九節茶或其提取物、清熱消炎寧制劑在制備抗冠狀病毒藥物中的應用及其制備方法與流程
1.本發明涉及抗冠狀病毒領域，特別地，涉及一種九節茶或其提取物、清熱消炎寧制劑在 制備抗冠狀病毒藥物中的應用。此外，本發明還涉及一種包括上述清熱消炎寧制劑的制備方 法。
背景技術：
2.冠狀病毒屬于套氏病毒目，冠狀病毒科，是目前自然界已知的最大rna病毒。冠狀病毒 在現實中感染非常普遍，自然宿主分布廣泛，且感染通常有一段潛伏期，其感染宿主主要是 禽類和哺乳動物。第一例人冠狀病毒(hcov)于1965年從普通感冒患者的鼻腔分泌物中分離 出來，命名為hcov-229e。此后，不同的冠狀病毒被陸續從人體內分離出來。冠狀病毒感染 宿主后，受感染宿主體內的病毒基因組會持續復制、突變、重組，不僅引起宿主呼吸系統、 消化系統和神經系統疾病，而且變異的累積還可能產生跨宿主感染。病毒對熱敏感，紫外線、 來蘇水、0.1％過氧乙酸及1％克遼林等都可在短時間內將病毒殺死。冠狀病毒為直徑100～160 nm的球形顆粒，包膜形似冠狀突起，核衣殼呈螺旋對稱，冠狀病毒是正義單鏈rna病毒， 其5’端具甲基化的帽子，編碼一個多聚蛋白，該多聚蛋白包含16個非結構蛋白，參與基因組 的轉錄和復制，而其3’端有poly a尾巴，編碼一系列結構蛋白，包括棘突蛋白s、小分子包 膜蛋白e、膜蛋白m、核衣殼蛋白n，以及只見于少數冠狀病毒的血凝素蛋白。除了編碼結 構蛋白的基因外，還有一些輔助蛋白，這些輔助蛋白具有物種特異性，并且對于病毒的復制 不可或缺。
3.既往已知感染人的冠狀病毒有6種，分別是人冠狀病毒hcov-229e、hcov-oc43、 hcov-nl63和hcov-hku1，以及嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒sars-cov和中東呼吸 綜合癥冠狀病毒mers-cov；sars-cov-2是目前已知的第7種可以感染人的冠狀病毒。以上 冠狀病毒中，前4種冠狀病毒會引發較輕微癥狀的普通感冒，而后3種則會導致嚴重癥狀且 傳染性強，甚至引發致死的病毒性肺炎。尋能夠有效抗冠狀病毒的藥物已經迫在眉睫。
4.九節茶又名腫節風，其藥用歷史悠久，歷代醫書都有記載其廣泛的用藥價值，具有清熱 解毒、抗菌消炎、清肺止咳、祛風除濕、舒筋活絡、活血止痛、接骨續傷等功效。而我司研 制的清熱消炎寧片是根據“熱者寒之，溫者清之”的傳統中醫原則，采用天然藥材九節茶或其研 制而成的中藥制劑，現已列入湖南、內蒙古地方醫保乙類。
5.中國專利cn102793731b公開了九節茶提取物在降低流感病毒易感性上的應用；文 獻(中藥腫節風抗感染作用研究進展，李際強等)公開了中藥腫節風具有抗菌、消炎、 鎮痛、抗腫瘤及免疫調節作用，臨床應用不良反應較少。但是，目前尚未見將九節茶 或其提取物、清熱消炎寧制劑在制備抗冠狀病毒藥物中的應用的報道。
6.因為人冠狀病毒基因變異的高發，使其傳播速度加快、感染能力增強、患者感染后癥狀 加重。因此，有必要對人冠狀病毒和動物攜帶的冠狀病毒變異或流行情況進行監控和研究， 并研制和發現更多的抗人冠狀病毒藥物，以更好地應對將來可能發生的新型人冠狀
病毒的流 行。
技術實現要素：
7.本發明提供了一種九節茶或其提取物、清熱消炎寧制劑在制備抗冠狀病毒藥物中的應用 及其制備方法，以解決針對冠狀病毒缺乏有效防治藥物的技術問題。
8.本發明采用的技術方案如下：
9.本發明一種九節茶或其提取物在制備抗冠狀病毒藥物中的應用。
10.本發明所稱九節茶為金粟蘭科植物，又稱草珊瑚sarcandra glabra(thunb.)nakai，為干燥的 地上部分。
11.九節茶歷史悠久，歷代醫書都有記載其廣泛的藥用價值，具有清熱解毒、清肺止咳、祛 風除濕、舒筋活絡、活血止痛、接骨續傷等功效。
12.進一步地，九節茶中異嗪皮啶的質量百分比不少于0.02％。九節茶提取物中異嗪皮啶的質 量百分比不少于0.26％。九節茶中的有效活性成分之一為異嗪皮啶。
13.優選地，冠狀病毒為人冠狀病毒hcov-229e。上述清熱消炎寧制劑在測試濃度范圍內(12.5 μg/ml～500μg/ml)對mdck細胞無明顯細胞毒性，而且，其在一定程度上抑制了hcov-229e 病毒在細胞內的復制增殖。
