增引物進行index pcr，所述擴增引物包括第一引物和第二引物，其中，所述第一引物包含與所述引物結合序列（204）相同的序列，進一步地，所述引物結合序列為illumina測序平臺可識別的p5序列；所述第二引物包含轉座子結合序列、文庫標簽及第二測序接頭序列，所述轉座子結合序列與所述第二轉座子序列相同，所述文庫標簽設于所述第二測序接頭序列與所述轉座子結合序列之間，且所述第二測序接頭序列為illumina測序平臺可識別的p7序列。
46.通過上述步驟，在單細胞全序列引入文庫標簽，用于分辨樣品。需要說明的是，測序標簽可以根據需要進行添加，具體不做一一限制。具體地，在一些實施例中，通過index pcr引入測序接頭序列及文庫標簽。因此構建的文庫產物如圖4所示。
47.此外，本發明還提供一種高通量單細胞全序列的測序方法，包括以下步驟：步驟b10:采用上述方法構建高通量單細胞全序列轉錄組文庫；步驟b20:采用測序平臺對所述高通量單細胞全序列轉錄組文庫進行測序。通過上述方法，完成對文庫的測序后，確定相應的序列信息，完成測序。
48.在一些實施例中，所述步驟b20中，所述測序平臺包括 illumina novaseq 6000。
49.此外，本發明還提供一種實現上述高通量單細胞全序列轉錄組文庫構建的方法的
試劑盒，包括：逆轉錄體系，所述逆轉錄體系用于對rna進行逆轉錄，得到dna雙鏈或mrna/cdna雜合鏈；轉座酶體系，所述轉座酶體系用于對所述dna雙鏈或所述mrna/cdna雜合鏈進行切割，獲得片段化產物；標記體系，所述標記體系可使同一細胞的多個所述片段化產物與相同的細胞標簽連接，不同細胞的多個所述片段化產物與不同的細胞標簽連接，得到標記產物；index pcr體系，所述index pcr體系用于對所述標記產物進行富集并引入測序接頭序列及文庫標簽，形成所述高通量單細胞全序列轉錄組文庫。
50.可以理解的是，所述逆轉錄體系包括逆轉錄酶、逆轉錄引物和逆轉錄反應液，以此實現逆轉錄反應。
51.在一些實施例，所述逆轉錄引物也可以用于捕獲待檢測rna；例如oligo-（dt）n，n的數量在10~100之間因此，所述逆轉錄引物也可附于捕獲本體上，制備成捕獲體。
52.當然，所述逆轉錄引物不具備捕獲rna的功能時，所述逆轉錄引物也可以接枝于所述捕獲本體，而對應的在所述捕獲本體上另外接枝捕獲序列。
53.在一些實施例中，所述捕獲體還包括模板轉換序列同源序列；對應的，所述逆轉錄酶具有模板轉換活性的逆轉錄酶，例如superscript ii逆轉錄酶，用于在逆轉錄反應中進行模板轉換。可以理解的是，在進行模板轉換的過程中，需要在所述逆轉錄體系中加入模板轉換序列，所述模板轉換序列包含與所述模板轉換序列同源相同的序列。以此，便于后續進行原位擴增，形成雙鏈dna產物。
54.在一些實施例中，所述轉座酶體系包括轉座酶，所述轉座酶含有第一轉座子序列和第二轉座子序列。
55.轉座子序列可作為接頭，用于后續通過細胞標簽的連接。
56.具體地，所述轉座酶還含有轉座酶體，所述轉座酶含有兩個轉座子序列，其中一個轉座子序列為第一轉座子序列，含有read1 sequence primer的全部或部分序列和第一轉座酶識別序列，所述read1 sequence primer包含與細胞標簽連接的接頭1，所述轉座酶體與所述第一轉座酶識別序列的一端連接，所述read1 sequence primer與所述第一轉座酶識別序列的另一端連接。
57.當然，可以理解的是，另一個轉座子序列為第二轉座子序列，包含第二轉座酶識別序列和read2 sequence primer的全部或部分序列，所述第二轉座酶識別序列與第一轉座酶識別序列相同。
58.在一些實施例中，所述標記體系包括多個標記微珠和連接反應液，各所述標記微珠包括一個微珠本體和多條含有相同所述細胞標簽的功能序列，且不同所述標記微珠的所述功能序列的所述細胞標簽不同，各所述功能序列還包括與所述第一轉座子序列連接的接頭1’，所述接頭1’連接在所述細胞標簽的一端，所述微珠本體與連接在所述細胞標簽的另一端，且與所述細胞標簽可條件性斷裂，所述連接反應液使所述接頭1’與所述轉座子序列連接。
59.在一些實施例中，所述index pcr系包括擴增引物和pcr反應液。
60.在一些實施例中，所述擴增引物包括第一引物和第二引物，其中，所述第一引物包
含所述引物結合序列（204）相同的序列，進一步地，所述引物結合序列為illumina測序平臺可識別的p5序列；所述第二引物包含轉座子結合序列、文庫標簽及第二測序接頭序列，所述轉座子結合序列與所述第二轉座子序列相同，所述文庫標簽設于所述第二測序接頭序列與所述轉座子結合序列之間，且所述第二測序接頭序列為illumina測序平臺可識別的p7序列。
61.所述擴增引物序列如下：第一引物n5：aatgatacggcgaccaccga第二引物n7：caagcagaagacggcatacgagatxxxxxxxxgtctcgtgggctcgg，其中caagcagaagacggcatacgagat為p7序列，xxxxxxxx為文庫標簽，gtctcgtgggctcgg為read2 sequencing primer部分序列；以下結合具體實施例和附圖對本發明的技術方案作進一步詳細說明，應當理解，以下實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
62.實施例11、使用磁珠在微孔芯片中捕獲細胞rna并逆轉錄1.1 抽取外周血并獲得新鮮的pbmc細胞，重懸于pbs中；1.2 按照尋因公司已經市售的seekone
??
