一種用于腫瘤侵襲能力檢測的支架及其制備方法
1.本發明屬于生物材料領域，具體涉及一種用于腫瘤侵襲能力檢測的支架及其制備方法。
背景技術：
2.大多數癌癥死亡是由轉移性腫瘤而不是原發腫瘤引起的。癌細胞通過誘導具有發育過程特征的程序的表達，以上皮層或單個細胞的形式侵入正常組織。從它們的起源組織開始，癌細胞會擴散到不同的靶器官，在那里它們會不斷增殖進而形成繼發性腫瘤（轉移）。以往的研究表明，轉移不僅需要改變癌細胞，還需要改變腫瘤微環境和轉移靶位點。例如，在吸引癌細胞的靶器官中形成了轉移前的生態位。該過程所涉及的分子機制尚不完全清楚，但與細胞-細胞和細胞基質粘附，細胞外基質的降解以及新位點早期生長的啟動和維持相關的那些機制通常被認為是關鍵的。因此，了解癌細胞用于形成轉移的不同機制將有助于更好地評估患者和設計創新的方法。總的來說，如何直觀地觀察到癌細胞的侵襲行為是了解腫瘤轉移機制的關鍵。
3.傳統的2d細胞培養模型技術較為成熟，因其操作簡單、成本低廉和高度可重復性，已經成為了目前體外觀察癌細胞侵襲的最常用的方法。但是，傳統2d培養模型改變了細胞形態、代謝途徑、基因表達和細胞增殖方式，并減少了細胞外基質蛋白的產生，不能很好地體現細胞與細胞之間以及細胞與細胞外基質之間的相互作用，無法模擬實體瘤特性和體內癌細胞侵襲的過程。
4.近年來，介于單層的2d細胞培養和動物實驗之間的體外3d細胞培養模型技術逐步發展起來，主要是利用懸滴法、液體覆蓋法、旋轉法等無支架培養方法和支架法等三維培養技術。體外三維培養，克服了上述2d培養的不足，能夠更好的模擬體內癌細胞所處的微環境。在細胞功能研究方面，三維培養的優點主要包括：（1）實現細胞間以及細胞外基質的相互作用，能夠實現特定的生物信號轉導以及細胞增殖、黏附、遷移和蛋白表達等功能。（2）填補了2d細胞培養系統與體內腫瘤之間的鴻溝，不僅可以得到類似于體內實驗的生物表型，同時具有體外細胞實驗的直觀性和條件可控性等優勢。（3）便于觀測惡性腫瘤在三維環境中的遷移過程。因此，3d培養對腫瘤的生物學行為的研究具有重要意義。
5.盡管可以模擬體內的三維環境，不同的三維培養技術也存在各自的不足。無支架培養方法均需大型的機械裝置，價格較為昂貴，并需要特定的培養基以及細胞換液方式，需要實驗室具備一定的實驗條件。支架法是將具有生物相容性的材料，通過交聯、冷凍干燥等方式，使其具有一定支撐力并形成多孔的3d細胞支架。有研究人員采取有機試劑等材料制備復合多孔支架，雖然此方法中材料種類較多，但制備過程復雜且部分材料具有細胞毒性，不利于細胞黏附及生長。因此，制備具有安全無毒、結構穩定、生物相容性好的三維培養的支架是模擬癌細胞侵襲過程的重要基礎。此外，以往的研究結果以及相關發明大多數側重于癌細胞的培養和藥物檢測。其技術手段在于檢測癌細胞在支架上的基因和蛋白的表達，卻很少進行對癌細胞生物學行為的檢測尤其是癌細胞的侵襲能力的觀察。
技術實現要素：
6.本發明的目的是構建能夠較好模擬體內腫瘤微環境，安全無毒，并且能夠方便直觀地觀察癌細胞侵襲情況的三維多孔細胞支架，為解決在體外研究中二維培養不能全面模擬癌細胞侵襲的問題、提供三維情況下的腫瘤轉移模型、并更好的詮釋三維培養中腫瘤細胞侵襲的機制。
