用于針對抗體的免疫測定的校準和質量控制試劑的制作方法
用于針對抗體的免疫測定的校準和質量控制試劑
1.相關申請的交叉引用/援引并入的聲明本技術根據35 usc
?§?
119(e)要求2020年4月24日提交的美國臨時申請號63/015,223的權益。上述引用的專利申請的全部內容在此明確通過引入并入本文。
2.關于聯邦資助的研究或開發的聲明不適用。
3.背景在2020年6月，美國食品藥品監督管理局(fda)發布了一項由siemens healthineers (tarrytown, ny)開發的基于實驗室的總抗體測試的緊急使用授權(eua)，用于檢測sars-cov-2抗體的存在，包括血液中的igm和igg。sars-cov-2病毒表面上的刺突蛋白使病毒能夠侵入和感染見于多種器官和血液血管中的人類細胞。siemens healthineers的總抗體cov2t測定經設計用于檢測針對刺突蛋白的抗體。認為這些抗體中和sars-cov-2病毒，并由此預防感染。多種針對sars-cov-2開發的潛在疫苗將刺突蛋白納入其關注點。
4.正如需要新的和改進的covid-19免疫測定，存在對于這些免疫測定的校準物的對應需求，以確保其準確性。具體而言，需要用于免疫測定的校準物的抗-病毒抗原抗體，諸如(但不限于) covid-19免疫測定。由于covid-19大流行和對這些抗體的巨大需求，這些抗-病毒抗原抗體已變得非常昂貴，并且難以獲得所需的量。預測covid-19免疫測定校準物的需求將達每年數百萬小瓶，其換算成克，成本將達數百萬美元。因此，這類原材料的成本會是令人望而卻步的天文數字，并且這類原材料也有供應問題。因此，急需使得校準物產品中利用的實際抗-病毒抗原抗體最小化的方法。
5.附圖簡述圖1示意性地描繪使用包含抗-病毒抗原抗體的校準試劑的cv2t loci
?
免疫測定形式。
6.圖2示意性地描繪使用根據本公開構建的校準試劑的cv2t loci
?
免疫測定形式。
7.詳細描述在通過示例性語言和結果的方式詳細解釋本公開的至少一個實施方案之前，應理解，本公開的應用不限于下面的描述中闡述的組分的構建和排列的細節。本公開能夠具有其它實施方案，或者能夠以各種方式實踐或實施。因此，本文使用的語言意欲被給予最廣泛的可能范圍和含義；并且實施方案意味著是示例性的，而非窮舉性的。而且，應理解，本文采用的措辭和術語是為了描述的目的，并且不應被認為是限制性的。
8.除非本文另有定義，否則結合本公開使用的科學和技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。進一步地，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括復數，并且復數術語應包括單數。前述技術和程序通常根據本領域眾所周知的常規方法、并且如在本說明書通篇引用和討論的各種一般和更具體的參考文獻中所述而實施。與本文所述的分析化學、合成有機化學以及藥用和藥物化學結合利用的命名及其實驗室程序和技術是本領域中眾所周知和常用的那些。標準技術用于化學合成和化學分析。
9.本說明書中提及的所有專利、公開的專利申請和非專利出版物指示本公開所屬領域的技術人員的技術水平。在本技術的任何部分中引用的所有專利、公開的專利申請和非專利出版物在本文中明確地通過引用以其整體并入，其程度如同每個單獨的專利或出版物被具體和個別地指出通過引用并入一樣。
10.鑒于本公開，無需過度實驗即可制備和執行本文公開的所有組合物、試劑盒、設備和/或方法。盡管已經在具體實施方案的方面描述了所述組合物、試劑盒、設備和/或方法，但對于本領域技術人員將顯而易見的是，在不脫離本公開的構思、精神和范圍的情況下，可對所述組合物、試劑盒、設備和/或方法、以及在本文描述的方法的步驟或步驟順序中應用變化。認為對于本領域技術人員顯而易見的所有此類類似的取代和修改在如所附權利要求書限定的本公開的精神、范圍和構思內。
11.如根據本公開所利用，除非另有指示，否則以下術語應理解為具有以下含義：與權利要求和/或說明書中的術語“包括”結合使用時，術語“一個/種(a)”或“一個/種(an)”的使用可意味著“一個/種(one)”，但它也與“一個/種或多個/種”、“至少一個/種”和“一個/種或多于一個/種”的含義一致。因此，術語“一個/種(a)”、“一個/種(an)”和“該/所述(the)”包括復數指示物，除非上下文另有明確指示。因此，例如，對“一種化合物”的提及可指一種或多種化合物、兩種或更多種化合物、三種或更多種化合物、四種或更多種化合物或更大數目的化合物。術語“多個/種”是指“兩個/種或更多個/種”。
12.術語“至少一個/種”的使用將被理解為包括一個/種以及多于一個/種的任何數量，包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100個/種等。術語“至少一個/種”可延伸多至100或1000或更多個/種，這取決于它所附接的術語；此外，100/1000的數量不視為限制性的，因為更高的限值也可產生令人滿意的結果。此外，術語“x、y和z中的至少一個/種”的使用將被理解為包括單獨的x，單獨的y和單獨的z，以及x、y和z的任何組合。序數術語(即，“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的使用僅用于區分兩個或更多個事項的目的，并且不意味著暗示例如一個事項相對于另一事項的任何順序或次序或重要性、或任何添加次序。
13.在權利要求中使用術語“或”用于意指包括性的“和/或”，除非明確指出僅指替代方案或者除非替代方案是互相排斥的。例如，以下任一種都滿足條件“a或b”：a為真(或存在)且b為假(或不存在)，a為假(或不存在)且b為真(或存在)，并且a和b兩者均為真(或存在)。
14.如本文所用，對“一個實施方案(one embodiment)”、“一個實施方案(an embodiment)”、“一些實施方案”、“一個實例(one example)”、“例如”或“一個實例(an example)”的任何引用意指結合該實施方案描述的具體要素、特征、結構或特點包括在至少一個實施方案中。例如，說明書中各個地方出現的短語“在一些實施方案中”或“一個實例”不一定全部是指同一實施方案。此外，對一個或多個實施方案或實例的所有引用都應被解釋為對權利要求非限定性的。
15.在整個申請中，術語“約”用于指示，值包括用于測定該值的組合物/儀器/裝置、方法的誤差的固有變化，或研究受試者間存在的變化。例如，但非限定性地，當利用術語“約”時，指定值可以與列舉值相差正負20%，或15%，或12%，或11%，或10%，或9%，或8%，或7%，或6%，或5%，或4%，或3%，或2%，或1%，因為此類變化適用于執行公開的方法并由本領域普通技術人員所理解。
16.如在本說明書和一個或多個權利要求中所用，詞語“包含(comprising)”(和任何形式的包含，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和任何形式的包括，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和任何形式的含有，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包括性的或開放式的，并且不排除另外的未列舉的要素或方法步驟。
17.如本文所用的術語“或其組合”是指所述術語之前列出的事項的所有排列和組合。例如，“a、b、c或其組合”意欲包括以下中的至少一個：a、b、c、ab、ac、bc或abc，并且如果次序在特定上下文中是重要的，則也包括ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。繼續該實例，明確包括的是含有一個或多個事項或術語的重復的組合，例如bb、aaa、aab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等等。本領域技術人員將理解，除非從上下文可見，否則通常對任何組合中的事項或術語的數量沒有限制。