14.根據本發明的另一方面，還提供了一種清熱消炎寧制劑在制備抗冠狀病毒藥物中的應用， 清熱消炎寧制劑為采用上述應用中的九節茶或其提取物與藥用輔料組合的單方制劑。
15.九節茶，其藥用歷史悠久，歷代醫書都有記載其廣泛的用藥價值，具有清熱解毒、抗菌 消炎、清肺止咳、祛風除濕、舒筋活絡、活血止痛、接骨續傷等功效。而我司研制的清熱消 炎寧片是根據“熱者寒之，溫者清之”的傳統中醫原則，采用天然藥材九節茶或其研制而成的中 藥制劑，現已列入湖南、內蒙古地方醫保乙類。上述九節茶在制備抗冠狀病毒藥物的新用途， 能有效的抑制冠狀病毒在細胞內的復制增殖，應用于人冠狀病毒致高危癥狀感染。
16.清熱消炎寧制劑是以清瀉里熱為主要作用的清熱藥，其藥性寒涼，具有清熱瀉火、解毒、 清虛熱等功效，多靶點、多途徑發揮作用。清熱消炎寧制劑作為抗菌消炎藥已在臨床長期應 用，其安全性、藥物代謝特性、毒副作用已經明確。上述清熱消炎寧制劑在抗冠狀病毒藥物 中的新應用。上述清熱消炎寧制劑中的制劑可以為膠囊、片劑、丸劑、顆粒劑、沖劑、注射 藥劑或噴劑等。
17.優選的，所述的清熱消炎寧制劑在制備抗冠狀病毒感染引發的呼吸道感染疾病藥物中的 應用。
18.優選的，所述清熱消炎寧制劑在制備抗冠狀病毒感染引發的急性上呼吸道感染或急性下 呼吸道感染的藥物中的應用。
19.進一步，所述清熱消炎寧制劑在制備抗冠狀病毒藥物中的應用，所述清熱消炎寧制劑體 內抑制冠狀病毒主要成分異嗪皮啶劑量使用范圍不少于2.31mg/kg體重/每日。
20.根據本發明的另一方面，還提供了一種清熱消炎寧制劑的制備方法，包括以下步驟：
21.s1、混合制軟材：將九節茶提取物、玉米淀粉、糊精進行干法混合，再加入95％的乙
醇 進行濕法混合，制得軟材；
22.s2、干燥：對軟材加熱干燥，控制水分在5％～7％，獲得干燥物料；
23.s3、整粒：對干燥物料進行整粒；
24.s4、總混：整粒后的干燥物料與硬脂酸鎂混合均勻，獲得總物料；
25.s5、壓片：對總物料進行壓片，獲得素片；
26.s6、包衣：將包衣粉與水混合均勻，獲得包衣液，包衣液均勻噴霧在素片表面，干燥， 冷卻，獲得清熱消炎寧制劑。
27.上述清熱消炎寧制劑的制備方法，包括混合制軟材、干燥、整粒、總混、壓片、包衣， 上述清熱消炎寧制劑的制備，主要為清熱消炎寧片劑，制備的片劑生產工藝和設備簡單，操 作方便，自動化程度高，勞動強度低，生產效率高。上述九節茶提取物作為九節茶提取物中 的一種。清熱消炎寧制劑的制備方法為清熱消炎寧片的制備方法。
28.進一步地，步驟s1中九節茶提取物、玉米淀粉、糊精的質量比為(22～24)∶(0.5～1. 5)∶(1～1.5)，95％的乙醇與九節茶提取物的質量比為1∶(3～6)；
29.步驟s4中硬脂酸鎂與九節茶提取物的質量比為1∶(85～96)；
30.步驟s6中包衣粉與九節茶提取物的質量比為1∶(34～38)，包衣液的固含量為18％～ 24％。
31.進一步地，包衣的具體步驟包括：將包衣粉與水混合均勻，獲得包衣液；將素片置包衣 鍋內，開啟包衣鍋的加熱系統，控制轉速6～8轉/分，進風口溫度85℃以上，出風口溫度不 得低于50℃，片床溫度為40℃～45℃；開啟噴液系統，使包衣液噴霧在素片表面，保持片床 的溫度為35℃～40℃，轉速為8～10轉/分；待素片表面均勻噴霧一層包衣液后，調節轉速為 10～12轉/分，繼續噴霧包衣液，直至所有包衣液噴完，干燥5min，關閉熱風，滾光冷卻15min 后出鍋，獲得清熱消炎寧制劑。
32.上述清熱消炎寧片劑的制備方法具體包括以下步驟：
33.s1、混合制軟材：將285kg～315kg的九節茶提取物、12.7kg的玉米淀粉、15kg的糊精， 用高速混合制粒機進行干法混合，混合1～2分鐘，混合均勻，再加入80kg的95％的乙醇在 臥式濕法混和制粒機進行濕法混合，混合2～4分鐘，混合均勻，制得軟材；
34.s2、干燥：將軟材在加熱設備中加熱干燥，溫度設置為50～70℃，干燥5～10min，控制 水分在5％～7％，獲得干燥物料；