mm 3’單細胞轉錄組文庫構建試劑盒中提供的微孔芯片說明書處理芯片，并加入3000個孵育好的pbmc細胞；1.3 加入經pbs洗滌的偶聯有 oligo (dt)
25 的 3um直徑磁珠400μl至微孔板中，磁吸入孔后清洗掉多余磁珠；1.4 加入裂解液裂解2min；1.5 按照seekone
??
mm 3’單細胞文庫構建試劑盒中的如下配方配置逆轉錄體系400μl并混勻：1.6 取配置好的逆轉錄反應體系加入微孔板中，封口后置于以下溫度條件反應；
1.7 完成后使用移液器注入450μl空氣以清空芯片腔室，然后加入450μl 1
×
pbs以沖洗芯片；此步驟重復兩次后將微孔芯片平放至4℃冰箱保存。注意不要顛倒芯片防止捕獲磁珠在微孔之間交換造成細胞間rna污染。
63.2、對微孔芯片中磁珠上的cdna進行二鏈合成2.1 按試劑盒（neb #e7770s）如下配方配置二鏈合成試劑并混勻：2.2 取出實施例1中已完成逆轉錄的微孔芯片，使用移液器注入450μl空氣以清空芯片腔室；然后注入400μl配置好的二鏈合成試劑，封口后置于16℃條件下反應1小時：2.3 完成后使用移液器注入450μl空氣以清空芯片腔室，然后加入450μl 1
×
pbs以沖洗芯片；此步驟重復兩次后將微孔芯片平放至4℃冰箱保存。注意不要顛倒芯片防止捕獲磁珠在微孔之間交換造成細胞間rna污染。
64.3、使用轉座酶對cdna打斷并連接細胞標簽3.1 按照以下方案配置轉座酶反應液400μl并混勻：3.2 取出實施例1或實施例2中已完成逆轉錄或二鏈合成的微孔芯片，使用移液器注入450μl空氣以清空芯片腔室；然后注入400μl配置好的轉座酶反應液，將芯片置于pcr儀上55℃反應15分鐘后冷卻至10℃；3.3 反應完成后使用pbs沖洗3次芯片腔室并加入450μl 直徑30um左右的cell barcoded beads，該beads可以是磁珠或水凝膠微珠；此處的cell barcoded beads攜帶的
具體核酸序列如下表所示，其中可裂解集團可以是可被光斷裂的pclinker，也可以是被還原劑斷裂的s-s鍵，本發明中這兩種核酸修飾均由上海生工引物合成商合成；3.4 按以下體系配置連接反應體系并加入到微孔板中，使用紫外光裂解1min后置于22℃反應15min以完成連接反應。
65.4、擴增建庫并測序分析4.1 將磁力板放置于實施例3中完成連接后的微孔芯片上方，使用移液器快速注入1000μlpbs吹出芯片腔室中懸浮的磁珠，使用10mm tris溶液洗滌兩次后加入如下擴增反應體系吹勻后進行擴增以添加文庫接頭和樣本標簽：
將pcr產物用dna clean beads進行分選得到文庫，文庫大小如圖5所示；實施例2本實施例提供的是提供一種pbmc的單細胞全序列轉錄組文庫的構建。與實施例1的差異在于步驟2及步驟4。
66.其中步驟2的差異在于本實施例中無需進行二鏈合成，步驟1后直接進行步驟3即可。
67.所述步驟4差異部分僅為擴增酶體系不同，擴增體系如下：對比例1根據北京尋因科技公司的seekone
??
mm 3’單細胞轉錄組試劑盒中記載的操作方法對pbmc細胞進行文庫構建。
68.測試實施例illumina novaseq 6000測序，測序策略如圖4所示。使用生物信息學方法分析測到的核酸序列在rna的位置和每個細胞測到的基因數。如圖5~7所示，其中，實施例1的獲取的核酸分布如圖5a所示，對比例1的獲取的核酸分布如圖5b所示，實施例2獲取的核酸分布如圖6所示，實施例1~2以及對比例1測得的基因數目如圖7所示，結果顯示，本發明方法比普通的3’單細胞文庫（seekone mm 3’轉錄組文庫）更均勻分布在rna全長上，而且每個細胞測得的基因數明顯3’單細胞文庫高。
69.以上僅為本發明的優選實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包括在本發明的專利保護范圍內。