18.如本文所用，術語“實質上(substantially)”意味著隨后描述的事件或情況完全發生或者隨后描述的事件或情況在大范圍或程度上發生。例如，當與具體事件或情況相關時，術語“實質上”意味著隨后描述的事件或情況發生在至少80%的時間、或至少85%的時間、或至少90%的時間、或至少95%的時間。術語“實質上相鄰”可以意指兩個事項與彼此100%相鄰，或者兩個事項與彼此密切接近，但與彼此不是100%相鄰，或者兩個事項之一的一部分與另一事項不是100%相鄰，而是與另一事項密切接近。
19.如本文所用，短語“與
……
締合(associated with)”和“與
……
偶聯(coupled to)”包括兩個部分彼此直接締合/結合以及兩個部分彼此間接締合/結合二者。締合/偶聯的非限制性實例包括，例如，通過直接的鍵或通過間隔基團將一個部分與另一個部分共價結合，直接或借助與所述部分結合的特異性結合對成員將一個部分與另一個部分非共價結合，諸如通過將一個部分溶解在另一個部分中或通過合成而將一個部分摻入另一個部分，和將一個部分涂覆在另一個部分上。
20.術語“類似物”和“衍生物”在本文中可互換使用，并且是指如下的物質，其在其結構中包含與給定化合物相同的基本碳骨架和碳官能度，但也可以含有對其的一個或多個取代。如本文中所用，術語“取代”將被理解為是指用殘基r替換化合物上的至少一個取代基。在某些非限制性實施方案中，r可以包括h，羥基，硫醇，選自氟化物、氯化物、溴化物或碘化物的鹵化物，選自下列之一的c1-c4化合物：任選取代的直鏈、支鏈或環狀烷基，和直鏈支鏈或環狀烯基，其中任選的取代基選自一種或多種烯基烷基、炔基烷基、環烷基、環烯基烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜環烷基、任選取代的雜環烯基烷基、芳基環烷基和芳基雜環烷基，其中每個是任選取代的，其中所述任選的取代基選自下列中的一種或多種：烯基烷基、炔基烷基、環烷基、環烯基烷基、芳基烷基、烷基芳基、雜芳基烷基、雜環烷基、任選取代的雜環烯基烷基、芳基環烷基和芳基雜環烷基、苯基、氰基、羥基、烷基、芳基、環烷基、氰基、烷氧基、烷硫基、氨基、-nh(烷基)、-nh(環烷基)2、羧基和-c(o))-烷基。
21.如本文所用的術語“樣品”將被理解為包括可以根據本公開利用的任何類型的生物樣品。可利用的流體生物樣品的實例包括但不限于：全血或其任何部分(即，血漿或血清)、尿液、唾液、痰、腦脊液(csf)、皮膚、腸液、腹膜內液、囊液(cystic fluid)、汗液、間質液、細胞外液、淚液、粘液、膀胱洗液(bladder wash)、精液、糞便、胸膜液、鼻咽液、其組合
等。
22.術語“抗體”在本文中以最廣義使用，并且是指例如完整單克隆抗體和多克隆抗體，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，和其表現出結合分析物的期望生物活性的抗體片段及綴合物(諸如但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、fd、雙抗體、單鏈抗體和其它抗體片段及其綴合物，其保留完整抗體的可變區的至少一部分)，抗體替代蛋白或肽(即，工程改造的結合蛋白/肽)及其組合或衍生物。所述抗體可以是任何類型或類別(例如，igg、ige、igm、igd和iga)或亞類(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。
23.如本文所用的術語“loci
?”
是指商業使用的基于發光氧通道測定(loci
?
)技術的免疫測定技術。loci
?
先進化學發光測定描述于例如美國專利號5,340,716 (ullman等人)，其全部內容明確地通過引用并入本文。當前可用的loci
?
技術具有高靈敏度，并且使用幾種試劑。具體而言，loci
?
測定要求這些試劑中的兩種(被稱為“sensibead”和“chemibead”)通過其他特異性結合配偶體測定試劑以如下的方式保持，其中sensibead和chemibead彼此密切接近以實現信號。在暴露于特定波長的光后，sensibead釋放單線態氧，并且如果兩個珠粒密切接近，則單線態氧被轉移至chemibead；這引起化學反應，其導致所述chemibead發出光，所述光可以在不同波長處測量。
24.本公開的某些非限制性實施方案涉及用于血清學免疫測定的校準或質量控制試劑，所述血清學免疫測定用于檢測人類生物樣品中針對微生物的抗體。所述試劑包括三種組分：(a)基質；(b)抗-人免疫球蛋白(ig)抗體；和(c)針對微生物抗原的人抗體。在所述試劑中，所述抗-人ig抗體和人類抗-微生物抗體形成復合物。這些復合物的形成使能夠與微生物抗原的結合的抗體叉臂(prong)增加。換言之，每個抗-人ig抗體能夠結合兩個人類抗-微生物抗體(在其fc片段處)；這些兩個人類抗-微生物抗體存在于復合物中，當其未復合時各自分出兩個叉臂，與抗-人ig抗體復合后成為四叉臂或多叉臂抗體。因此，這些復合物在抗原橋接免疫測定中更有效地與微生物抗原交聯。
25.可利用任何本領域已知的或本文中以其它方式考慮的校準或質量控制試劑基質，只要由此產生的試劑能夠根據本公開發揮功能。在某些非限制性實施方案中，所述基質可具有與將在免疫測定中測量的樣品的制劑/組成/ph有些相似的制劑/組成/ph。然而，在某些非限制性實施方案中，可能期望避免使用未純化的血清或基于血漿的基質，因為在此類基質中存在的內源性免疫球蛋白可能干擾校準或質量控制試劑的其它組分，以及在校準或質量控制試劑中形成的復合物。
26.可以根據本公開利用的樣品的非限制性實例(和因此，在某些非限制性實施方案中，基于其的基質制劑)包括生物樣品諸如，但不限于，全血或其任何部分(即，血漿或血清)、尿液、唾液、痰、腦脊液(csf)、皮膚、腸液、腹膜內液、囊液、汗液、間質液、細胞外液、淚液、粘液、膀胱洗液、精液、糞便、胸膜液、鼻咽液及其組合。
27.在某些非限制性實施方案中，所述基質包含實質上耗盡人igg的人血清或血漿。在某些非限制性實施方案中，所述基質包含來自非人源的血清，諸如(但不限于)馬、牛、山羊等。
28.在其它非限制性實施方案中，所述基質包含基于水的系統，其不含其它組分(即，實質上沒有緩沖液或蛋白)。在其它非限制性實施方案中，所述基質包含單獨的或與一種或多種蛋白組合的基于緩沖液的系統。
29.可以根據本公開利用的緩沖液的非限制性實例包括磷酸鹽(諸如(但不限于)在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)溶液或dulbecco磷酸鹽水緩沖液中)、tris(諸如，但不限于，tris緩沖鹽水溶液)、bis-tris、硼酸鹽(諸如，但不限于，硼酸鹽緩沖鹽水溶液)、碳酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、aces、bes、dipso、hepes、heppso、mops、mopso、pipes、pipps、tapso、tes、生物緩沖液等，以及其任何組合。
30.可以根據本公開作為所述基質的部分利用的蛋白的非限制性實例包括白蛋白(諸如，但不限于，牛血清白蛋白(bsa))、酪蛋白、非人類免疫球蛋白、轉鐵蛋白等，以及其任何組合。
31.此外，如本領域所熟知的，所述基質可含有另外的組分。例如(但非限制性地)，所述基質可包含一種或多種防腐劑、一種或多種填充劑，和/或一種或多種聚合物。可以根據本公開利用的填充劑的非限制性實例包括乳糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘氨酸等，以及其任何組合。可以根據本公開利用的防腐劑的非限制性實例包括proclin
??