35.s3、整粒：對干燥物料進行整粒，采用搖擺式顆粒機，用14目篩網對干燥物料進行整粒；
36.s4、總混：在二維運動混合機中將整粒后的干燥物料與3.3kg的硬脂酸鎂混合10min， 獲得總物料；
37.s5、壓片：選取φ10mm淺凹沖模，用旋轉式壓片機操作，壓片機轉速10～38轉/分，對 總物料進行壓片，獲得素片，素片硬度不小于4kg；
38.s6、包衣：將8.4kg的包衣粉與水混合均勻，獲得包衣液，包衣液的固含量為18％～24％， 將素片置于包衣鍋內，開啟包衣鍋的加熱系統，控制轉速6～8轉/分，進風口溫度85℃以上， 出風口溫度不得低于50℃，片床溫度為40℃～45℃；開啟噴液系統，使包衣液噴霧在素片表 面，保持片床的溫度為35℃～40℃，轉速為8～10轉/分；待素片表面均勻噴霧一層包衣液后， 調節轉速為10～12轉/分，繼續噴霧包衣液，直至所有包衣液噴完，干燥5min，
關閉熱風， 滾光冷卻15min后出鍋，獲得清熱消炎寧片劑。
39.進一步地，九節茶提取物的制備方法包括以下步驟：對九節茶飲片加水提取二次，過濾， 合并濾液；將濾液進行雙效濃縮，濃縮至相對密度為1.25～1.3(60℃)的稠膏，收膏；將收 膏后的稠膏干燥，獲得干浸膏；將干浸膏進行粗法破碎，再進行細法粉碎，過篩，獲得九節 茶提取物。
40.進一步地，稠膏干燥的具體步驟包括：將稠膏在配料罐中加熱至60℃攪拌均勻，再轉入 真空帶式干燥機進行干燥，真空帶式干燥機采用四段式加熱，第一段、第二段、第三段加熱 溫度為100℃～110℃，第四段加熱溫度均為10℃～30℃，進料速度為15l/h～25l/h，履帶 速度為120mm/min～150mm/min，真空度為-0.095mpa～-0.1mpa。
41.上述九節茶提取物的制備方法具體包括以下步驟：
42.對600kg九節茶飲片由投料口投入直筒提取罐中，分四鍋提取，加水提取二次，第一次 加入九節茶飲片的6倍量水，提取1.5小時，第二次加入九節茶飲片的4倍量水，提取1小時， 經雙聯過濾器過濾，合并濾液；
43.將濾液進行雙效濃縮，打開真空系統，控制真空度為-0.04mpa～-0.08mpa，開啟加熱及 冷凝系統蒸發水分，加熱溫度為60℃～70℃，獲得稠膏；
44.將稠膏共濃縮收8min～10min，收膏至相對密度為1.25～1.3(60℃)；
45.將收膏后的稠膏在配料罐中加熱至60℃攪拌均勻，再轉入真空帶式干燥機進行干燥，真 空帶式干燥機采用四段式加熱，第一段、第二段、第三段加熱溫度均為100℃～110℃，第四 段加熱溫度均為10℃～30℃，筒體溫度不超過60℃，進料速度為15l/h～25l/h，履帶速度 為120mm/min～150mm/min，真空度為-0.095mpa～-0.1mpa，獲得干浸膏；
46.將干浸膏置于粗碎機進行粗法破碎，再在粉碎機進行細法粉碎，過100目篩，獲得九節 茶提取物。
47.本發明具有以下有益效果：本發明的九節茶或其提取物、清熱消炎寧制劑在制備抗冠狀 病毒藥物中的應用，上述九節茶或其提取物在制備抗冠狀病毒藥物屬于新用途，能有效的抑 制冠狀病毒在細胞內的復制增殖，應用于人冠狀病毒致高危癥狀感染。所述清熱消炎寧制劑 抑制人冠狀病毒hcov-229e的ec
50
值小于等于45.94μg/ml。
48.體內實驗藥效表明，所述清熱消炎寧制劑通過增加淋巴細胞cd3
+
、cd4
+
和nk細胞水平， 提高ifn-γ表達，從而抑制人冠狀病毒hcov-229e在肺泡中的復制。所述清熱消炎寧制劑通 過tlr4/myd88/ikk/iκb通路抑制tnf-α、il-1β和vcam-1水平，改善人冠狀病毒hcov-229e 感染引起肺組織的炎癥損傷。
49.本發明的九節茶或其提取物、清熱消炎寧制劑在由人冠狀病毒hcov-229e感染性支 氣管炎-肺炎模型及急性咽炎模型中取得了良好的療效，能顯著減少支氣管、肺臟及咽部組織 的病變程度、改善動物體內巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞及il-6、tnf-α等相關炎癥因子 的表達，具有顯著的抗冠狀病毒的作用。
