活細胞培養觀測裝置、制造方法和使用方法
1.本發明屬于生物實驗用品技術領域，更具體地涉及一種活細胞培養觀測裝置、其制造方法和使用方法。
背景技術：
2.如果能夠在保持細胞活性的同時追蹤細胞結構和生理狀態的變化，將對于揭示生命活動規律、疾病發病機制、微生物進化發育、地殼元素分布、污染物毒理效應等許多細胞生物學問題有極大促進作用。現階段對于細胞的顯微觀測主要是先在培養基中培養，然后在不同的階段取樣轉移至顯微鏡的操作臺上進行觀測。這種操作首先導致一些細胞由于缺乏營養物質而失去生理活性，無法連續觀測；其次，轉移過程中會改變環境的氧化還原條件，影響對實驗結果的判斷。
3.活細胞成像技術要求在不破壞細胞整體結構的前提下，準確捕捉活細胞的真實生理狀態。考慮到維持細胞正常生理狀態需要營養物質、氣體氛圍、適宜的溫度條件等，用于活細胞連續培養及觀測的裝置必須具有營養物質供給、良好的氣密性和/或溫控系統。目前，針對活細胞連續培養及觀測的裝置主要有兩種設計思路，一是對顯微鏡進行改造，二是對培養皿進行功能化設計。為控制觀測環境中的氧氣濃度，一些顯微鏡制造商在顯微鏡上搭建了一個小型密封箱，可以根據不同細胞的生長需求調節箱內氣體成分和含量。但是，這種設計為保持溫度恒定需要消耗較多的能量，并且沒有設置給細胞供給營養物質的功能部件。
4.為解決營養物質的供給，一些制造商改進了培養皿的結構，在培養皿側壁上開設了液體流通管道，允許新鮮培養基的流入和廢物的排出。然而，由于技術受限導致各組裝部件的連接處容易漏氣，影響了裝置的整體氣密性。此外，將多個部件組裝在一起的操作也較為復雜。因此，亟需開發一種整體考慮且更加適用的活細胞培養觀測裝置及配套的使用方法。
技術實現要素：
5.有鑒于此，本發明的主要目的在于提供一種活細胞培養觀測裝置、其制造方法和使用方法，以期至少部分地解決上述技術問題。
6.為了實現上述目的，作為本發明的第一個方面，提出了一種活細胞培養觀測裝置，包括主體腔室、孵育底片和頂蓋，其中：
7.所述主體腔室為內部中空的結構，上下表面貫通，分別與孵育底片和頂蓋密封固定連接；所述主體腔室內部中空結構與所述孵育底片及頂蓋圍成一空間，其內放置培養觀測的活細胞及其培養基質；所述主體腔室的側壁上設置有液體出入口和氣體出入口，用于給所述活細胞供給營養物質和提供適宜的氣氛；
8.所述孵育底片需要滿足顯微鏡成像要求，用于承載所述活細胞及其培養基質；
9.所述頂蓋采用透明設計，用于提供觀察窗口和顯微鏡成像的光路通道。
10.作為本發明的第二個方面，還提出了一種如上所述的活細胞培養觀測裝置的制造方法，包括如下步驟：
11.單獨制造所述主體腔室，尤其優選采用3d打印方式制造所述主體腔室；
12.將預先制造和/或購買的孵育底片和頂蓋裝配到所述主體腔室上，密封固定，由此得到所述活細胞培養觀測裝置。
13.作為本發明的第三個方面，還提出了一種如上所述的活細胞培養觀測裝置的使用方法，包括以下步驟：
14.將所述活細胞培養觀測裝置轉移到超凈臺或厭氧手套箱中；
15.將所述活細胞培養觀測裝置的液體入口和液體出口與對應連接管道連接，其中液體出口與廢液收集裝置固定連接；將活細胞和新鮮的培養基質從液體入口注入到孵育底片上；
16.將所述活細胞培養觀測裝置的氣體入口和氣體出口與對應連接管道連接，在外部調節好所需的氣體氛圍后通過氣體入口將其導入所述主體腔室；
17.將所述活細胞培養觀測裝置從超凈臺或厭氧手套箱中取出，安裝加熱元件和測溫元件；完成所述活細胞培養觀測裝置各部分的機械連接和電連接后，將所述活細胞培養觀測裝置轉移到觀測或成像裝置的對應平臺上，進行連續的培養及觀測。