(rohm and haas, philadelphia, pa)、疊氮化鈉、硫柳汞、新霉素、克霉唑、兩性霉素b、mit、鏈霉素、omadine
??
(吡啶硫酮鈉；lonza, basel, switzerland)、cosmocil
??
cq (lonza, basel, switzerland)等，以及其任何組合。可以根據本公開利用的聚合物的非限制性實例包括聚乙二醇(peg)、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)等，以及其任何組合。
32.在具體(但非限制性的)實施方案中，所述基質包含在pbs中的牛血清白蛋白(bsa)。基質的一個非限制性的實例是在pbs中6%的無蛋白酶bsa，ph 7.4。
33.利用本公開的校準或質量控制試劑的血清學免疫測定可檢測針對任何期望檢測的微生物的抗原的人抗體。例如(但非限制性地)，被檢測的微生物可為細菌、病毒、原生動物、真菌等。
34.可以根據本公開檢測的細菌的非限制性實例包括不動桿菌屬(acinetobacter)、放線菌屬(actinomyces)、氣單胞菌屬(aeromonas)、聚合桿菌屬(aggregatibacter)、阿托波氏菌屬(atopobium)、芽孢桿菌屬(bacillus)、擬桿菌屬(bacteroides)、巴爾通氏體屬(bartonella)、雙歧桿菌屬(bifidobacterium)、疏螺旋體屬(borellia)、布魯氏菌屬(brucella)、彎曲桿菌屬(campylobacter)、衣原體屬(chlamydia)、嗜衣原體屬(chlamydophila)、梭菌屬(clostridium)、棒桿菌屬(corynebacterium)、考克斯氏體屬(coxiella)、艾肯氏菌屬(eikenella)、腸桿菌屬(enterobacter)、腸球菌屬(enterococcus)、埃希氏菌屬(escherichia)、真桿菌屬(eubacterium)、弗朗西絲氏菌屬(francisella)、梭桿菌屬(fusobacterium)、加德納氏菌屬(gardnerella)、嗜血菌屬(haemophilis)、螺桿菌屬(helicobacter)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、乳桿菌屬(lactobacillus)、李斯特氏菌屬(listeria)、動彎桿菌屬(mobiluncus)、莫拉氏菌屬(moraxella)、分枝桿菌屬(mycobacterium)、支原體屬(mycoplasma)、奈瑟氏球菌屬(neisseria)、微單胞菌屬(parviomonas)、巴斯德氏菌屬(pasteurella)、卟啉單胞菌屬(porphyromonas)、普雷沃氏菌屬(prevotella)、丙酸桿菌屬(propionibacterium)、變形菌屬(proteus)、假單胞菌屬(pseudomonas)、立克次氏體屬(rickettsia)、沙門氏菌屬(salmonella)、沙雷氏菌屬(serratia)、志賀氏菌屬(shigella)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)、坦納菌屬(tannerella)、密螺旋體屬(treponema)、弧菌屬(vibrio)以及耶爾森氏菌屬(yersinia)物種等。
35.可以根據本公開檢測的病毒的非限制性實例包括腺病毒、星狀病毒、冠狀病毒、柯薩奇病毒、巨細胞病毒(cmv)、埃可病毒、腦炎病毒、腸道病毒、愛潑斯坦-巴爾二氏病毒(ebv)、紅細胞病毒、漢坦病毒、肝炎病毒、皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒(hiv)、流感病毒、諾如病毒、乳頭瘤病毒、副流感病毒、副粘病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、鼻病毒、輪狀病毒、風疹病毒、麻疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、西尼羅病毒和寨卡病毒等。
36.可以根據本公開檢測的原生動物的非限制性實例包括蛔蟲、巴貝斯蟲、隱孢子蟲(cryptosporidium)、環孢子蟲(cyclospora)、內阿米巴蟲(entamoeba)、蟯蟲(enterobius)、賈第蟲(giardia)、膜殼絳蟲(hymenolepis)、板口線蟲(necator)、瘧原蟲(plasmodium)、類圓線蟲(strongyloides)、絳蟲(taenia)、弓形蟲(toxoplasma)和毛滴蟲(trichomonas)物種等。
37.可以根據本公開檢測的真菌的非限制性實例包括酵母、霉菌等，包括(但不限于)假絲酵母屬(candida)、隱球菌屬(cryptococcus)、表皮癬菌屬(epidermophyton)、馬拉菌屬(malassezia)、小孢子菌屬(microsporum)、毛癬菌屬(trichophyton)物種等。
38.在具體(但非限制性)實施方案中，通過免疫測定檢測的微生物是嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2 (sars-cov-2)、hiv、乙型肝炎總核心、愛潑斯坦-巴爾二氏病毒、皰疹病毒(hsv)、cmv、風疹病毒、幽門螺桿菌(h. pylori)或剛地弓形蟲(toxoplasma gondii)。
39.所述抗原可為來自待檢測的微生物的任何抗原。可用于檢測以上列出的每種微生物的的抗原是本領域所熟知的并廣泛可得的。此外，可以根據本公開利用的抗原的選擇是在本領域普通技術人員的能力范圍內。因此，認為沒有必要對其進一步公開。
40.針對這些抗原的人抗體同樣是廣泛已知的并商業可得的。此外，抗體制造商生產出可以根據本公開利用的數千種人類抗-微生物抗體的極其龐大的陣列；參見例如(但不限于)，制造商的抗體目錄，諸如roche (basel, switzerland)、genentech (san francisco, ca)、aridis pharmaceuticals llc (san jose, ca)、medimmune、llc (gaithersberg, md)、xbiotech (austin, tx)、rockland immunochemicals、inc. (pottstown, pa)、usbiological life sciences (swampscott, ma)、santa cruz biotechnology、inc. (dallas, tx)、jackson immuno research labs、inc. (west grove, pa)、thermo fisher scientific (waltham, ma)，和sigma-aldrich corp. (st. louis, mo)。然而，該列表僅為生產人類抗-微生物抗體的抗體制造商的一個小抽樣，并且可根據本公開利用的人類抗-微生物抗體還有許多另外的商業來源。因此，本領域普通技術人員將能夠清楚且毫無疑義地鑒別和選擇可以根據本公開利用的各種人類抗-微生物抗體，并因此認為沒有必要對所述人類抗-微生物抗體或其特性進一步描述。
41.在具體(但非限制性)實施方案中，所述人類抗-微生物抗體是人源化的抗-sars-cov-2抗體，諸如(但不限于)獲自genscript (piscataway, nj)的s1抗體的人源化抗-rbd，并且人抗體所針對的抗原是sars-cov-2的抗原，諸如(但不限于) cov刺突蛋白s1亞基的受體結合結構域(rbd)的至少一部分。
42.所述抗-人ig抗體可特異性結合任何本領域已知或本文以其它方式考慮的人類免疫球蛋白分子的任何部分。例如(但非限制性地)，所述抗體可針對人igg、ige、igm、igd和/或iga，和/或其任何部分(諸如，但不限于，抗-人γ鏈、抗-人h+l、抗-人輕鏈等)。抗-人ig抗