50.除了上面所描述的目的、特征和優點之外，本發明還有其它的目的、特征和優點。對本 發明作進一步詳細的說明。
附圖說明
51.圖1為清熱消炎寧片干膏粉對冠狀病毒載量的影響圖；
52.a：正常對照組；b：模型對照組；c：連花清瘟膠囊組；d：清熱消炎寧片干膏粉低劑量組； e：清熱消炎寧片干膏粉中劑量組；f：清熱消炎寧片干膏粉高劑量組；
53.圖2為各組蛋白表達條帶圖；
54.a：正常對照組；b：模型對照組；c：連花清瘟膠囊組；d：清熱消炎寧片干膏粉低劑量組； e：清熱消炎寧片干膏粉中劑量組；f：清熱消炎寧片干膏粉高劑量組；
55.圖3為各組蛋白表達相對定量圖；
56.a：正常對照組；b：模型對照組；c：連花清瘟膠囊組；d：清熱消炎寧片干膏粉低劑量組； e：清熱消炎寧片干膏粉中劑量組；f：清熱消炎寧片干膏粉高劑量組。
具體實施方式
57.需要說明的是，在不沖突的情況下，本技術中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。 下面將結合實施例來詳細說明本發明。
58.實施例
59.清熱消炎寧片來自本實驗中心，批號：090201001，含量：成品每片含有九節茶提取物0.38 g，成品每片重約為0.42g；
60.利巴韋林噴霧劑，400mg/瓶，蓬萊諾康藥業有限公司，批號：200218；
61.重組人干擾素α-2b凝膠，規格1.0
×
105iu/克，10g/支，兆科藥業(合肥)有限公司，批 號：20200202；
62.冠狀病毒(hcov-229e)，atcc-vr-740，購自美國atcc；
63.鼻病毒(rhv)，atcc-vr-1187，購自美國atcc；
64.呼吸道合胞病毒(rsv)，atcc-vr-26pq，購自美國atcc；
65.人宮頸癌細胞(h1hela)購自北京北納創聯生物技術研究院；
66.人胚肺細胞(mrc-5)、人喉表皮樣癌細胞(hep-2)購自武漢普諾賽生命科技有限公司；
67.dmem培養基，購自hyclone公司，批號：af29498404；
68.胎牛血清(fbs)，100ml/瓶，美國sciencell公司產品，批號：26399。
69.實施例1
70.清熱消炎寧片劑的制備方法具體包括以下步驟：
71.s1、混合制軟材：將301.14kg的九節茶提取物、12.7kg的玉米淀粉、15kg的糊精，用 高速混合制粒機進行干法混合，混合2分鐘，混合均勻，再加入80kg的95％的乙醇在臥式濕 法混和制粒機進行濕法混合，混合4分鐘，混合均勻，制得軟材；
72.s2、干燥：將軟材在加熱設備中加熱干燥，溫度設置為60℃，干燥8min，控制水分在 5％～7％，獲得干燥物料327kg；
73.s3、整粒：對干燥物料進行整粒，采用搖擺式顆粒機，用14目篩網對干燥物料進行整粒， 獲得整粒物料325.56kg；
74.s4、總混：在二維運動混合機中將整粒后的干燥物料與3.3kg的硬脂酸鎂混合10min， 獲得總物料324.62kg；
75.s5、壓片：選取φ10mm淺凹沖模，用旋轉式壓片機操作，壓片機轉速30轉/分，對總物 料進行壓片，獲得素片322.54kg，素片硬度不小于4kg；
76.s6、包衣：將8.4kg的包衣粉與水混合均勻，獲得包衣液，包衣液的固含量為20％，將 素片置于包衣鍋內，開啟包衣鍋的加熱系統，控制轉速8轉/分，進風口溫度85℃以上，出風 口溫度不得低于50℃，片床溫度為845℃；開啟噴液系統，使包衣液噴霧在素片表面，保持 片床的溫度為840℃，轉速為810轉/分；待素片表面均勻噴霧一層包衣液后，調節轉速為108 轉/分，繼續噴霧包衣液，直至所有包衣液噴完，干燥5min，關閉熱風，滾光冷卻15min后 出鍋，獲得清熱消炎寧片劑331.83kg。
77.九節茶提取物的制備方法具體包括以下步驟：
78.稱取九節茶飲片2962.96kg，共五份，每份592.59kg，由投料口投入直筒提取罐中，分 五鍋提取，加飲用水提取兩次，第一次加入藥材的6倍量水3600kg，提取1.5小時，第二次 加入藥材4倍量水2400kg，提取1小時，每次提取結束后放液，藥液經雙聯過濾器過濾后， 由藥液泵轉入提取液儲罐中，合并兩次濾液，濾液總量25500l；