18.基于上述方案可知，本發明的活細胞培養觀測裝置、其制造方法和使用方法相對于現有技術至少具有如下有益效果之一：
19.(1)本發明的培養觀測裝置集成了多種功能，結構簡單，組裝方便，可根據不同實驗需要調整氣體出入口的位置、大小和數量；
20.(2)本發明的培養觀測裝置滿足了各類細胞正常生長的營養物質需要，并可通過液體出口及時排出廢物；
21.(3)本發明的培養觀測裝置氣密性良好，至少可在48h內保持嚴格厭氧的氣體氛圍(例如，氧氣濃度＜0.5％)，能夠在至少24h內穩定厭氧微生物的生理狀態；并且可根據不同種類細胞的需要，調整氣體的成分和濃度；
22.(4)本發明的培養觀測裝置能夠為細胞的生長提供適宜的溫度(例如，30-40℃)，維持了細胞的生理活性；
23.(5)本發明的培養觀測裝置兼容性強，可適配于多種觀測及成像裝置，應用范圍廣；并且裝置的成本較低，清洗消毒后可以重復使用。
附圖說明
24.下面結合附圖和實施例對本發明的裝置作進一步說明：
25.圖1是本發明實施例1的活細胞培養觀測裝置的結構示意圖；
26.圖2a為所述活細胞培養觀測裝置的主體腔室的正視圖；
27.圖2b為所述活細胞培養觀測裝置的主體腔室的側視圖；
28.圖2c為所述活細胞培養觀測裝置的主體腔室的俯視圖；
29.圖3a是所述活細胞培養觀測裝置的主體腔室的側剖面圖；
30.圖3b是所述活細胞培養觀測裝置的主體腔室的正剖面圖；
31.圖4是采用本發明實施例1的活細胞培養觀測裝置對大腸桿菌進行培養及觀測的
結果的多張顯微鏡照片；
32.上述附圖中，附圖標記含義如下：
33.1、頂蓋；
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2、主體腔室上凹槽；
34.3、氣體出口；
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4、液體出口；
35.5、主體腔室；
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6、孵育底片；
36.7、溫度傳感器探頭固定處；
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8、電加熱帶穿入起點；
37.9、液體入口；
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10、氣體入口；
38.11、電加熱帶穿入終點；
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12、氣體流通通道端口；
39.13、固定電加熱帶通道；
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14、液體流通通道；
40.15、主體腔室下凹槽；
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16、主體腔室側壁內氣體通道；
41.17、電加熱帶的半程穿入點；
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18、液體流通通道端口。
具體實施方式
42.為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，并參照附圖，對本發明作進一步的詳細說明。