體是本領域所熟知的，是廣泛商業可得的，并已有廣泛研究。例如(但非限制性地)，抗-人igg單克隆和/或多克隆抗體的一些商業來源包括rockland immunochemicals、inc. (pottstown, pa)、usbiological life sciences (swampscott, ma)、santa cruz biotechnology、inc. (dallas, tx)、jackson immuno research labs、inc. (west grove, pa)、thermo fisher scientific (waltham, ma)和sigma-aldrich corp. (st. louis, mo)。然而，這個列表不包括全部，并可以根據本公開利用的抗-人ig抗體還有許多另外的商業來源。因此，本領域普通技術人員將能夠清楚且毫無疑義地鑒別和選擇可以根據本公開利用的各種抗-人ig抗體，并因此認為沒有必要對所述抗-人ig抗體或其特性進一步描述。
43.每種所述抗-人免疫球蛋白(ig)抗體和所述針對微生物抗原的人抗體可以以任何濃度存在于所述校準或質量控制試劑中，其中所述濃度允許如本文所描述形成復合物，并允許所述試劑根據本公開發揮功能。在某些非限制性實施方案中，每種所述抗-人免疫球蛋白(ig)抗體和所述針對微生物抗原的人抗體以如下濃度存在于所述試劑中，所述濃度獨立地選自于約0.001 wt%、約0.002 wt%、約0.003 wt%、約0.004 wt%、約0.005 wt%、約0.006 wt%、約0.007 wt%、約0.008 wt%、約0.009 wt%、約0.01 wt%、約0.02 wt%、約0.03 wt%、約0.04 wt%、約0.05 wt%、約0.06 wt%、約0.07 wt%、約0.08 wt%、約0.09 wt%、約0.1 wt%、約0.2 wt%、約0.3 wt%、約0.4 wt%、約0.5 wt%、約0.6 wt%、約0.7 wt%、約0.8 wt%、約0.9 wt%、約1.0 wt%、約1.1 wt%、約1.2 wt%、約1.3 wt%、約1.4 wt%、約1.5 wt%、約1.6 wt%、約1.7 wt%、約1.8 wt%、約1.9 wt%、約2 wt%、約3 wt%、約4 wt%、約5 wt%、約6 wt%、約7 wt%、約8 wt%、約9 wt%、約10 wt%，或更高，或由兩個上述值形成的范圍(即，從約0.001 wt%至約10 wt%的范圍、從約0.002 wt%至約1 wt%的范圍、從約0.001 wt%至約0.5 wt%的范圍等)，或落入兩個上述值的范圍的任何值(即，約0.27 wt%)。
44.同樣，所述針對微生物抗原的人抗體和所述抗-人免疫球蛋白(ig)抗體可以以彼此之間的任何比例存在于所述試劑中，所述比例允許所述試劑根據本公開發揮功能。例如(但非限制性地)，所述抗-人ig抗體和所述人類抗-微生物抗體可以如下范圍內的比例存在：從約1:1、約1:1.5、約1:2、約1:2.5、約1:3、約1:3.5、約1:4、約1:4.5、約1:5、約1:5.5、約1:6、約1:6.5、約1:7、約1:7.5、約1:8、約1:8.5、約1:9、約1:9.5、約1:10、約2:3、約2:5、約2:7、約2:9、約2:11、約2:13、約2:15、約2:17、約2:19，或更高，或由兩個上述值形成的范圍(即，從約1:1 至約1:10的范圍、從約1:2至約2:3的范圍等)，或任何落入兩個上述值的范圍的值(即，約1:1.7、約1:2.4等)。當期望時，可以優化對每種試劑的比例，以實現穩定性和信號之間的良好平衡。根據所使用的具體試劑，所述比例也可寬泛地變化。
45.類似地，所述基質中存在的任何額外的組分(即，一種或多種蛋白質、防腐劑、填充劑和/或聚合物)可以各自以任何濃度存在，所述濃度允許由其形成的試劑根據本公開發揮功能。例如(但非限制性地)，每種額外的組分以獨立地選自以下的濃度存在：約0.001 wt%、約0.002 wt%、約0.003 wt%、約0.004 wt%、約0.005 wt%、約0.006 wt%、約0.007 wt%、約0.008 wt%、約0.009 wt%、約0.01 wt%、約0.02 wt%、約0.03 wt%、約0.04 wt%、約0.05 wt%、約0.06 wt%、約0.07 wt%、約0.08 wt%、約0.09 wt%、約0.1 wt%、約0.2 wt%、約0.3 wt%、約0.4 wt%、約0.5 wt%、約0.6 wt%、約0.7 wt%、約0.8 wt%、約0.9 wt%、約1.0 wt%、約1.1 wt%、約1.2 wt%、約1.3 wt%、約1.4 wt%、約1.5 wt%、約1.6 wt%、約1.7 wt%、約1.8 wt%、約
1.9 wt%、約2 wt%、約3 wt%、約4 wt%、約5 wt%、約6 wt%、約7 wt%、約8 wt%、約9 wt%、約10 wt%、約15 wt%、約20 wt%、約25 wt%、約30 wt%、約35 wt%、約40 wt%、約45 wt%、約50 wt%、約55 wt%、約60 wt%、約65 wt%、約70 wt%、約75 wt%、約80 wt%、約85 wt%、約90 wt%、約95 wt%，或更高，或由兩個上述值形成的范圍(即，從約0.001 wt%至約20 wt%的范圍、從約0.1 wt%至約5 wt%的范圍、從約2 wt%至約20 wt%的范圍等)，或任何落入兩個上述值的范圍的值(即，約13 wt%、約23 wt%等)。
46.本公開的所述校準或質量控制試劑在所期望的時間段內在所期望的溫度下是實質上穩定的。例如(但非限制性地)，所述校準或質量控制試劑可實質上穩定至少約7天、至少約14天、至少約28天、至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約12個月、至少約13個月、至少約14個月、至少約15個月、至少約16個月、至少約17個月、至少約18個月、至少約2年、至少約3年或更長。此外，所述校準試劑可儲存在室溫(即，從約18℃至約20℃的范圍)或儲存在冷藏或冷凍條件下。當所述校準或質量控制試劑中存在防腐劑時，可基于期望的具體儲存條件和儲存期選擇利用的防腐劑。
47.本公開的所述校準或質量控制試劑可以以任何允許所述試劑根據本公開發揮功能的形式提供。例如，但非限制性地，所述試劑可以以液體形式提供。或者，所述試劑可經過冷凍-干燥或凍干，并以干燥試劑的形式提供。
48.本公開的所述校準或質量控制試劑可用于定性或定量的測量。
49.本公開的某些非限制性實施方案涉及試劑盒，其含有本文所描述的或以其它方式考慮的任何校準或質量控制試劑。
50.在某些非限制性實施方案中，所述試劑盒可進一步包括至少一種用于血清學免疫測定的試劑。例如，但非限制性地，所述試劑盒可進一步包括至少一種試劑，其含有人類抗-微生物抗體所結合的微生物抗原。
51.在具體(但非限制性)實施方案中，所述微生物是sars-cov-2，并且所述抗原是sars-cov-2刺突s1的rbd。該抗原可從本領域已知的任何來源獲得。例如(但非限制性地)，該具體抗原是商業可得的，來自genscript (piscataway, nj)、meridian life sciences、inc. (memphis, tn)、sino biological us inc. (wayne, pa)、acro biosystems (newark, de)、biorbyt、llc (st. louis, mo)、icosagen、as (san francisco, ca)和bios pacific inc. (emeryville, ca)。
52.在具體(但非限制性)實施方案中，所述試劑盒可進一步包括一種或多種試劑，用于進行具體測定形式的免疫測定，諸如(但不限于)loci
?