79.將濾液進行雙效濃縮，打開真空系統，吸取濾液至適當液位后，再開啟加熱及冷凝系統 蒸發水分，濃縮過程中控制真空度為0.06mpa，一效溫度控制為68℃，二效溫度控制為63℃， 獲得稠膏；
80.將稠膏共濃縮收膏9h 46min，兩次濃縮收膏相對密度分別為1.26及1.25；
81.將收膏后的稠膏在配料罐中加熱至60℃攪拌均勻，再轉入真空帶式干燥機進行干燥，真 空帶式干燥機采用四段式加熱，第一段、第二段、第三段加熱溫度均為105℃，第四段加熱溫 度均為25℃，筒體溫度不超過60℃，進料速度為15l/h，履帶速度為140mm/min，真空度為
??
0.095mpa，獲得干浸膏304.61kg；
82.將干浸膏置于粗碎機進行粗法破碎，再在粉碎機進行細法粉碎，獲得九節茶提取物干膏 粉301.14kg，收率為98.86％，異嗪皮啶含量為2.9mg/g。
83.實施例2
84.2.1細胞培養
85.人宮頸癌細胞(h1hela)、人胚肺細胞(mrc-5)、人喉表皮樣癌細胞(hep-2)，均為貼 壁生長細胞，培養基選用含10％fbs的dmem培養基，生長狀態良好時，每隔2～3d可進 行傳代。在凈化工作臺中棄去培養基，用1
×
pbs清洗2～3次，然后加入適量的0.25％ trypsin-edta消化，約2～5min后，待細胞脫落，加入適量的含10％fbs的dmem培養基 以終止胰酶的消化作用，吹打成單細胞懸液，轉入ep管中，以1000rpm離心5min。棄去培 養基，加入新鮮的培養基重懸，按細胞密度約為1
×
105/ml接種到新的培養瓶中，放置于37℃、 5％co2培養箱中培養至對數生長期。
86.2.2病毒的擴增
87.(1)mrc-5細胞擴增hcov-229e
88.將mrc-5細胞接種于培養瓶中，當細胞密度達到70～80％時去掉部分的培養基，剩余的 剛好覆蓋細胞，加入適量的hcov-229e病毒，待病毒吸附于細胞表面后(約3h左右，每隔 30min輕輕晃動培養板，使病毒吸附均勻)，更換不含fbs的新鮮dmem培養基，置于33℃、 5％co2加濕的恒溫培養箱中培養。觀察細胞開始產生病變至不再產生病變時(一般為2～7d) 采取反復凍融法，于3000rpm離心10min以除去細胞殘渣，收集上清液，獲得hcov-229e 病毒液，分裝于凍存管中，標注后于-80℃中短期保存或液氮中長期保存，備用。
89.(2)hep-2細胞擴增rsv
90.將hep-2細胞接種于培養瓶中，當細胞密度達到70～80％時去掉部分的培養基，剩余的 剛好覆蓋細胞，加入適量的rsv病毒，待病毒吸附于細胞表面后(約3h左右，每隔30min 輕輕晃動培養板，使病毒吸附均勻)，更換不含fbs的新鮮dmem培養基，置于37℃、5％co2加濕的恒溫培養箱中培養。觀察細胞開始產生病變至不再產生病變時(一般為2～6d)采取 反復凍融法，于3000rpm離心10min以除去細胞殘渣，收集上清液，獲得rsv病毒液，分 裝于凍存管中，標注后于-80℃中短期保存或液氮中長期保存，備用。
91.(3)h1hela細胞擴增rhv
92.將h1hela細胞接種于培養瓶中，當細胞密度達到70～80％時去掉部分的培養基，剩余 的剛好覆蓋細胞，分別加入適量的rhv病毒，待病毒吸附于細胞表面后(約3h左右，每隔 30min輕輕晃動培養板，使病毒吸附均勻)，更換不含fbs的新鮮培養基，置于37℃、5％co2加濕的恒溫培養箱中培養。觀察細胞開始產生病變至不再產生病變時(一般為2～6d)采取 反復凍融法，于3000rpm離心10min以除去細胞殘渣，收集上清液分裝于凍存管中，獲得 rhv病毒液，標注后于-80℃中短期保存或液氮中長期保存，備用。
93.2.3將收集的病毒液進行tcid
50
的測定
94.分別將mrc-5、hep-2、h1hela單細胞懸液100μl接種在96孔細胞培養板中，待細胞 單層長滿到70％～80％的密度時，即可進行病毒接種；
95.分別對hcov-229e病毒液、rsv病毒液、rhv病毒液取100μl進行10倍比稀釋，共6 個稀釋梯度，分別為10-1