43.為了在保持細胞活性的同時，還可以追蹤細胞結構和生理狀態的變化，本發明的發明人經過精心研究，在考慮到維持細胞正常生理狀態需要營養物質、氣體氛圍、適宜的溫度等條件時，開發出一種活細胞培養觀測裝置、其制造方法和使用方法，以用于活細胞的連續培養及觀測，該培養觀測裝置根據任務的需要，具有營養物質供給、良好的氣密性和/或溫控系統。本發明的活細胞培養觀測裝置既可以臨時作為培養裝置，滿足活細胞的培養條件，又可以作為觀測裝置，直接插接到體式顯微鏡、倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或高清照相機等多種觀測及成像裝置上，進行活細胞的實時觀測。
44.具體地，本發明的活細胞培養觀測裝置，包括主體腔室、孵育底片和頂蓋，其中：
45.主體腔室為內部中空的結構，上下表面貫通，可以分別與孵育底片和頂蓋密封連接。所述主體腔室內部中空結構與所述孵育底片及頂蓋圍成一空間，其內放置培養觀測的活細胞及其培養基質。所述主體腔室材質例如包括透光性好的材料，如透明樹脂(如亞克力)或玻璃，優選為樹脂。在一個優選實施方式中，所述主體腔室頂部和底部均設有環狀凹槽，分別用于固定頂蓋和孵育底片。所述主體腔室的側壁根據具體應用場景可能設置有液體入口/出口、氣體入口/出口。在一個優選實施方式中，所述主體腔室側壁可以同時開設有液體入口/液體出口、氣體入口/氣體出口，用于分別提供液體培養基、氣體氛圍的輸入輸出和廢物的排出；所述液體入口、液體出口、氣體入口、氣體出口與所述主體腔室內部連通，例如主體腔室側壁內設有內徑6-10mm的貫穿管道，用于外界氣體和液體通過氣體出入口和液體出入口與腔室內部連通。液體入口、液體出口、氣體入口、氣體出口優選采用標準接口，便于與乳膠管等其它器件連接。液體流量通過微型蠕動泵控制，氣體流量通過氣體流量計控制。此外，所述主體腔室的側壁上可以設置有若干溫度檢測裝置和/或溫度調節裝置，例如，所述主體腔室側壁內設有一圈長10-15mm，寬2-10mm的條形通道，用于固定微型電加熱元件，如電加熱片、電加熱膜、電加熱帶和/或電加熱棒等。此外，所述主體腔室的底部可以設置有測溫元件，例如，所述主體腔室底部設有一內徑4mm、長30mm的圓柱形通道，用于嵌入溫度傳感器探頭、熱敏電阻元件等。
46.孵育底片需要滿足多種顯微鏡的物鏡成像要求，可以選用現成的承載玻片，也可以采用透明材料制造，例如透明玻璃或光學樹脂來制造；更優選地，可以采用表面經過親水性處理的硼硅酸鹽玻璃來制造。所述孵育底片的厚度范圍例如在0.05-0.50mm，優選0.17mm。孵育底片與主體腔室密封連接后形成一個用于放置活細胞和液體培養基的容器，其中可以通過主體腔室側壁的液體入口/出口、氣體入口/出口給所述活細胞供給適合的營養物質和氣氛。
47.所述頂蓋也是透明設計，可以用于肉眼觀察腔室內液體和顯微鏡的位置，并允許各類光源的透過。所述頂蓋材質例如包括透光性好的材料，例如透明玻璃或樹脂(如亞克力)，優選透明玻璃。
48.在一個優選實施方式中，所述頂蓋和孵育底片通過粘結劑與主體腔室的上下凹槽分別固定連接；所述主體腔室的上下凹槽深度大于孵育底片和頂蓋的厚度；所述主體腔室的上下凹槽面積大于孵育底片和頂蓋的面積，所述主體腔室的上下凹槽內的上下圓孔的面積小于孵育底片和頂蓋的面積，光線可以從上下圓孔穿透頂蓋、主體腔室和孵育底片到達顯微鏡物鏡處。
49.在一個優選實施方式中，所述主體腔室側壁內用于安裝加熱元件的條形通道設置在氣體出入口和液體出入口之間，寬度范圍在2-10mm，優選4mm；所述主體腔室側壁內的條形通道與主體腔室內壁的距離范圍在0.2-1.0mm，優選0.5mm；所述主體腔室側壁內的條形通道與主體腔室外壁的距離為5-10mm，優選6.5mm。