形式。例如(但非限制性地)，所述試劑盒可進一步包括一種包含單線態氧可激活的化學發光化合物(諸如(但不限于) chemibead)的組合物和一種包含敏化劑(諸如(但不限于) sensibead)的組合物，其各自具有與其直接或間接附接的微生物抗原(或者，所述試劑盒含有試劑，其用于在所述免疫測定之前或期間，將所述組合物直接或間接附接到微生物抗原)。
53.在具體(但非限制性)實施方案中，所述試劑盒可進一步包括：(i) 組合物，其包含：單線態氧可激活的化學發光化合物，其具有與其直接或間接結合的由所述試劑的人類抗-微生物抗體特異性結合的抗原，和由激活的化學發光化合物激發的熒光分子；和(ii) 組合物，其包含敏化劑，所述敏化劑能夠在其激發狀態產生單線態氧，并且具有與其直接或
間接結合的由所述試劑的人類抗-微生物抗體特異性結合的抗原。在另一具體(但非限制性)實施方案中，所述試劑盒可進一步包括：(i) 組合物，其包含：單線態氧可激活的化學發光化合物，其具有與其直接或間接結合的由所述試劑的人類抗-微生物抗體特異性結合的抗原，和由激活的化學發光化合物激發的熒光分子；(ii) 組合物，其包含敏化劑，所述敏化劑能夠在其激發狀態產生單線態氧，并且具有與其直接或間接結合的生物素-特異性結合配偶體；和(iii)與所述試劑的人類抗-微生物抗體特異性結合的抗原，其中所述抗原是生物素化的。
54.化學發光化合物(化學發光劑)是化學可激活且作為這種激活的結果而發射特定波長的光的化合物。通過舉例說明而非限制性地，化學發光劑的實例包括例如：能夠與單線態氧或過氧化物反應以形成可以分解成酮類或羧酸衍生物的氫過氧化物或二氧環丁烷(dioxetane)的烯烴類；可以通過光的作用分解的穩定二氧環丁烷；可以與單線態氧反應以形成二酮類的炔烴類；可以形成偶氮化合物或偶氮羰基化合物的腙類或酰肼類，諸如(但不限于)魯米諾；和可以形成內過氧化物的芳族化合物。作為激活反應的結果，化學發光劑直接或間接引起發光。
55.在某些實施方案中，單線態氧可激活的化學發光化合物可以是這樣的物質，其經歷與單線態氧的化學反應以形成亞穩態中間物質，所述亞穩態中間物質可分解，并同時或隨后發射光。包含化學發光化合物的組合物可通過激活的化學發光化合物直接激發；或者，所述組合物可進一步包含至少一種熒光分子，所述熒光分子由激活的化學發光化合物激發。
56.敏化劑是生成用于激活化學發光化合物的反應性中間產物(諸如例如單線態氧)的分子，通常是化合物。在一些非限制性實施方案中，所述敏化劑是光敏劑。通過實例而非限制性地，可以化學激活(通過，例如酶和金屬鹽)的其它敏化劑包括，借助外部光源的激活或不借助外部光源的激活而可以產生單線態氧的其它物質和組合物。例如，某些化合物已經顯示催化過氧化氫轉化為單線態氧和水。其它敏化劑物質和組合物的非限制性實例包括堿土金屬ca、sr和ba的氧化物；d0構型中的3a、4a、sa和6a族的元素的衍生物；錒系元素和鑭系元素的氧化物；和氧化劑cio-、bro-、au
3+
、io
3-和io
4-；和具體而言，鉬酸根、過氧鉬酸根、鎢酸根和過氧鎢酸根離子，和乙腈。下列參考文獻(其在此明確地以其整體通過引用并入)提供了關于也落入本公開的范圍內的敏化劑物質和組合物的進一步公開內容：aubry, j. am. chem. soc., 107:5844-5849 (1985)；aubry, j. org. chem., 54:726-728 (1989)；b
?
hme和brauer, inorg. chem., 31:3468-3471 (1992)；niu和foote, inorg. chem., 31:3472-3476 (1992)；nardello等人, inorg. chem., 34:4950-4957 (1995)；aubry和bouttemy, j. am. chem. soc., 119:5286-5294 (1997)；和almeida等人, anal. chim. acta, 482:99-104 (2003)；其各自的完整內容在此明確地通過引用并入本文。
57.光敏劑的范圍內還包括不是真的敏化劑、但在熱、光、電離輻射或化學激活的激發下將釋放單線態氧分子的化合物。此類化合物的成員包括例如(但非限制性地)，內過氧化物，諸如1,4-二羧基乙基-1,4-萘內過氧化物；9,10-二苯基蒽-9,10-內過氧化物；和5,6,11,12-四苯基萘5,12-內過氧化物。加熱這些化合物或這些化合物直接吸收光而釋放單線態氧。
58.光敏劑是用于通過例如用光激發生成單線態氧而激活光活性化合物的敏化劑。光
敏劑是光可激活的，且包括例如染料和芳族化合物，并且通常是由共價鍵合的原子構成的化合物，通常具有多個共軛的雙鍵或三鍵。所述化合物應當吸收在約200 nm至約1,100 nm的波長范圍內、諸如(但不限于)約300 nm至約1,000 nm的范圍內或約450 nm至950 nm的范圍內的光，在激發波長下，其最大吸光度時的消光系數大于500 m-1 cm-1
，或大于5,000 m-1 cm-1
，或大于50,000 m-1 cm-1
。光敏劑應當是相對光穩定的，且可以不與單線態氧有效反應。通過舉例說明而非限制性地，光敏劑的實例包括：丙酮；二苯甲酮；9-噻噸酮；伊紅；9,10-二溴蒽；亞甲基藍；金屬卟啉類諸如(但不限于)血卟啉；酞菁；葉綠素；玫瑰紅；和巴克敏斯特富勒烯；以及這些化合物的衍生物。
59.可以根據本公開利用的化學發光化合物和光敏劑的具體、非限制性實例記載于美國專利號5,340,716 (ullman，等人)，其完整內容在此明確地通過引用并入本文。
60.可以根據本公開內容利用本領域中已知或本文以其它方式考慮的任何生物素-特異性結合配偶體。在某些非限制性實施方案中，所述生物素-特異性結合配偶體是針對生物素的抗體。在其它非限制性實施方案中，所述生物素-特異性結合配偶體是抗生物素蛋白或其類似物。
61.根據本公開，可以利用本領域已知或本文以其它方式考慮的任何抗生物素蛋白類似物，只要抗生物素蛋白或抗生物素蛋白類似物：(1)能夠與敏化劑締合；(2)能夠結合生物素化的分析物-特異性結合配偶體；和(3)能夠結合樣品中可能存在的生物素。可以根據本公開利用的抗生物素蛋白類似物的非限制性實例包括kang等人(j drug target (1995) 3:159-65)(其全部內容明確地通過引用并入本文)中公開的那些。抗生物素蛋白類似物的具體非限制性實例包括抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、traptavidin、中性抗生物素蛋白、neutralite抗生物素蛋白、neutravidin、lite-抗生物素蛋白、琥珀酰化抗生物素蛋白、其他形式的修飾或基因工程改造的抗生物素蛋白，上述任一種的酯、鹽和/或衍生物等。