，10-2
，10-3
，10-4
，10-5
，10-6
病毒稀釋液；
96.病毒接種：棄去96孔板中原有的培養液，并用pbs液洗滌細胞2次，相對應的進行病毒 接種，每個病毒稀釋濃度設重復的8個孔，每孔加入100μl的病毒稀釋液，同時設未接種病 毒的對照孔，重復2個孔，加入細胞培養液100μl；將96孔板細胞板置于33℃～37℃，5％co2細胞培養箱中，培養1h，每隔15min，將培養板取出并輕柔晃動，促進病毒吸附細胞，將96 孔細胞培養板轉移至培養箱，補充至100μl病毒稀釋液，并做標記。每天在倒置顯微鏡下觀 察細胞出現cpe的情況，記錄出現有cpe的孔數，按reed-mench公式計算病毒的tcid
50 (tcid
50
，半數組織培養感染劑量，又稱50％組織細胞感染量，即指能在培養板孔或試管內 引起半數細胞病變或死亡所需的病毒量，用以表征病毒的滴度)。
97.tcid
50
＝高于50％cpe的病毒最高稀釋對數+距離比例值
×
稀釋倍數的對數；
98.距離比例值＝(高于50％cpe的百分比－50％)
÷
(高于50％cpe的百分比－低于50％cpe 的百分比)。
99.表1 hcov-229e對mrc-5細胞的半數病毒感染量
100.[0101][0102]
表2 rsv對hep-2細胞的半數病毒感染量
[0103][0104]
表3 rhv對h1hela細胞的半數病毒感染量
[0105][0106]
tcid
50
的測定結果如表1、表2和表3所示，冠狀病毒(hcov-229e)、呼吸道合胞病毒 (rsv)和鼻病毒(rhv)的半數病毒感染量tcid
50
分別為10-4.22
/0.1ml、10-3.85
/0.1ml和 10-3.36
/0.1ml，上述病毒分別做1.66
×
104倍、7.08
×
103倍和2.29
×
103倍稀釋時，取0.1ml接種 細胞，可使50％細胞產生病變。取100個tcid
50
病毒量，即分別稀釋166倍、70.8倍和22.9 倍進行體外抗病毒試驗。
[0107]
實施例3
[0108]
細胞毒性試驗
[0109]
用10％fbs的dmem培養基配制系列濃度的清熱消炎寧片溶液，濃度梯度分別為：500.0、 100.0、50.0、25.0、12.5μg/ml，加入至已培養的96孔板mrc-5細胞，37℃、5％co2加濕 的恒溫培養箱中培養72h，加入mtt，繼續培養4h，在492nm波長下測得各孔的od值， 計算細胞的ic
50
(ic
50
為半抑制濃度，或稱半抑制率，達到50％抑制效果時抑制劑的濃度)。
[0110]
用10％fbs的dmem培養基配制系列濃度的清熱消炎寧片溶液，濃度梯度分別為：500.0、 100.0、50.0、25.0、12.5μg/ml，加入至已培養的96孔板hep-2細胞，37℃、5％co2加濕的 恒溫培養箱中培養72h，加入mtt，繼續培養4h，在492nm波長下測得各孔的od值，計 算細胞的ic
50
。
[0111]
用10％fbs的dmem培養基配制系列濃度的清熱消炎寧片溶液，濃度梯度分別為：500.0、 100.0、50.0、25.0、12.5μg/ml，加入至已培養的96孔板h1hela細胞，37℃、5％co2加濕 的恒溫培養箱中培養72h，加入mtt，繼續培養4h，在492nm波長下測得各孔的od值， 計算細胞的ic
50
。
[0112]
用10％fbs的dmem培養基配制系列濃度的干擾素α-2b溶液，濃度梯度分別為：1
×
103、 5
×
102、2.5
×
102、1.25
×
102、6.25
×
10iu/ml，加入至已培養的96孔板mrc-5細胞，37℃、5％ co2加濕的恒溫培養箱中培養72h，加入mtt，繼續培養4h，在492nm波長下測得各孔的 od值，計算細胞的ic
50
。
[0113]
用10％fbs的dmem培養基配制系列濃度的利巴韋林溶液，濃度梯度分別為：500.0、 100.0、50.0、25.0、12.5μg/ml，加入至已培養的96孔板hep-2細胞，37℃、5％co2加濕的 恒溫培養箱中培養72h，加入mtt，繼續培養4h，在492nm波長下測得各孔的od值，計算 細胞的ic