50.作為優選，所述主體腔室側壁內的條形通道在垂直于氣體出入口和液體出入口處例如可以相對設置長方形開口，以便于條形電加熱帶的嵌入。
51.所述主體腔室側壁內的液體管道入口端位置高于出口端，高度差范圍在2-5mm，防止主體腔室內部的液體倒吸；所述主體腔室側壁內的液體管道入口端和出口端均為縫隙結構，例如圓弧形的縫隙結構，縫隙與腔室內徑的長度比為1/2-2/3，寬度范圍在1-3mm，便于液體快速均勻分布；所述主體腔室側壁內的液體管道與出口端縫隙的連接處為漸變結構，漸變段長度范圍在2-5mm，收縮角介于15-30
°
間，這樣的設計進一步優化了液體流動平穩性，避免管道堵塞和積存基質殘渣，也避免液體流動太劇烈導致觀測活細胞時無法對焦某一具體活細胞。
52.所述活細胞培養觀測裝置外形輪廓和部件設置與各觀測及成像裝置相匹配，從而可兼容體式顯微鏡、倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡以及高清照相機等多種觀測及成像裝置。
53.此外，本發明還提出一種上述活細胞培養觀測裝置的制造方法，包括如下步驟：
54.單獨制造所述主體腔室，例如可以采用增材制造，尤其例如是3d打印的方式來制造所述主體腔室；當然也可以采用先制造多個部件再拼裝的方式，不過要處理好密封性和粘結強度的問題。
55.將預先制造和/或購買的孵育底片、頂蓋裝配到所述主體腔室上，密封固定，由此得到所述活細胞培養觀測裝置。
56.上述步驟中，密封固定方式例如可以為膠粘劑粘結，也可以是密封墊片等密封材料壓緊封裝。
57.此外，本發明還提出一種活細胞培養和/或觀測的方法，其采用上述的活細胞培養
觀測裝置進行操作，其也是上述活細胞培養觀測裝置的使用方法，包括以下步驟：
58.將所述活細胞培養觀測裝置轉移到超凈臺或厭氧手套箱中；
59.將所述活細胞培養觀測裝置的液體入口和液體出口與對應連接管道連接，其中液體出口與廢液收集裝置固定連接；將活細胞和新鮮的培養基質從液體入口注入到孵育底片上；
60.將所述活細胞培養觀測裝置的氣體入口和氣體出口與對應連接管道連接，在外部調節好所需的氣體氛圍后通過氣體入口將其導入所述主體腔室；
61.將所述活細胞培養觀測裝置從超凈臺或厭氧手套箱中取出，安裝加熱元件和測溫元件；完成所述活細胞培養觀測裝置各部分的機械連接和電連接后，將所述活細胞培養觀測裝置轉移到觀測或成像裝置的對應平臺上，進行連續的培養及觀測。
62.在一個優選實施方式中，該使用方法包括如下步驟：
63.首先將孵育底片、主體腔室和頂蓋組裝完成后，轉移到超凈臺或厭氧手套箱中；然后將活細胞從液體入口端注入到孵育底片上，再把新鮮培養基和廢液收集瓶通過軟管分別與液體入口端和出口端固定；然后再將細胞所需的氣體氛圍通過軟管與氣體的入口端和出口端固定；
64.將裝置從超凈臺或厭氧手套箱中取出，安裝電加熱帶和溫度傳感器探頭；完成裝置各部分的連接后，將裝置轉移到觀測或成像裝置的對應平臺上進行連續的培養及觀測。
65.其中，液體入口端例如通過接入帶微型蠕動泵的輸液管道來控制液體供給；而氣體入口段例如通過控制氣體流量計，以控制若干氣體的氣體流量，或者直接輸送預先配制好對應濃度的氣體來控制氣體氣氛。
66.下面結合實施例對本發明作進一步詳細的闡述，但本發明的范圍不限于此。顯然，下文中描述的實施例僅是本發明的部分實施例，而不是全部實施例；基于本發明的下述實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所獲得的所有實施例，都屬于本發明的保護范圍。
67.實施例
