金銀花U6啟動(dòng)子及其應(yīng)用
金銀花u6啟動(dòng)子及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明涉及金銀花u6啟動(dòng)子克隆及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2.近年來，crispr/cas9技術(shù)因其操作簡(jiǎn)便、試驗(yàn)周期短、效率高、脫靶率低等特點(diǎn)成為最常用的基因編輯技術(shù)，在作物遺傳育種、植物基因改造及農(nóng)作物品種改良方面展現(xiàn)巨大的潛力。crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)包括能夠作為核酸酶切割雙鏈dna的cas9蛋白，以及一個(gè)人工融合的單向?qū)na(single guide rna，sgrna)，sgrna決定靶序列的特異性，在crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)起著重要作用。現(xiàn)有研究表明，crispr/cas9技術(shù)編輯效率依賴于cas9和sgrna的高表達(dá)，強(qiáng)組成型rna聚合酶ⅱ啟動(dòng)子如花椰菜花葉病毒35s(camv35s)，通常用于驅(qū)動(dòng)cas9表達(dá)，而sgrna通常由u6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。u6啟動(dòng)子是一種rna聚合酶ⅲ啟動(dòng)子，具有明確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，能識(shí)別從g開始的高度保守的起始位點(diǎn)，已被頻繁用于驅(qū)動(dòng)植物小rna的高水平表達(dá)，并已成為驅(qū)動(dòng)crispr/cas9載體中sgrna表達(dá)的首選。
3.現(xiàn)有研究表明，同一物種基因組中存在多個(gè)不同表達(dá)的u6基因，并非所有的u6啟動(dòng)子都能驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)且不同啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率并不相同，u6啟動(dòng)子的高度保守性使其在不同的物種之間仍具有轉(zhuǎn)錄活性，但在同源關(guān)系較遠(yuǎn)的不同物種之間轉(zhuǎn)錄活性存在一定差異，有文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)源性u(píng)6啟動(dòng)子可使sgrna表達(dá)增加，從而提高編輯效率，在大豆中，使用大豆內(nèi)源性u(píng)6啟動(dòng)子gmu6-10構(gòu)建pcas9-gmu6-sgrna載體突變率遠(yuǎn)高于使用擬南芥atu6-26構(gòu)建的pcas9-atu6-sgrna載體的突變率。lu等使用棉花內(nèi)源性ghu6.3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgrna發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量是擬南芥atu6-29啟動(dòng)子的6～7倍，編輯的突變效率提高了4～6倍。目前，已在擬南芥、水稻、小麥、大豆、玉米、棉花、番茄等多種植物中利用植物自身的u6啟動(dòng)子建立crispr/cas9基因組編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)目的基因的高效編輯。
4.金銀花是常用大宗藥材，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，主要活性成分為黃酮類、有機(jī)酸、揮發(fā)油、三萜皂苷等，開發(fā)利用前景廣闊，需求量逐年增加。然而，關(guān)于金銀花u6啟動(dòng)子的研究尚未見報(bào)道，嚴(yán)重制約了金銀花基因編輯技術(shù)的開展。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
5.針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了金銀花u6啟動(dòng)子，及其在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用。本發(fā)明通過pcr及農(nóng)桿菌侵染煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法克隆并篩選高轉(zhuǎn)錄活性的金銀花u6啟動(dòng)子，對(duì)于構(gòu)建金銀花crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)金銀花的分子育種具有重要意義。
6.本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
7.金銀花u6啟動(dòng)子，其核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.4所示。
8.所述金銀花u6啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用，在金銀花基因編輯中的應(yīng)用，比如專門應(yīng)用于金銀花crispr/cas9編輯系統(tǒng)，用于驅(qū)動(dòng)sgrna的表達(dá)。