62.能夠被激活的化學發光化合物激發并以特定的、可檢測的波長發光的本領域中已知的任何熒光分子可以根據本公開用作(a)和(b)(以及(e)，如果存在的話)的熒光分子，只要由每個熒光分子產生的信號都可與由利用的其它熒光分子產生的信號不同地檢測到。也就是說，(a)的熒光分子必須發射與(b)的熒光分子發射光的波長充分不同的波長的光，使得當同時檢測時兩個信號可以與彼此區分。在一個具體(但非限制性)實例中，根據本公開利用的每種熒光分子獨立地選自鋱、鈾、釤、銪、釓和鏑。例如(但非限制性地)，鋱發射約545 nm的波長的光，鈾發射約612 nm的波長的光，且釤發射約645 nm的波長的光。
63.可以以任何形式提供存在于試劑盒的測定組分/試劑，所述形式允許它們根據本公開發揮功能。例如但非限制性地，每種試劑可以以液體形式提供并且以散裝和/或單一等分試樣形式設置在試劑盒內。或者，在一個具體(但非限制性)實施方案中，一種或多種試劑可以以單一等分試樣凍干試劑的形式設置于試劑盒中。微流體裝置中干燥試劑的使用詳細描述于美國專利號9,244,085 (samproni)，其完整內容在此明確地通過引用并入本文。
64.除上文詳細描述的測定組分/試劑以外，所述試劑盒可以進一步含有用于進行本文描述或以其它方式考慮的任何具體測定的其它試劑。這些額外的試劑的性質將取決于具體測定形式，并且其鑒定完全在本領域普通技術人員的技能范圍內；因此，認為沒有必要對其進一步描述。此外，試劑盒中存在的組分/試劑可以各自在分開的容器/隔室中，或者各種組分/試劑可以被組合于一個或多個容器/隔室中，這取決于所述組分/試劑的交叉反應性
和穩定性。此外，所述試劑盒可包括在其中設置組分/試劑的微流體裝置。
65.在所述試劑盒中的各種組分/試劑的相對量可以廣泛變化，以提供組分/試劑的濃度，所述組分/試劑的濃度實質上優化需要在測定方法期間發生的反應，并且進一步實質上優化測定的靈敏度。在適當情況下，在所述試劑盒中的一種或多種組分/試劑可以作為干燥粉末提供，諸如凍干粉末，并且所述試劑盒可進一步包括用于溶解干燥試劑的賦形劑；以這種方式，可以從這些組分獲得具有用于進行根據本公開的方法或測定的適當濃度的試劑溶液。在所述試劑盒中可以包括的其它試劑的非限制性實例包括洗滌溶液、稀釋溶液、賦形劑、干擾溶液、陽性對照、陰性對照等。此外，所述試劑盒可進一步包括解釋如何使用所述試劑盒的一組書面說明。這種性質的試劑盒可用于本文描述或以其它方式考慮的任何方法。
66.本公開的某些非限制性實施方案涉及微流體裝置，其含有本文描述的或以其它方式考慮的任何校準或質量控制試劑。例如(但非限制性地)，本公開的某些另外的非限制性實施方案涉及微流體裝置，其包括上文所述的任何試劑盒的組分。
67.具體而言，某些非限制性實施方案包括微流體裝置，其用于經由本文描述或以其它方式考慮的血清學免疫測定檢測樣品中針對微生物的抗體。所述微流體裝置包括：(i) 通過其施加樣品的入口通道；和(ii) 至少一個能夠與所述入口通道流體連通的第一隔室。(ii)的隔室含有單獨或與本文描述或以其它方式考慮的一種或多種其它試劑(諸如，但不限于，用于血清學免疫測定的一種或多種試劑)組合的本文描述或以其它方式考慮的任何校準或質量控制試劑。例如(但非限制性地)，所述一種或多種試劑可包括上文所述或本文以其它方式考慮的loci
?
免疫測定試劑。
68.在某些非限制性實施方案中，(ii)的所有要素(以及如上文所述的任何額外的要素)存在于同一隔室中。在可替代的非限制性實施方案中，所述要素在兩個或更多個隔室之間分開。
69.所述微流體裝置可提供隔室的任何排列和各種組分在這之間的分布，其允許所述裝置根據本公開發揮功能。
70.可以密封微流體裝置的任何隔室，以在實質上氣密的環境中維持其中設置的試劑，直至使用它們；例如，可以密封含有凍干試劑的隔室以防止試劑任何無意的重構。入口通道和一個隔室，以及兩個隔室可以被描述為“能夠與彼此流體連通”；該短語指示所述的每個隔室仍可以被密封，但在刺穿在其中或在其之間形成的密封后，兩個隔室能夠在其之間具有流體流動。
71.本公開的微流體裝置可以提供有本領域中已知的或本文以其它方式考慮的任何其他期望特征。例如但非限制性地，本公開的微流體裝置可以進一步包括讀取室；所述讀取室可以是含有上文所述的試劑的任何隔室，或者所述讀取室可以與所述隔室流體連通。所述微流體裝置可以進一步包括一個或多個額外的隔室，其含有其它溶液，諸如(但不限于)洗滌溶液、稀釋溶液、賦形劑、干擾溶液、陽性對照、陰性對照等。這些額外隔室可以與其它隔室中的一個或多個流體連通。例如，所述微流體裝置可以進一步包括一個或多個含有洗滌溶液的隔室，并且這些隔室能夠與所述裝置的任何其它隔室流體連通。在另一個實例中，所述微流體裝置可以進一步包括一個或多個含有用于溶解一種或多種干燥試劑的賦形劑的隔室，并且所述隔室可能夠與所述裝置的任何其它隔室流體連通。在又一個進一步實例中，所述微流體裝置可以包括一個或多個含有稀釋溶液的隔室，并且所述隔室能夠與所述
裝置的任何其它隔室流體連通。
72.本公開的某些非限制性實施方案涉及生產任何校準或質量控制試劑的方法，所述校準或質量控制試劑用于人生物樣品中針對微生物的抗體的血清學免疫測定，如本文所描述的或以其它方式考慮的。在所述方法中，針對微生物抗原的人抗體在基質中與抗-人ig抗體組合，并在抗-人ig抗體與一種或多種針對微生物抗原的人抗體之間形成復合物的條件下孵育。
73.所述孵育步驟可在任何溫度下進行并持續任何時間段，其允許形成本文所描述的一種或多種復合物。例如，但不限于，所述孵育步驟可以在從約10℃至約50℃的范圍(諸如，但不限于，從約18℃至約40℃的范圍，并且具體而言(但不限于)，約37℃)內的溫度下進行，并持續如下的時間段：約30秒、約60秒、約2分鐘、約3分鐘、約4分鐘、約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約25分鐘、約30分鐘、約35分鐘、約40分鐘、約45分鐘、約50分鐘、約55分鐘、約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約12小時、約18小時、約24小時或更長，以及或由任何兩個上述值形成的范圍(即，從約1分鐘至約5小時的范圍、從約30分鐘至約2小時的范圍等)，或任何落入兩個上述值之間的值(即，約53分鐘、約15小時等)。
74.此外，產生任何校準或質量控制試劑的方法可含有一個或多個額外的步驟，以形成本文所描述的試劑。
75.本公開的某些非限制性實施方案涉及校準用于人生物樣品中針對微生物的抗體的血清學免疫測定的方法。在所述方法中，使用本文所描述的或以其它方式考慮的任何校準或質量控制試劑進行免疫測定。
76.可由本公開的免疫測定來檢測能夠經由本文所描述的或以其它方式考慮的測定形式檢測的任何人類抗-微生物抗體。在具體(但非限制性)實施方案中，所述抗體是針對sars-covid2病毒的抗-病毒抗原抗體。
77.在一些非限制性測定實施方案中，利用信號產生系統(sps)成員，其包括敏化劑，諸如例如光敏劑，和化學發光-熒光分子組合物，并且其各自具有與其直接或間接附接的微生物抗原(或能夠在免疫測定期間使抗原與其直接或間接附接)；在這些測定實施方案中，所述敏化劑的激活導致激活化學發光組合物的產物，由此生成可檢測信號，所述可檢測信號與所檢測的結合的人類抗-微生物抗體的量相關。可作為本公開基礎的測定平臺的一個示例性(但非限制性)實施方案是發光氧通道測定(loci
?