68.本實施例的活細胞培養觀測裝置的結構如圖1-圖3b所示，主要包括頂蓋1、主體腔室5和孵育底片6，其中：
69.頂蓋1用于肉眼觀察腔室內液體和顯微鏡的位置，并允許各類光源的透過；孵育底片6用于承載活細胞和液體培養基。
70.主體腔室5材質為透明的光敏樹脂，其側壁分別開設有液體入口9和液體出口4，液體入口9用于添加新鮮的培養基，液體出口4用于排出細胞培養過程中產生的廢物；主體腔室5的側壁開設有氣體入口10和氣體出口3，用于提供氣體氛圍。氣體入口10、氣體出口3、液體入口9、液體出口4均為變徑結構，便于固定硅膠導管，提高裝置的氣密性。
71.主體腔室5側壁內設有貫穿管道16，用于氣體入口10和氣體出口3與腔室內部聯通；主體腔室5側壁內設有貫穿管道14，用于液體入口9和液體出口4與腔室內部聯通。主體腔室5側壁內的氣體管道16的進口端和出口端設置在同一水平線上，主體腔室5側壁內的液體管道14進口端位置高于出口端，防止主體腔室5內部的液體倒吸。液體管道14的出口端18為一段圓弧型的縫隙結構，縫隙與腔室內徑的長度比為1/2，寬度為1mm，便于液體快速均勻分布；液體管道14與出口端18的連接處為漸變結構，漸變段長度為5mm，收縮角為15
°
。
72.主體腔室5的側壁內設有一圈條形通道13，用于固定電加熱帶；條形通道13開設有兩個長方形開口，方便電加熱帶的穿入，長方形開口8作為電加熱帶的穿入起點，長方形開口17作為電加熱帶的半程穿入點，條形通道13的開口11作為電加熱帶的終點。主體腔室5底部設有一頂端封閉的圓柱形通道7，用于嵌入溫度傳感器探頭。
73.主體腔室5的頂部和底部分別開設了上凹槽2和下凹槽15，上凹槽2用于固定連接頂蓋1，下凹槽15用于固定連接孵育底片6。上凹槽2的深度大于頂蓋1的厚度，下凹槽15的深度大于孵育底片6的厚度。上下凹槽2和15與頂蓋1和孵育底片6的連接處涂有粘結劑，可將頂蓋1和孵育底片6與主體腔室5穩定連接，氣密性良好。
74.本實施例使用所述活細胞連續培養及觀測的裝置和使用方法對大腸桿菌進行了連續培養和觀測。首先將主體腔室5、孵育底片6和頂蓋1組裝到一起放進超凈臺中，將預先培養的大腸桿菌從液體入口9處注射進主體腔室5內，然后將充滿潔凈空氣的集氣袋通過硅橡膠管分別連接在氣體入口10和氣體出口3處，然后再將液體培養基通過硅橡膠管連接在液體入口9處，將廢物收集瓶連接在液體出口4處。
75.然后將裝置整體移出超凈臺，并組裝溫控系統。首先將電加熱帶從主體腔室5側壁的長方形開口8處穿入，一直延伸至半程穿入點長方形開口17，然后在條形通道13的開口11處穿出，完成電加熱帶的組裝。再將溫度傳感器探頭嵌入到主體腔室5底部的圓柱形通道7，溫度傳感器探頭的頂部要頂到圓柱形通道7的盡頭，完成整套溫控系統的組裝。
76.將裝置轉移至激光掃描共聚焦顯微鏡的載物臺上，更換物鏡至100倍油鏡后，在油鏡的鏡頭上均勻地涂抹香柏油，調整載物臺將主體腔室5的圓孔對準顯微鏡的物鏡，移動粗準焦螺旋抬升物鏡至剛好接觸孵育底片6，再微調細準焦螺旋和光源，進行顯微觀測。實驗結果如圖4所示，大腸桿菌清晰可見，觀測效果與商用的共聚焦培養皿效果一致。
77.本實施例的裝置和方法操作簡便，能根據實際需求對不同種類的細胞進行連續培養、觀測和暴露實驗，可適配于多種觀測及成像裝置，兼容性強。
78.以上所述的具體實施例，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施例而已，并不用于限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
