一種用于人或動(dòng)物的核酸快速提取試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
1.本發(fā)明涉及核酸提取領(lǐng)域，特別涉及一種用于人或動(dòng)物的核酸快速提取試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，精準(zhǔn)越來越走近人們的視線。在臨床實(shí)踐中，精準(zhǔn)醫(yī)療追求針對(duì)每個(gè)病人正確選擇和精確應(yīng)用適宜的診療方法，實(shí)現(xiàn)醫(yī)源性損害最小化、醫(yī)療耗費(fèi)最低化以及病患獲益最大化。精準(zhǔn)建立在分子診斷的基礎(chǔ)上，而核酸提取在分子診斷的過程中占據(jù)著非常重要的地位。
3.目前用于核酸提取的方法主要有：溶液提取法、磁珠法和過柱法三種。
4.溶液型抽提是比較經(jīng)典的提取方法，幾乎都含有去污劑(如sds)和鹽(如tris、edta、nacl等)的作用，除了提供一個(gè)合適的裂解環(huán)境，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對(duì)核酸的破壞的抑制劑(如edta)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定的試劑(如nacl)等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。
5.磁珠法提取核酸的原理是運(yùn)用納米技術(shù)對(duì)超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識(shí)別和高效結(jié)合。利用二氧化硅包被的納米磁性微球的超順磁性，在chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場(chǎng)的作用下，從樣本中分離出dna和rna。
6.過柱法提取核酸是用于微量核酸分離純化的較為簡(jiǎn)單的方法，其基本原理是利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來。把釋放出的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，這種載體只對(duì)核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力，對(duì)其他生化成分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則基本不吸附，因而在離心時(shí)被甩出柱子。再把吸附在特異載體上的核酸用洗脫液洗脫下來，分離得到純化的核酸。
7.這些方法不僅操作復(fù)雜、成本高而且因多重操作使得大量的核酸流失，最高提取效率只能達(dá)到30-40％。因此，目前急需要一種高效快速而且有不影響pcr擴(kuò)增效率的核酸提取方法用于分子診斷。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
8.本發(fā)明的目的在于提供一種用于人或動(dòng)物的核酸快速提取試劑盒及其應(yīng)用，不僅提取成本低、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、提取產(chǎn)物不影響pcr擴(kuò)增，而且因?yàn)椴僮鬟^程中不會(huì)引入核酸流失的步驟，提取效率也特別高。
9.為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供一種用于人或動(dòng)物的核酸快速提取試劑盒，包括：sds，所述sds加入待測(cè)樣品后的終體積為0.5％。
10.另外，本方案提供該核酸快速提取試劑盒的應(yīng)用方法，包括步驟：
11.向待測(cè)樣本中添加終體積的0.5％的sds后渦旋震蕩并瞬時(shí)離心；
12.在90℃下加熱一段時(shí)間后充分離心得到上清液，所述上清液含有核酸。
13.在一些實(shí)施例中，所述待測(cè)樣本為人或者動(dòng)物的血液樣本、痰液樣本、肺泡灌洗液樣本、組織液樣本、組織樣本、培養(yǎng)的細(xì)胞系樣本和石蠟組織樣本。
14.在一些實(shí)施例中，所述核酸包括dna和/或rna。
15.具體的，在一些實(shí)施例中，渦旋震蕩30s后瞬間離心。
16.在一些具體實(shí)施例中，90℃水浴或金屬浴加熱6min后在12000xg下離線2min。
