牡丹皮提取物在制備抗海洋弧菌藥物中的用途
1.本發明涉及中草藥用途領域，特別涉及一種牡丹皮提取物在制備抗海洋弧菌藥物中的用途。
背景技術：
2.近年來，我國水產養殖業迅速發展，漁業產量大幅增長，穩居世界前列。但隨著養殖規模與集約化程度的不斷提高，養殖水域污染逐漸加重，水產致病菌引起的病害頻發，嚴重阻礙了海水魚類的養殖和發展。海洋致病菌主要包括副溶血弧菌、鰻弧菌、創傷弧菌、弧菌等。這些致病菌不僅給海水養殖業造成巨大經濟損失，而且威脅海洋自然生物資源。
3.目前，對于海洋致病菌多采用化學藥物防治的方法，主要包括青霉素，諾氟沙星，新諾明等，但長期單一使用一種藥物會產生抗性，出現耐藥性菌株。中草藥具有成分豐富、不易產生耐藥性、綠環保及功效多樣等優點，在病毒性、細菌性等各類魚病防治中均擁有獨到的作用及良好的效果。
4.現有對中草藥進行篩選來抑制海洋致病菌的研究，但是關于本發明的中草藥在抑制海洋致病菌中的應用目前尚缺乏報道。因此，篩選中草藥，尋具有較好抑制海洋致病菌有效的中草藥具有重要的意義。
技術實現要素：
5.本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種牡丹皮提取物在制備抑制海洋致病菌藥物中的新用途。
6.本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是牡丹皮提取物的用途，所述的用途為牡丹皮提取物在制備抑制海洋致病菌的藥物中的用途；所述的海洋致病菌為創傷弧菌、弧菌。所述的牡丹皮提取物是以牡丹皮為原料，采用水提取或無水乙醇提取所得到的牡丹皮提取物。
7.本發明優選的技術方案是：所述的牡丹皮提取物的制備方法為：稱取牡丹皮中藥制成的粉末，加入溶劑水或無水乙醇，在室溫下超聲提取30～90min，再在30℃～80℃下回流提取30～120min，抽濾，同法提取2～4次，收集濾液，濃縮即得。
8.本發明優選的技術方案是：所述的牡丹皮提取物的提取方法如下：
9.(1)提取：稱取牡丹皮粉末，加入無水乙醇，在一定溫度下超聲提取30min，再在50℃下回流提取60min，抽濾，同法提取2次，收集濾液，濃縮使生藥的最終濃度為1g/ml；
10.(2)抑菌活性成分分離：對牡丹皮醇提物進行分離，牡丹皮醇提物旋蒸成浸膏后加入蒸餾水配成混濁液，分別用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取至溶液澄清無，每次萃取時間30min。萃取完畢后，將溶劑旋干得到干燥粉末，將不同萃取物干燥粉末，配置成10mg/ml的樣品溶液，用牛津杯法測定樣品溶液的抑菌活性；
11.(3)抑菌活性成分化學定性檢測：使用化學定性的方法對4個組分進行檢測，用鹽酸+鎂粉、溴甲酚綠溶液及三氯化鐵鐵溶液進行化學定性檢測；確定乙酸乙酯組為酚
酸類化合物；確定酚酸類化合物為抑制海洋致病菌。
12.與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
13.本發明將牡丹皮提取物用于制備抑制海洋致病菌的藥物，牡丹皮醇提物對創傷弧菌和弧菌均有較好的抑制作用，mic值分別為15.63mg/ml和31.25mg/ml。
具體實施方式
14.下面結合實施例對本發明提供的具體實施方式作詳細說明。
15.實施例1，篩選具有抑制海洋致病菌作用的中草藥，確定牡丹皮為抑制海洋致病菌活性最好的中草藥。
16.1、抑制海洋致病菌中草藥的篩選
17.初步選出沙棘、小薊、大葉桉葉、南酸棗、桂枝、制何首烏、茯苓、藿香、佩蘭、白蘞、老鸛草、牡丹皮、三白草、夜交藤、車前草、紫蘇水提物或醇提取物中的一種16種中草藥。稱取中藥粉末，加入溶劑(水、無水乙醇)，在室溫下超聲提取30min，再在50℃下回流提取60min，抽濾，同法提取2次，收集濾液，濃縮使生藥的最終濃度為1g/ml。
18.選取創傷弧菌(vibrio vulnificus)弧菌(vibrio cholerae)為目標菌株，采用牛津杯法，在無菌環境下，向平板中倒入約20ml已滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，凝固后，加入200μl的菌懸液，涂布棒涂布均勻，靜置10min。將牛津杯垂直均勻放置于培養基上，在杯中加入200μl的提取物樣品，每個樣品進行3次平行實驗，移至37℃恒溫培養箱培養18h后，用電子數顯卡尺測定抑菌圈直徑，結果取3次測量結果的平均值。抑菌圈直徑大于20mm為極敏，15～19mm為高敏，10～15mm為中敏，小于10mm為低敏(無活性)。
19.通過上述體外抑菌實驗篩選出對創傷弧菌、弧菌抑制作用較強的中草藥作為進一步實驗對象。16種中草藥提取物對兩種弧菌的抑菌效果見表1：
20.表1 16種中草藥提取物對兩種弧菌的抑菌效果
[0021][0022][0023]
注：“+++”表示極敏、“++”表示高敏、“+”表示中敏、
“?”