; siemens healthcare diagnostics inc., tarrytown, ny)。loci
?
測定描述于例如美國專利號5,340,716 (ullman等人)，其全部內容明確地通過引用并入本文。
78.在具體(但非限制性)測定實施方案中，通過將所述校準或質量控制試劑與用于loci
?
形式的兩種或多種試劑孵育來進行所述測定。例如(但非限制性地)，所述校準或質量控制試劑可與如下一起孵育：單線態氧可激活的化學發光化合物(諸如(但不限于) chemibead)和包含敏化劑(諸如(但不限于) sensibead)的組合物，其各自具有與其直接或間接結合的微生物抗原。在一個具體(但非限制性)的實施方案中，將所述校準或質量控制試劑同時地或部分或全部依次地與以下組合：(i) 組合物，其包含單線態氧可激活的化學發光化合物，其具有與其直接或間接結合的由所述試劑的人類抗-微生物抗體特異性結合的抗原，和由激活的化學發光化合物激發的熒光分子；和(ii) 組合物，其包含敏化劑，所述
敏化劑能夠在其激發狀態產生單線態氧，并且具有與其直接或間接結合的由與所述試劑的人類抗-微生物抗體特異性結合的抗原。在另一具體(但非限制性)的實施方案中，所述校準或質量控制試劑同時地或部分或全部依次地與以下組合：(i) 組合物，其包含單線態氧可激活的化學發光化合物，其具有與其直接或間接結合的由所述試劑的人類抗-微生物抗體特異性結合的抗原，和由激活的化學發光化合物激發的熒光分子；(ii) 組合物，其包含敏化劑，所述敏化劑能夠在其激發狀態產生單線態氧，并且具有與其直接或間接結合的生物素-特異性結合配偶體；和(iii) 與所述試劑的人類抗-微生物抗體特異性結合的生物素化的抗原。
79.在第二步驟中，將所述組分一起孵育以允許含有化學發光化合物的組合物和含有敏化劑的組合物與存在于所述校準或質量控制試劑的復合物中的人類抗-微生物抗體結合，由此導致形成復合物/聚集物，其中使敏化劑與化學發光化合物密切接近。
80.在第三步驟中，激活所述敏化劑以生成單線態氧，其中存在于復合物/聚集物中的敏化劑的激活導致存在于每個復合物/聚集物中在的化學發光化合物的激活。
81.在第四步驟中，通過測量由所述熒光分子發射的光的量來測定由在復合物/聚集物中激活的化學發光化合物生成的化學發光的量，以測定在所述校準或質量控制試劑中人類抗-微生物抗體的量。
82.在本公開的方法中可以利用上文詳細描述或本文以其他方式考慮的任何微生物抗原、單線態氧可激活的化學發光化合物、敏化劑、熒光分子和生物素或其類似物。
83.例如，在某些具體(但非限制性)實施方案中，所述單線態氧可激活的化學發光化合物是這樣的物質，其經歷與單線態氧的化學反應以形成亞穩態中間物質，所述亞穩態中間物質可以分解并同時或隨后發射光。
84.在具體(但非限制性)實施方案中，所述敏化劑是光敏劑，并且在步驟(3)中的敏化劑的激活包括用光照射(諸如，但不限于，在約680 nm處照射)。
85.如上所提及，組合(同時或依次)提供所述方法的各種組分。當依次添加所述方法的各種組分時，可以改變組分的添加次序；本領域普通技術人員可確定向測定添加不同組分的具體期望次序。最簡單的添加次序當然是同時添加所有物質，并測定由其產生的信號。或者，可以依次組合每種組分，或組分的組。在某些實施方案中，可以在一次或多次添加之后包括孵育步驟。
86.盡管本公開的具體實施方案被描述為具有loci
?
測定形式，但應理解，本公開還涉及能夠檢測針對微生物抗原的人抗體的任何其它免疫測定形式(和試劑盒、微流體裝置，及其實施方法)。因此，該具體測定形式的公開是僅出于舉例的目的，并且不應該被解釋是本公開的限制。
實施例
87.下文提供了實施例。然而，應理解本公開的應用不限于本文公開的具體實驗、結果和實驗室程序。相反，所述實施例僅作為各種實施方案之一提供，并且僅意在是示例性的，而非窮舉性的。
88.在該實施例中，抗-人igg抗體用于復合校準物基礎基質中的抗-病毒抗原(avag)抗體。復合的avag抗體(其在未復合時分出兩個叉臂)，與抗-人igg抗體復合后成為四叉臂
或多叉臂抗體。此類復合物(其含有兩個或更多與抗-人ig抗體復合的avag抗體)在抗原橋接測定中能夠更有效地交聯病毒抗原。
89.例如，如圖1中所示，在cv2t loci
?