17.本方案在提取人或動(dòng)物的核酸樣本時(shí)僅需要sds和depc水，不需要其他額外的試劑使得整體的提取成本極低，且操作也十分簡(jiǎn)單，僅需在90℃下加熱6分鐘后再在12000g下離心2分鐘即可。另外，本方案還可用于任何形式的人或動(dòng)物樣本的dna和rna提取，提取效率極高。
18.相較現(xiàn)有技術(shù)，本技術(shù)方案具有以下的特點(diǎn)和有益效果：
19.本技術(shù)人通過摸索合適的sds濃度使其可在不需要添加其他表面活性劑的前提下就可以使得核酸釋放徹底，剩余的微量sds可以和溶液中的有機(jī)物形成沉淀，加上高溫使蛋白變性，使得通過離心以后溶液中就留下微量的無機(jī)鹽離子和水溶性核酸，使得sds釋放出來的核酸不需要經(jīng)過磁珠或者過柱純化就可以直接用于核酸檢測(cè)。
20.需要說明的是，本方案在提取人或動(dòng)物的血液樣本中的核酸時(shí)不需要經(jīng)過核酸純化。傳統(tǒng)的核酸提取過程中都需要加入較多的酒精進(jìn)行清洗，而本方案通過sds省去了酒精清洗的步驟，使得本方案的未經(jīng)純化的核酸不僅對(duì)正常pcr擴(kuò)增沒有影響，也不會(huì)對(duì)液滴數(shù)字pcr造成影響。
21.具體的，本技術(shù)方案通過添加合適劑量的sds進(jìn)行核酸釋放并加熱的方式，使得細(xì)胞在破裂釋放出核酸的過程中大量的蛋白變性，sds和有機(jī)分子結(jié)合，進(jìn)而使得在離心過程中與絕大部分有機(jī)分子一起進(jìn)入沉淀，只有水溶性的物質(zhì)如核酸和無機(jī)鹽離子留在上清中。因無額外鹽離子的加入，整體環(huán)境中只有細(xì)胞裂解時(shí)釋放出的小部分鹽離子，因此上清中也不會(huì)有特別高的鹽離子濃度；所以，在pcr擴(kuò)增過程中不會(huì)因鹽離子或有機(jī)分子的濃度較高影響擴(kuò)增，反而因?yàn)椴僮鞑襟E少使得核酸流失量低，大大的提高核酸的回收率，本方案的核酸回收率可高達(dá)90％。因此，該方法不僅成本低，每人份只需2-3毛錢、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，不超過10分鐘、提取產(chǎn)物不影響pcr擴(kuò)增，而且因?yàn)椴僮鬟^程中不會(huì)引入核酸流失的步驟，提取效率也特別高。
附圖說明
22.圖1為本發(fā)明實(shí)施例中用于提取血液樣本的dna的結(jié)果示意圖。
23.圖2為本發(fā)明實(shí)施例中用于提取血液樣本的rna的結(jié)果示意圖。
24.圖3是本發(fā)明實(shí)施例的不同sds終濃度的提取效率的示意圖。
具體實(shí)施方式
25.下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
26.實(shí)施例1：血液樣本dna提取效率的驗(yàn)證。
27.本試驗(yàn)中涉及到的儀器設(shè)備：ep管，移液，1ml、200μl、10μl的移液頭，離心機(jī)，金屬浴/水浴鍋(90℃加熱)。
28.以同時(shí)取的同一位患者的外周血的同一批次全血為樣本進(jìn)行檢測(cè)：
29.實(shí)驗(yàn)組：
30.配制好質(zhì)量體積比為10％的sds母液備用；取100μl的全血樣本加入到1.5ml無核酶的ep管中后加入100μl的depc水，再通過計(jì)算加入終濃度為0.5％的sds，渦旋震蕩30s，瞬時(shí)離心；90℃金屬浴加熱6mim；12000xg離心2min；取上清(備用)。
31.對(duì)照組：
32.平行取同一樣本的2份100μl的全血樣本加入到1.5ml無核酶的ep管中，分別使用市面上買的凱杰的磁珠法和過柱法全血核酸提取試劑盒，按照使用說明書提取核酸。
33.核酸測(cè)定：
34.將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組得到的核酸分別使用做其他試劑盒篩選的人的klf2、dusp3和gbp5三個(gè)基因的引物探針配制的體系做qpcr，根據(jù)taq酶的使用說明書，依據(jù)以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40。
35.檢測(cè)結(jié)果如下表1：
36.表一血液中dna測(cè)定結(jié)果
[0037][0038]
從圖中可以看到：經(jīng)過對(duì)對(duì)應(yīng)基因的檢測(cè)ct值和擴(kuò)增曲線的最高熒光強(qiáng)度分析，結(jié)果顯示：該提取方法提取人血液樣本dna對(duì)pcr擴(kuò)增并無影響，因提取效率更高，3個(gè)基因的檢測(cè)ct值均小于過柱法和磁珠法提取的樣本對(duì)應(yīng)的檢測(cè)ct值。說明該提取方法提取血液樣本的dna不僅不影響pcr擴(kuò)增，而且提取效率遠(yuǎn)高于過柱法和磁珠法。