50
。
[0114]
用10％fbs的dmem培養基配制系列濃度的利巴韋林溶液，濃度梯度分別為：500.0、 100.0、50.0、25.0、12.5μg/ml，加入至已培養的96孔板h1hela細胞，37℃、5％co2加濕 的恒溫培養箱中培養72h，加入mtt，繼續培養4h，在492nm波長下測得各孔的od值， 計算細胞的ic
50
。
[0115]
表4清熱消炎寧片的細胞毒性結果
[0116][0117]
表5利巴韋林、干擾素α-2b的細胞毒性結果
[0118]
炎寧片對冠狀病毒(hcov-229e)的ec
50
為45.94μg/ml，明顯優于干擾素α-2b對冠狀病毒 (hcov-229e)的ec
50
的64.98iu/ml，且清熱消炎寧片對鼻病毒(rhv)和呼吸道合胞病毒 (rsv)的ec
50
均大于》100.0μg/ml，清熱消炎寧片在一定程度上抑制了hcov-229e病毒在 細胞內的復制增殖，其抗hcov-229e病毒的效果明顯優于抗rsv和rhv病毒，也說明了清 熱消炎寧片對抗冠狀病毒(hcov-229e)具有特異性。
[0135]
表6對hcov-229e感染mrc-5細胞的影響
[0136][0137]
表7對rhv感染h1hela細胞的影響
[0138][0139][0140]
表8受對rsv感染hep-2細胞的影響
[0141][0142]
實施例5
[0143]
清熱消炎寧片干膏粉對感染冠狀病毒小鼠一般生理的影響
[0144]
選取spf級balb/c小鼠96只，雌雄各半，體重10.2～13.9g，按性別和體重隨機分為6 組，分別為正常對照組、模型對照組、連花清瘟膠囊組(0.546g/kg)、清熱消炎寧片低、中、 高劑量組(8.72、17.44、34.89g生藥/kg)，每組16只動物。各組動物按20ml/kg經口灌胃給 予相應濃度的藥液，正常對照組和模型對照組口服給予等體積的純水，1次/日，連續給藥7 天。除正常對照組外，各組小鼠于第3天給藥后30min，腹腔注射100mg/kg的環磷酰胺進行 免疫抑制，次日乙醚輕微麻醉經鼻滴入hcov-229e冠狀病毒液100μl/只(感染前進行滴度測 定，約為106tcid
50
/ml)，正常對照組經鼻滴入等體積的空白培養基。給藥期間每天對各組動 物進行稱重，比較動物體重在試驗期間的變化。結果如表9，清熱消炎寧片干膏粉低劑量組小 鼠體重增長明顯(p≤0.05或p≤0.01)。各給藥組小鼠體重均明顯高于模型對照組(p≤0.05 或p≤0.01)。
[0145]
表9清熱消炎寧片干膏粉對感染冠狀病毒小鼠體重的影響(n＝16)
[0146][0147][0148]
注：與正常對照組比較
++
p≤0.01；與模型對照組比較
*
p≤0.05，
**
p≤0.01。
[0149]
實施例6
[0150]
清熱消炎寧片干膏粉對感染冠狀病毒小鼠肺指數、肺組織病理學的影響
[0151]
分組、造模與給藥同實施例5中試驗方法，對小鼠肺臟進行稱重并計算肺指數，另外肺 組織進行he染，根據炎癥細胞浸潤程度進行評分。結果如表10、11所示，連花清瘟膠囊 組、清熱消炎寧片干膏粉低、中、高劑量組肺臟指數均明顯下降(p≤0.01)。對感染冠狀病毒 小鼠肺組織病理狀況，清熱消炎寧片干膏粉低劑量具有明顯改善作用(p≤0.05)。
[0152]
表10清熱消炎寧片干膏粉對感染冠狀病毒小鼠肺指數的影響(n＝10)
[0153]
組別劑量(g生藥/kg)肺指數正常對照組-8.40
±
0.76模型對照組-12.39
±
1.05
++
連花清瘟膠囊組0.546g/kg10.68
±
1.53
**
清熱消炎寧片干膏粉低劑量組8.7210.65
±
1.38
**
清熱消炎寧片干膏粉中劑量組17.4410.74
±
0.86
**
清熱消炎寧片干膏粉高劑量組34.8910.19
±
1.48
**
[0154]
注：與正常對照組比較
++
p≤0.01；與模型對照組比較
**
p≤0.01。
[0155]