7.為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案為：一種用于腫瘤侵襲能力檢測的支架的制備方法，包括以下步驟：s1稱取殼聚糖溶于一定濃度乙酸溶液中，攪拌混勻，制成殼聚糖乙酸溶液；s2 配制羧甲基纖維素鈉溶液；將羧甲基纖維素鈉溶液緩慢滴加至殼聚糖乙酸溶液中，在攪拌機中攪拌獲得均勻的殼聚糖-羧甲基纖維素鈉混合液；s3 將s2中得到的混合液加入到48孔板中，混合液添加完畢后，將孔板于4
°
c預冷6h，后置于-20
°
c冷凍12h；將冷凍好的樣品用冷凍切片機切成圓柱形支架；s4 打開凍干機，預凍4 h后，將s3中切割完畢的支架同樣放置于孔板中真空冷凍干燥；s5.配制一定濃度的氨水溶液，將氨水溶液加入裝有支架的孔板中，與殘留的乙酸結合并反應一小時，期間每隔10min輕輕吹打兩下以至于兩者充分結合，而后用去離子水漂洗3-4次，除去殘余的溶液，后將該孔板置于冰箱-20℃冷凍12-18h；s6 打開凍干機，預凍4 h后，將s5中的支架真空冷凍干燥確保水分全部去除，制得三維多孔細胞支架。
8.進一步的，步驟s1中的乙酸溶液的濃度為4%，殼聚糖乙酸溶液的質量濃度為4%。
9.進一步的，步驟s2中的羧甲基纖維素鈉溶液的質量濃度為1%。
10.進一步的，步驟s2中殼聚糖-羧甲基纖維素鈉混合液中的聚糖和羧甲基纖維素鈉的質量比為8:1，步驟s2羧甲基纖維素鈉溶液與殼聚糖乙酸溶液在50℃恒溫條件下進行混合。
11.進一步的，步驟s3中將混合液加入到48孔板中時，每孔1ml。
12.進一步的，步驟s3圓柱形支架的厚度為2mm。
13.進一步的，步驟s5氨水溶液的濃度為25%。
14.進一步的，步驟s4、s6中冷凍溫度為-75℃～-80℃，冷凍干燥時間分別為24h、48h。
15.另外，本發明還提供上述制備方法制備得到的用于腫瘤侵襲能力檢測的支架。
16.本發明還提供上述制備方法制備的用于腫瘤侵襲能力檢測的支架在腫瘤侵襲能力檢測中的應用。
17.與現有技術相比本發明具有以下有益效果：本發明提供的一種用于腫瘤侵襲能力檢測的支架，具有良好的生物相容性，實驗證明癌細胞能夠在該支架上很好的黏附以及增殖。此外，該支架結構穩定，不易降解能夠很好的用來追蹤癌細胞在三維環境中的侵襲行為。該支架不僅可以富集腫瘤細胞并模擬體內腫瘤侵襲的微環境，還可以幫助科研人員更加直觀地觀察癌細胞侵襲的過程以便于開展對腫瘤侵襲能力的檢測。
附圖說明
18.圖1為實施例1所獲得殼聚糖/羧甲基纖維素鈉多孔型支架實物圖。
19.圖2為實施例1所獲得殼聚糖/羧甲基纖維素鈉多孔型支架掃描電鏡圖。
20.圖3為實施例1所獲得殼聚糖/羧甲基纖維素鈉多孔型支架顯微鏡圖。
21.圖4為cck-8法檢測普通二維細胞培養、殼聚糖/羧甲基纖維素鈉多孔型支架三維培養的細胞增殖能力的變化圖。
22.圖5為實施例1所獲得殼聚糖/羧甲基纖維素鈉多孔型支架上1、3、5天的肝癌細胞活死染結果圖。
23.圖6為實施例1所獲得殼聚糖/羧甲基纖維素鈉多孔型支架上第七天的細胞骨架染以及細胞核dapi染圖。