[0039]
實(shí)施例2：：血液樣本rna提取效率的驗(yàn)證
[0040]
本試驗(yàn)中涉及到的儀器設(shè)備：ep管，離心機(jī)，奧盛的金屬浴(90℃加熱)。
[0041]
以同時(shí)取的同一位患者的外周血的同一批次全血為樣本進(jìn)行檢測(cè)：
[0042]
實(shí)驗(yàn)組：
[0043]
配制好質(zhì)量體積比為10％的sds母液備用；取100μl的全血樣本加入到1.5ml無核酶的ep管中后加入100μl的depc水，再通過計(jì)算加入終濃度為0.5％的sds，渦旋震蕩30s，瞬時(shí)離心；90℃金屬浴加熱6mim；12000xg離心2min(具體操作如圖2所示)；取上清(備用)。
[0044]
對(duì)照組：
[0045]
平行取同一樣本的2份100μl的全血樣本加入到1.5ml無核酶的ep管中，分別使用市面上買的凱杰的磁珠法和過柱法全血核酸提取試劑盒，按照使用說明書提取核酸。
[0046]
rna檢測(cè)：
[0047]
本方案的對(duì)照組和試驗(yàn)組分別使用做其他試劑盒篩選的人的klf2、dusp3和gbp5
三個(gè)基因的引物探針和3個(gè)不同廠家的一步法逆轉(zhuǎn)錄酶配制的9體系做qpcr，其中一步法逆轉(zhuǎn)錄酶包括諾唯贊的q225、q227和全式金的aq322等，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶的使用說明書，按以下程序擴(kuò)增：
[0048]
55℃5min；95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
45。
[0049]
檢測(cè)結(jié)果如下表2：
[0050]
表2血液中rna測(cè)定結(jié)果
[0051][0052]
如表2所示，經(jīng)過對(duì)對(duì)應(yīng)基因的檢測(cè)ct值和擴(kuò)增曲線的最高熒光強(qiáng)度分析，結(jié)果顯示：該提取方法提取的rna對(duì)pcr擴(kuò)增并無影響，因提取效率更高，3個(gè)基因使用3種逆轉(zhuǎn)錄酶配制的9種體系的檢測(cè)ct值均小于過柱法和磁珠法提取的樣本對(duì)應(yīng)的檢測(cè)ct值。說明該提取方法提取血液樣本的rna不僅不影響pcr擴(kuò)增，而且提取效率遠(yuǎn)高于過柱法和磁珠法。
[0053]
實(shí)施例3：痰液樣本dna提取效率的驗(yàn)證
[0054]
本試驗(yàn)中涉及到的儀器設(shè)備：ep管，離心機(jī)，奧盛的金屬浴(90℃加熱)。
[0055]
以同時(shí)取的同一位患者的外周血的同一批次痰液為樣本進(jìn)行檢測(cè)：
[0056]
實(shí)驗(yàn)組：
[0057]
配制好質(zhì)量體積比為10％的sds母液備用；痰液液化處理后取1ml放入1.5ml無核酶的ep管中，12000xg離心2min棄上清留沉淀后，向沉淀中加入100μl的depc水，再通過計(jì)算加入終濃度為0.5％的sds，渦旋震蕩30s，瞬時(shí)離心；90℃金屬浴加熱6mim；12000xg離心2min；取上清(備用)。
[0058]
對(duì)照組：平行取同一樣本的2份1ml的痰液樣本加入到1.5ml無核酶的ep管中，分別使用市面上買的某品牌的磁珠法和過柱法的試劑盒，按照使用說明書提取核酸。
[0059]
測(cè)定：分別使用做其他試劑盒篩選的人的klf2、dusp3和gbp5三個(gè)基因的引物探針配制的體系做qpcr，根據(jù)taq酶的使用說明書，按以下程序擴(kuò)增：
[0060]
95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40；
[0061]
檢測(cè)結(jié)果如下表3：
[0062]
表三痰液樣本的dna測(cè)定結(jié)果
[0063][0064]
從結(jié)果可以看到：該提取方法提取痰液樣本的dna不僅不影響pcr擴(kuò)增，而且提取效率遠(yuǎn)高于過柱法和磁珠法。
[0065]
實(shí)施例4：肺泡灌洗液樣本dna提取效率的驗(yàn)證
[0066]
本試驗(yàn)中涉及到的儀器設(shè)備：ep管，離心機(jī)，奧盛的金屬浴(90℃加熱)。
[0067]
以以同一位患者同時(shí)取的同一批次肺泡灌洗液樣本為樣本進(jìn)行檢測(cè)：
[0068]
實(shí)驗(yàn)組：
[0069]
配制好質(zhì)量體積比為10％的sds母液備用；取肺泡灌洗液樣本2ml，12000xg離心2min棄上清，向沉淀中加入100μl的depc水，再通過計(jì)算加入終濃度為0.5％的sds，渦旋震蕩30s，瞬時(shí)離心；90℃金屬浴加熱6mim；12000xg離心2min；取上清(備用)。