表11清熱消炎寧片干膏粉對感染冠狀病毒小鼠肺組織病理的影響(n＝10)
[0156]
組別劑量(g干膏粉/kg)病理評分正常對照組-0.0
±
0.0模型對照組-0.7
±
0.7
++
連花清瘟膠囊組0.546g/kg0.2
±
0.4清熱消炎寧片干膏粉低劑量組8.720.1
±
0.3
*
清熱消炎寧片干膏粉中劑量組17.440.3
±
0.5清熱消炎寧片干膏粉高劑量組34.890.2
±
0.4
[0157]
注：與正常對照組比較
++
p≤0.01；與模型對照組比較
*
p≤0.05。
[0158]
實施例7
[0159]
清熱消炎寧片干膏粉對肺組織冠狀病毒載量的影響
[0160]
分組、造模與給藥同實施例5中試驗方法，采用相對定量pcr法檢測冠狀病毒載量。結 果如圖1所示，連花清瘟膠囊組、清熱消炎寧片干膏粉低、中、高劑量組病毒mrna表達明 顯下降(p≤0.01)。
[0161]
實施例8
[0162]
清熱消炎寧片干膏粉對肺泡灌洗液il-1β、tnf-α、ifn-γ、il-4和vcam-1含量的影響
[0163]
分組、造模與給藥同實施例5中試驗方法，利用elisa試劑盒檢測肺泡灌洗液中il-1β、 tnf-α、ifn-γ、il-4和vcam-1的含量。結果如表12所示，連花清瘟膠囊組、清熱消炎寧 片干膏粉中、高劑量組tnf-α、il-1β和vcam-1水平均明顯降低(p≤0.05或p≤0.01)，其 中連花清瘟膠囊可以有效降低il-4水平(p≤0.05)，清熱消炎寧片干膏粉高劑量可以顯著提 高ifn-γ水平(p≤0.05)。
[0164]
表12清熱消炎寧片干膏粉對感染冠狀病毒小鼠細胞因子的影響(n＝6)
[0165][0166]
注：與正常對照組比較
+
p≤0.05，
++
p≤0.01；與模型對照組比較
*
p≤0.05，
**
p≤0.01。
[0167]
實施例9
[0168]
清熱消炎寧片干膏粉對肺組織免疫細胞數量的影響
[0169]
分組、造模與給藥同實施例5中試驗方法，采用流式細胞儀檢測小鼠肺臟中巨噬細胞、 淋巴細胞(cd3
+
、cd4
+
)以及nk細胞的水平。結果如表13所示，清熱消炎寧片干膏粉高劑 量組巨噬細胞水平明顯降低(p≤0.01)，淋巴細胞cd3
+
、cd4
+
和nk細胞水平明顯升高(p≤ 0.01)。清熱消炎寧片干膏粉低、中劑量組巨噬細胞水平顯著降低(p≤0.05或p≤0.01)，中劑 量組的淋巴細胞cd3
+
、cd4
+
水平顯著上調(p≤0.01)。
[0170]
表13清熱消炎寧片干膏粉對感染冠狀病毒小鼠免疫細胞的影響(n＝6)
[0171][0172]
注：與正常對照組比較
++
p≤0.01；與模型對照組比較
*
p≤0.05，
**
p≤0.01。
[0173]
實施例10
[0174]
清熱消炎片干膏粉對肺組織tlr4、myd88與ikk-β、iκb及其磷酸化蛋白(p-iκb)表達的 影響
[0175]
tlr4/myd88/ikk/iκb信號通路是機體炎癥體系中的重要組成部分，其廣泛參與多種疾病 的發生與調控。分組、造模與給藥同實施例5中試驗方法，采用western blot檢測小鼠肺臟中 tlr4、myd88與ikk-β、iκb及其磷酸化蛋白(p-iκb)的表達，對蛋白表達進行定量分析。 結果如圖2、圖3所示，其中連花清瘟膠囊組tlr4、iκb和p-iκb蛋白表達明顯降低(p≤0.05 或p≤0.01)；清熱消炎片干膏粉中劑量組tlr4、ikk-β蛋白表達明顯下降(p≤0.05)，高劑量 組myd88、ikk-β、iκb的蛋白表達顯著下降(p≤0.05或p≤0.01)。
[0176]
以上結果提示清熱消炎寧片干膏粉具有明顯體內外抗冠狀病毒的藥效作用。
[0177]
以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員 來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等 同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