表示低敏(無活性)。
[0024]
實驗結果如表1所示，沙棘水提物及醇提物、大葉桉葉醇提物、南酸棗水提物、桂枝醇提物、藿香醇提物、佩蘭醇提物、老鸛草水提物及醇提物、牡丹皮水提物及醇提物、三白草醇提物、車前草水提物及醇提物對弧菌有抑制作用；沙棘水提物及醇提物、大葉桉葉水提物及醇提物、南酸棗醇提物、桂枝水提物及醇提物、藿香水提物及醇提物、佩蘭水提物醇提物、老鸛草水提物及醇提物、牡丹皮水提物及醇提物、三白草醇提物、夜交藤水提物及醇提物，車前草醇提物，紫蘇醇提物對創傷弧菌有抑制作用。其中，牡丹皮水提物及醇提物對弧菌的抑菌圈直徑均達到15mm以上，對創傷弧菌的抑菌圈直徑達到20mm以上；沙棘水提物及醇提物、大葉桉葉水提物及醇提物、藿香水提物及醇提物對創傷弧菌的抑菌圈也達到15mm以上。牡丹皮醇提物抑制兩種弧菌活性最強，抑菌圈直徑最大，分別為(18.08
±
0.20)mm、(21.69
±
0.30)mm。
[0025]
根據上述實驗結果，選擇抑制創傷弧菌、弧菌活性最好的牡丹皮醇提物作為
進一步實驗對象，測定其最小抑菌濃度(mic)。
[0026]
2、牡丹皮醇提物對兩種弧菌的mic測定
[0027]
采用二倍稀釋法測定牡丹皮醇提物對兩種弧菌的mic，即將1g/ml的牡丹皮醇提液分別稀釋至生藥濃度為500mg/ml、250mg/ml、125mg/ml、62.5mg/ml、31.25mg/ml、15.63mg/ml、7.82mg/ml。于30℃，200r/min搖床振蕩恒溫培養24h后觀察結果，把無菌生長稀釋度最大的藥液濃度作為mic值。
[0028]
表2牡丹皮醇提物對兩種弧菌的最低抑菌濃度實驗結果
[0029][0030]
注：
“?”
表示無活性。
[0031]
實驗結果如表2所示，牡丹皮醇提物對創傷弧菌和弧菌均有較好的抑制作用，mic值分別為15.63mg/ml和31.25mg/ml。
[0032]
實施例2，牡丹皮抑制海洋致病菌有效成分的提取分離、檢測分析。
[0033]
1、抑菌活性成分提取
[0034]
稱取牡丹皮粉末，加入無水乙醇，在室溫下超聲提取30min，再在50℃下回流提取60min，抽濾，同法提取2次，收集濾液，濃縮使生藥的最終濃度為1g/ml。
[0035]
2、抑菌活性成分分離
[0036]
對牡丹皮醇提物進行分離，牡丹皮醇提物旋蒸成浸膏后加入蒸餾水配成混濁液，分別用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取至溶液澄清無，每次萃取時間30min。萃取完畢后，將溶劑旋干后得到干燥粉末，將不同萃取物干燥粉末，配置成10mg/ml的樣品溶液。選取創傷弧菌為目標菌株，采用牛津杯法，在無菌環境下，向平板中倒入約20ml已滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，凝固后，加入200μl的菌懸液，涂布棒涂布均勻，靜置10min。將牛津杯垂直均勻放置于培養基上，分別在杯中加入200μl樣品溶液溶液，每個樣品進行3次平行實驗，移至37℃恒溫培養箱培養18h后，用電子數顯卡尺測定抑菌圈直徑，結果取三次測量結果的平均值。抑菌圈直徑大于20mm為極敏，15～19mm為高敏，10～15mm為中敏，小于10mm為低敏(無活性)。
[0037]
表3牡丹皮各組分抑制創傷弧菌結果
[0038]
[0039]
注：“+++”表示極敏、“++”表示高敏、“+”表示中敏、
“?”
表示低敏(無活性)。
[0040]
通過對不同極性段的分離，得到四個組分。將四個組分進行抑菌實驗，實驗結果如表3所示，石油醚組對創傷弧菌沒有抑制活性，正丁醇組與蒸餾水組對創傷弧菌均有抑制作用。乙酸乙酯組對創傷弧菌有較好的抑制作用。
[0041]
3抑菌活性成分化學定性檢測
[0042]
使用化學定性的方法對乙酸乙酯組進行檢測，用鹽酸+鎂粉、溴甲酚綠溶液及三氯化鐵-鐵溶液進行化學定性檢測。
[0043]
表4牡丹皮抑制創傷弧菌活性成分的檢測
[0044][0045]
實驗結果如表4所示，乙酸乙酯組與溴甲酚綠溶液呈現陽性反應，說明其主要成分為羧酸類化合物；乙酸乙酯組又與三氯化鐵-鐵溶液呈現陽性反應，說明其主要成分為酚酸類化合物。
[0046]
通過上述分離、化學定性檢測，初步確定牡丹皮抑制海洋致病菌的有效成分為酚酸類化合物。
[0047]
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。