[0070]
對(duì)照組：
[0071]
平行取同一樣本的2份2ml的肺泡灌洗液樣本加入到2ml無核酶的ep管中，分別使用市面上買的某品牌的磁珠法和過柱法的試劑盒，按照使用說明書提取核酸：
[0072]
測(cè)定：分別使用做其他試劑盒篩選的人的klf2、dusp3和gbp5三個(gè)基因的引物探針配制的體系做qpcr，根據(jù)taq酶的使用說明書，按以下程序擴(kuò)增：
[0073]
95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40；
[0074]
檢測(cè)結(jié)果如下表4：
[0075]
表四肺泡灌洗液樣本的dna測(cè)定結(jié)果
[0076][0077]
從結(jié)果可以看到：該提取方法提取肺泡灌洗液樣本的dna不僅不影響pcr擴(kuò)增，而且提取效率遠(yuǎn)高于過柱法和磁珠法。
[0078]
實(shí)施例5：培養(yǎng)的細(xì)胞系樣本dna提取效率的驗(yàn)證
[0079]
本試驗(yàn)中涉及到的儀器設(shè)備：ep管，離心機(jī)，奧盛的金屬浴(90℃加熱)。
[0080]
以同一批次培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞系為樣本進(jìn)行檢測(cè)：
[0081]
實(shí)驗(yàn)組：
[0082]
配制好質(zhì)量體積比為10％的sds母液備用；取長(zhǎng)滿的6cm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞系：a549,293和k562各一皿，胰蛋白酶消化分散后棄上清，加入100μl的depc水，再通過計(jì)算加入終濃度為0.5％的sds，渦旋震蕩30s，瞬時(shí)離心；90℃金屬浴加熱6mim；12000xg離心2min；取上清(備用)。
[0083]
對(duì)照組：
[0084]
平行取同同時(shí)鋪板長(zhǎng)滿的6cm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞系：a549,293和k562各一皿，胰蛋白酶消化分散后，分別使用市面上買的某品牌的磁珠法和過柱法的試劑盒，按照使用說明書提取核酸：
[0085]
測(cè)定：分別使用做其他試劑盒篩選的人的klf2、dusp3和gbp5三個(gè)基因的引物探針配制的體系做qpcr，根據(jù)taq酶的使用說明書，按以下程序擴(kuò)增：
[0086]
95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40；
[0087]
檢測(cè)結(jié)果如下表5：
[0088]
表五培養(yǎng)的細(xì)胞系樣本的dna測(cè)定結(jié)果
[0089][0090][0091]
從結(jié)果可以看到：該提取方法提取細(xì)胞系樣本的dna不僅不影響pcr擴(kuò)增，而且提取效率遠(yuǎn)高于過柱法和磁珠法。
[0092]
實(shí)施例6：小鼠組織樣本dna提取效率的驗(yàn)證
[0093]
本試驗(yàn)中涉及到的儀器設(shè)備：ep管，離心機(jī)，奧盛的金屬浴(90℃加熱)。
[0094]
以小鼠的同一批次的肝臟組織樣本為樣本進(jìn)行檢測(cè)：
[0095]
實(shí)驗(yàn)組：
[0096]
配制好質(zhì)量體積比為10％的sds母液備用；取一片新鮮的小鼠肝臟樣本，用手術(shù)剪剪碎，使用組織勻漿儀50hz勻漿30秒兩次，均分成3等分，一份放入到1.5ml無核酶的ep管中后加入100μl的depc水，再通過計(jì)算加入終濃度為0.5％的sds，渦旋震蕩30s，瞬時(shí)離心；90℃金屬浴加熱6mim；12000xg離心2min；取上清(備用)。
[0097]
對(duì)照組：
[0098]
另外兩份加入到1.5ml無核酶的ep管中，分別使用市面上買的某品牌的磁珠法和過柱法的試劑盒，按照使用說明書提取核酸：
[0099]
測(cè)定：分別使用的小鼠的trp53、tlr2和tlr4三個(gè)基因的引物探針配制的體系做qpcr，根據(jù)taq酶的使用說明書，按以下程序擴(kuò)增：
[0100]
95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40；
[0101]
檢測(cè)結(jié)果如下表6：
[0102]
表六小鼠組織樣本的dna測(cè)定結(jié)果
[0103][0104]
從結(jié)果可以看到：該提取方法提取小鼠組織樣本的dna不僅不影響pcr擴(kuò)增，而且提取效率遠(yuǎn)高于過柱和磁珠法。