24.圖7為實施例1所獲得殼聚糖/羧甲基纖維素鈉多孔型支架空白組、殼聚糖/羧甲基纖維素鈉多孔型支架上第七天的肝癌細胞黏附的掃描電鏡圖。
25.圖8為實施例1所獲得殼聚糖/羧甲基纖維素鈉多孔型支架紅外圖譜。
具體實施方式
26.以下結合具體實施例對本發明作進一步說明。
27.實施例1一種用于腫瘤侵襲能力檢測的支架的制備方法，包括如下步驟：s1:量取4 ml的乙酸溶液于容量瓶中，用去離子水定容至100 ml，配成4 %的乙酸溶液。
28.s2:稱取0.8 g殼聚糖溶于20 ml的4%的乙酸溶液中，在攪拌機中攪拌混勻2h，制成20 ml濃度為4%殼聚糖溶液。
29.s3:稱取0.1 g羧甲基纖維素鈉溶于10 ml的去離子水中，在攪拌機中攪拌1h，制成10 ml的1%羧甲基纖維素鈉溶液。
30.s4: s2和s3兩種溶液分別在室溫下靜置過夜，后在50℃恒溫條件下，將羧甲基纖維素鈉溶液緩慢滴加至殼聚糖溶液中（殼聚糖溶液和羧甲基纖維素鈉溶液體積比2:1 混合），在攪拌機中攪拌5 h，以獲得均勻的殼聚糖-羧甲基纖維素鈉溶液。
31.s5:將s4中得到的混合液加入到48孔板中，每孔1ml。
32.s6:溶液添加完畢后，將孔板于4
°
c預冷6h，后置于-20
°
c冷凍12h。
33.s7:將冷凍好的樣品用冷凍切片機切成厚度為2 mm的圓柱形支架。
34.s8:打開凍干機，預凍4 h后，將s7中切割完畢的支架同樣放置于孔板中真空冷凍（-75℃～-80℃）干燥24 h。
35.s9:量取25 ml濃度為50%的氨水，加入等量去離子水，稀釋成25%的氨水溶液。s10:將s9中得到的氨水溶液加入裝有支架的孔板中，與殘留的乙酸結合反應一小時，期間每隔10min輕輕吹打兩下以至于兩者充分結合。而后用去離子水漂洗3-4次，除去殘余的溶液。后將該孔板置于冰箱-20℃冷凍12-18h。
36.s11:打開凍干機，預凍4 h后，將s10中的支架真空冷凍（-75℃～-80℃）干燥48h確保水分全部去除。制得3d多孔殼聚糖/羧甲基纖維素鈉支架（即用于腫瘤侵襲能力檢測的支架），并置于干燥器中備用。
37.將實施例1制得的3d多孔殼聚糖/羧甲基纖維素鈉支架上進行紅外光譜分析：分別將殼聚糖、羧甲基纖維素鈉、殼聚糖/羧甲基纖維素鈉3d支架置于紅外光譜儀上，檢測三種物品的紅外光譜，并進一步分析，結果如圖8所示，圖8中a為殼聚糖中，在3300多中附近出現羥基（o-h）和氨基（n-h）的伸縮振動吸收峰，在1500-1635處附近存在是氨基（n-h）的變形振動吸收峰，在1100多附近存在（c-o）的伸縮振動吸收峰。b為羧甲基纖維素鈉中，3300附近出現羥基（o-h）伸縮振動吸收峰，1600-1800處屬于羰基（c=o）的伸縮振動峰，在1400多處屬于離子化羧基的c-o的伸縮振動，1300-1080分別對應c-o的彎曲振動和羥基c-o的伸縮振動。c為在復合支架中，在3500存在羥基（o-h）的伸縮振動吸收峰，在1100存在c-o的彎曲振動吸收峰，在1600附近可以觀察到酰胺的羰基（c=o）的伸縮振動吸收峰，由此可以說明，殼聚糖和羧甲基纖維素鈉通過酰胺化反應發生交聯，得到復合支架。最終得出殼聚糖與羧甲基纖維素鈉發生酰胺反應生成酰胺鍵，表明材料合成成功。