測定形式中，僅含有avag抗體的校準物以1:1的比例與chemibead和sensibead結合。具體地，將用熒光素標記的sars-cov-2刺突蛋白s1亞基的受體結合結構域(rbd)預制的抗-fitc chemibead和鏈霉抗生物素蛋白包被的與生物素化的s1的rbd結合的sensibead以及含有avag抗體的校準物混合。為了生成信號，avag抗體的一個叉臂必須結合chemibead，并且同一avag抗體的另一叉臂必須結合sensibead。chemibead和sensibead與校準物孵育后，混合物在680 nm處激發，其造成sensibead釋放單線態氧。chemibead和sensibead的密切接近(通過與同一抗體結合)造成單線態氧被轉移至chemibead，并且這引起化學反應，其導致chemibead發出可在612 nm處測量的光。
90.相比之下，如圖2中所示，利用根據本公開產生的校準物，從而形成與抗-人igg抗體結合的avag抗體的復合物。存在于校準物中的這些復合物可含有與每個抗-人igg抗體結合的兩個avag抗體，從而提供了校準物內的試劑，其含有至少四個叉臂，其中每個叉臂都可與抗-病毒抗原結合(即，在所述cv2t測定的情況下，s1的rbd)。當該校準物與來自cv2t loci
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測定的chemibead和sensibead孵育時，含有四個叉臂的每個復合物可結合最多四個抗原，其各自存在于chemibead或sensibead上，并且由此允許形成含有兩個或更多chemibead和/或兩個或更多sensibead的聚集物。這些聚集物的形成極大地提高了在暴露于激發波長的時間下sensibead足夠密切接近chemibead的機會，并從而指數級提高了在暴露于激發波長后，由存在于聚集物中的各種chemibead發出的發射光。因此，本公開的校準試劑生成的信號可產生比圖1中利用的校準物生成的信號強(或多)約20至約80倍的信號。
91.校準物如下產生：由于人血清/血漿中豐富的內源性抗體，選擇bsa作為校準物基質(雖然也可使用不含人血清和血漿的其它材料/樣品)。以pbs (ph 7.4)緩沖液中的6%無蛋白酶bsa作為基礎基質，人源化嵌合抗-rbd ig抗體(genscript, piscataway, nj)與兩種不同的抗-人單克隆抗體之一混合：4h5 (siemens healthcare diagnostics, tarrytown, ny)和2f3 (thermo fisher scientific, waltham, ma)，其中，抗-人ig抗體與avag抗體比例為約1:2。在儲存前，該混合物在約37℃孵育至少一小時。
92.通過用人igg免疫小鼠生成單克隆抗體4h5，并且這種單克隆抗體特異性結合igg重鏈的恒定結構域。為了生產，使雜交瘤細胞系在細胞培養物中生長，并且使用蛋白a親和譜法純化培養上清液。這個單克隆抗體已顯示出在與人igg排他結合方面的特異性。
93.在具體的樣品放大研究中，將以上產生的校準試劑用于含有圖1-2的chemibead和sensibead的cv2t loci
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測定中。如表1中所示，在該病毒抗原橋接免疫測定中，兩種校準試劑(其含有由多叉臂avag抗體形成的復合物)的每一種都使測定信號相比于校準試劑含有非復合的avag抗體時所見的測定信號增強約20至25倍。
94.表1
95.利用這種高水平的信號增強，極大減少了產生校準或質量控制試劑所需的抗-病毒抗原抗體的量，由此導致至少節約10至20倍的成本。
96.因此，根據本公開，已經提供了完全滿足上文所述的目的和優點的組合物、試劑盒和裝置以及其生產和使用方法。盡管已經結合上文闡述的具體附圖、實驗、結果和語言描述了本公開，但顯然，許多替代、修改和變化對于本領域技術人員將是顯而易見的。因此，意欲涵蓋落入本公開的精神和廣泛范圍內的所有此類替代、修改和變化。
技術特征：
1.一種校準或質量控制試劑，其用于檢測人生物樣品中針對微生物的抗體的血清學免疫測定，所述試劑包含：(a) 基質；(b) 抗-人免疫球蛋白(ig)抗體；和(c) 針對所述微生物的抗原的人抗體；和其中在所述試劑中形成(b)和(c)的復合物。2.權利要求1的校準或質量控制試劑，其中所述基質包含在pbs中的bsa。3.權利要求1的校準或質量控制試劑，其中所述基質包含至少一種額外的組分，所述組分選自聚合物、防腐劑、填充劑，及其組合。4.權利要求1的校準或質量控制試劑，其中所述微生物是病毒。5.權利要求4的校準或質量控制試劑，其中所述病毒是嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2 (sars-cov-2)。6.權利要求5的校準或質量控制試劑，其中(c)的抗體針對的sars-cov-2的抗原是cov刺突蛋白的s1亞基的受體結合結構域(rbd)的至少一部分。7.權利要求1的校準或質量控制試劑，其中(b)和(c)以從約1:1至約1:10的范圍內的比例存在。8.權利要求1的校準或質量控制試劑，其中(b)以從約0.01 wt%至約10 wt%的范圍內的濃度存在于所述試劑中。9.權利要求1的校準或質量控制試劑，其中(c)以從約0.01 wt%至約10 wt%的范圍內的濃度存在于所述試劑中。10.試劑盒，其包括：至少一種權利要求1的試劑。11.權利要求10的試劑盒，其進一步包括至少一種用于所述血清學免疫測定的試劑。12.權利要求10的試劑盒，其進一步包括至少一種包含所述微生物的抗原的組合物。13.權利要求12的試劑盒，其中所述抗原包含cov刺突蛋白s1亞基的受體結合結構域(rbd)的至少一部分。14.權利要求11的試劑盒，其進一步包括：(i) 組合物，其包含：單線態氧可激活的化學發光化合物，其具有與其直接或間接結合的由所述試劑的(c)的人抗體特異性結合的抗原；和由激活的化學發光化合物激發的熒光分子；和(ii) 組合物，其包含敏化劑，所述敏化劑能夠在其激發狀態產生單線態氧，并且具有與其直接或間接結合的由所述試劑的(c)的人抗體特異性結合的抗原。15.權利要求11的試劑盒，其進一步包括：(i) 組合物，其包含：單線態氧可激活的化學發光化合物，其具有與其直接或間接結合的由所述試劑的(c)的人抗體特異性結合的抗原；和由激活的化學發光化合物激發的熒光分子；(ii) 組合物，其包含敏化劑，所述敏化劑能夠在其激發狀態產生單線態氧，并且具有與其直接或間接結合的生物素-特異性結合配偶體；和
(iii) 生物素化的抗原，其與所述試劑的(c)的人抗體特異性結合。16.微流體裝置，其包括至少一種權利要求1的試劑。17.產生用于人生物樣品中針對微生物的抗體的血清學免疫測定的校準或質量控制試劑的方法，所述方法包括：將針對所述微生物的抗原的人抗體與抗-人ig抗體在基質中孵育，由此形成抗-人ig抗體與針對所述微生物的抗原的一種或多種人抗體之間的復合物。18.權利要求17的方法，其中所述微生物是嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2 (sars-cov-2)。19.校準用于人生物樣品中針對微生物的抗體的血清學免疫測定的方法，所述方法包括：使用校準或質量控制試劑進行免疫測定，校準或質量控制試劑包含與針對所述微生物的抗原的人抗體復合的抗-人ig抗體。20.權利要求19的方法，其中所述微生物是嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2 (sars-cov-2)。
技術總結
本發明公開了校準和/或質量控制試劑，其用于針對微生物的抗體的血清學免疫測定。在所述試劑中，對微生物抗原特異性的抗體與抗-人Ig抗體復合以形成復合物。還公開了含有試劑的試劑盒和微流體裝置，以及生產和使用所述試劑的方法。的方法。的方法。