[0105]
實(shí)施例7：石蠟樣本dna提取效率的驗(yàn)證：
[0106]
本試驗(yàn)中涉及到的儀器設(shè)備：ep管，離心機(jī)，奧盛的金屬浴(90℃加熱)。
[0107]
以非小細(xì)胞肺癌患者的同一批次的石蠟切片樣本樣本進(jìn)行檢測(cè)：
[0108]
實(shí)驗(yàn)組：
[0109]
配制好質(zhì)量體積比為10％的sds母液備用；取5片非小細(xì)胞肺癌患者的石蠟切片樣本，刮到1.5ml無核酶的ep管中脫蠟后使用pbs清洗3次，放入56℃的烘箱里10分鐘使脫蠟的有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，加入100μl的depc水，再通過計(jì)算加入終濃度為0.5％的sds，渦旋震蕩30s，瞬時(shí)離心；90℃金屬浴加熱6mim；12000xg離心2min；取上清(備用)。
[0110]
對(duì)照組：
[0111]
平行取兩份5片非小細(xì)胞肺癌患者的石蠟切片樣本，刮到1.5ml無核酶的ep管中脫蠟后使用pbs清洗3次，放入56℃的烘箱里10分鐘使脫蠟的有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，分別使用市面上買的某品牌的磁珠法和過柱法的試劑盒，按照使用說明書提取核酸：
[0112]
測(cè)定：分別使用做其他試劑盒篩選的人的klf2、dusp3和gbp5三個(gè)基因的引物探針配制的體系做qpcr，根據(jù)taq酶的使用說明書，按以下程序擴(kuò)增：
[0113]
95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40；
[0114]
檢測(cè)結(jié)果如下表7：
[0115]
表七石蠟樣本的dna測(cè)定結(jié)果
[0116][0117]
從結(jié)果可以看到：該提取方法提取提取非小細(xì)胞肺癌石蠟組織樣本的dna不僅不影響pcr擴(kuò)增，而且提取效率遠(yuǎn)高于過柱法和磁珠法。
[0118]
實(shí)施例8不同濃度的sds對(duì)dna提取效率的驗(yàn)證：
[0119]
本試驗(yàn)中涉及到的儀器設(shè)備：ep管，離心機(jī)，奧盛的金屬浴(90℃加熱)。
[0120]
以同時(shí)取的同一位患者的外周血的同一批次全血為樣本進(jìn)行檢測(cè)：
[0121]
實(shí)驗(yàn)組：
[0122]
配制好質(zhì)量體積比為10％的sds母液備用；取100μl的全血樣本加入到1.5ml無核酶的ep管中后加入100μl的depc水，再通過計(jì)算加入終濃度為0.5％的sds，渦旋震蕩30s，瞬時(shí)離心；90℃金屬浴加熱6mim；12000xg離心2min；取上清(備用)。
[0123]
對(duì)照組：其他條件同于實(shí)驗(yàn)組，不同之處在于：對(duì)照組1中加入終濃度為0.1％的sds,對(duì)照組2中加入終濃度為0.2％的sds，對(duì)照組3中加入終濃度為0.3％的sds,對(duì)照組4中加入終濃度為0.4％的sds,對(duì)照組5中加入終濃度為0.6％的sds,對(duì)照組6中加入終濃度為0.8％的sds,對(duì)照組7中加入終濃度為1％的sds,對(duì)照組8中加入終濃度為1.5％的sds。
[0124]
核酸測(cè)定：
[0125]
將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組得到的核酸分別使用做其他試劑盒篩選的人的klf2、dusp3和gbp5三個(gè)基因的引物探針配制的體系做qpcr，根據(jù)taq酶的使用說明書，依據(jù)以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40,得到不同sds濃度下的血液dna提取效率，如表9所示：
[0126][0127][0128]
將不同濃度的血液dna提取效率以濃度為x軸，提取效率為y軸繪制曲線得到如圖3所示的圖，因?yàn)槲覀兊奶崛∥唇?jīng)純化過程，sds濃度較高會(huì)導(dǎo)致酶變性，所以在sds濃度較高時(shí)無擴(kuò)增曲線。sds％的終濃度控制在0.5％時(shí)的提取效率是最佳的。
[0129]
本發(fā)明不局限于上述最佳實(shí)施方式，任何人在本發(fā)明的啟示下都可得出其他各種形式的產(chǎn)品，但不論在其形狀或結(jié)構(gòu)上作任何變化，凡是具有與本技術(shù)相同或相近似的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