38.將實施例1制得的3d多孔殼聚糖/羧甲基纖維素鈉支架上進行肝癌細胞培養：（1）huh7肝癌細胞復蘇離心并重懸于dmem培養基中（含10％fbs和 1％青鏈霉素溶液），于37
°
c、5% co2細胞培養箱中培養至細胞匯合達到約80%時，通過胰蛋白酶消化和離心獲得細胞懸液；（2）將3d多孔殼聚糖/羧甲基纖維素鈉支架用酒精浸泡1h同時使用紫外燈車照射1h，而后加入pbs洗滌3次，加入完全培養基浸泡過夜，最后接種細胞，待細胞貼壁后補充培養基，在37
°
c、5% co2 培養箱中培養；（3）分別在培養1、3、5、7d后將支架進行cck-8細胞增殖實驗，以普通24孔板培養為對照，并在450nm處測量od值；結果如圖4所示，圖4表明隨著時間的增長，所合成的支架具有良好的生物相容性，而且伴隨著復合多孔支架的降解，這些降解的有機物可以被細胞很好的吸收，進一步的促進細胞增殖，提示所合成的復合多孔支架將更有利于觀察癌細胞的侵襲情況。
39.（4）分別在培養1、3、5、7d后將支架進行活/死細胞染，并使用熒光顯微鏡進行觀察，綠為活細胞，紅為死細胞；結果如圖5所示。圖5展示了同圖4相同的結果：該復合多孔支架可以很好的促進細胞的增殖，從圖像上可以更加直觀地了解到細胞的分布和生長狀況。
40.（5）培養7d后將支架以及支架上的細胞首先使用組織固定液進行固定15min，使用pbs溶液沖洗支架3-5遍以去除組織固定液，而后進行分別進行細胞核和f-actin染。首先是要將固定好的支架浸泡在鬼筆環肽標記的fitc染料中30min，使用pbs溶液反復沖洗3-5遍以去除未結合的染料。然后將支架浸泡在dapi溶液中15min以標記細胞核，使用pbs溶液反復沖洗3-5遍以去除未結合的染料。最后，使用組織冷凍切片機將支架層切成100um厚的組織切片，將切片置于熒光顯微鏡下觀察，結果如圖6所示，通過觀察不同層數的細胞分布從而分析癌細胞侵襲的情況以及具體機制。圖6展示了在距離支架表面200-300um處癌細胞的遷移情況，而且通過dapi染和細胞骨架的染，我們可以進一步進行細胞定位并觀察細胞在該位置處的骨架鋪展情況。
41.（6）培養7d后將支架進行固定以及脫水處理，首先使用pbs清洗支架兩次，然后使用5%戊二醛溶液對細胞進行固定，時間約40min。待細胞固定完成后，進行細胞脫水處理。運用常見的梯度脫水的方法，分別使用50%、60%、70%、80%、90%酒精溶液以及無水乙醇浸泡
10min，最后將無水乙醇吸出，將支架置于通風櫥內過夜待自然風干后進行下一步的操作。使用組織切片機支架層切成100um厚的薄片，并將層切后的支架表面進行噴金處理，而后送入掃描電子顯微鏡內可以觀察到支架表面形貌以及支架內部的侵襲情況。如圖7所示，我們選取了距離支架表面400-500um處的支架切面，掃描電子顯微鏡的結果表明：該復合多孔支架還原了癌細胞在體內的組織中的生長和侵襲狀態。其中癌細胞形態接近于圓球狀或橢球狀，表現出成堆聚集生長的特性。進一步的，箭頭標注位置表示，即使在支架孔隙邊緣，癌細胞依舊能夠很好的黏附生長，并為后續的癌細胞集體侵襲做好鋪墊。總的來說，本專利中所設計的多孔復合支架可以很好的觀察到不同層面的細胞鋪展和遷移情況。