9.一種基因編輯載體，含有上述的金銀花u6啟動(dòng)子。
10.所述基因編輯載體在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用，在金銀花基因編輯中的應(yīng)用，比如專門應(yīng)用于金銀花crispr/cas9編輯系統(tǒng)，用于驅(qū)動(dòng)sgrna的表達(dá)。
11.一種pbi121融合表達(dá)載體，由植物表達(dá)載體pbi121與gus基因連接而成，植物表達(dá)載體pbi121的啟動(dòng)子為上述的金銀花u6啟動(dòng)子。
12.本研究首次克隆得到4個(gè)金銀花u6啟動(dòng)子，分別構(gòu)建了其lju6-pbi121融合表達(dá)載體，在4個(gè)啟動(dòng)子中，有3個(gè)啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄活性，其中l(wèi)ju61-f1轉(zhuǎn)錄活性最高且長度最短，適用于金銀花crispr/cas9編輯系統(tǒng)，可用于啟動(dòng)sgrna引導(dǎo)序列的表達(dá)。
13.本發(fā)明以金銀花基因組dna為模板，克隆并篩選出具有較高轉(zhuǎn)錄活性的金銀花u6啟動(dòng)子。采用pcr方法，從金銀花基因組中克隆到4個(gè)lju6啟動(dòng)子，長度分別為336bp、708bp、359bp、602bp，plantcare分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)啟動(dòng)子中均含有tata框以及caat框等典型的啟動(dòng)子順式元件，且包含與光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)等相關(guān)的調(diào)控元件；克隆產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序正確后，將lju6啟動(dòng)子連接至攜帶β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因的pbi121載體，成功構(gòu)建4個(gè)lju6-pbi121融合表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草葉片，并對(duì)葉片進(jìn)行g(shù)us組織化學(xué)染及gus定量測(cè)定，結(jié)果均顯示lju61-f1轉(zhuǎn)錄活性最高，本研究初步篩選出轉(zhuǎn)錄活性較高的金銀花u6啟動(dòng)子，為金銀花crispr/cas9基因組編輯技術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)。
14.本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義。
附圖說明
15.圖1：金銀花不同lju6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus的融合表達(dá)載體構(gòu)建。
16.圖2：不同t-lju6表達(dá)載體的酶切鑒定，其中，m:2kb plus dna標(biāo)準(zhǔn)分子量；1:t-lju61-f1；2:t-lju61-f2；3:t-lju62-f1；4：t-lju62-f2；5:35s-pbi121酶切片段。
17.圖3：trans5α感受態(tài)細(xì)胞中l(wèi)ju6-pbi121表達(dá)載體pcr檢測(cè)，其中，m:2kb plus dna標(biāo)準(zhǔn)分子量；1:lju61-f1-pbi121；2:lju61-f2-pbi121；3:lju62-f1-pbi121；4:lju62-f2-pbi121。
18.圖4：農(nóng)桿菌lba4404感受態(tài)細(xì)胞中l(wèi)ju6-pbi121表達(dá)載體pcr檢測(cè)，其中，m:2kb plus dna標(biāo)準(zhǔn)分子量；1:lju61-f1-pbi121；2:lju61-f2-pbi121；3:lju62-f1-pbi121；4:lju62-f2-pbi121。
19.圖5：不同lju6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus在煙草葉片中的瞬時(shí)表達(dá)，其中，a:camv35s-pbi121陽性對(duì)照；b:lju61-f1:gus；c:lju61-f2:gus；d:農(nóng)桿菌陰性對(duì)照；e:lju62-f1:gus；f:lju62-f2:gus。
20.圖6：不同lju6啟動(dòng)子在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)的gus酶活性。
具體實(shí)施方式
21.下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。
22.下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等。
23.實(shí)驗(yàn)金銀花u6啟動(dòng)子的研究
24.1.材料與方法
25.1.1試驗(yàn)材料
26.金銀花、煙草栽培于山東中醫(yī)藥大學(xué)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)蒲高斌教授鑒定為金銀花lonicera japonica、煙草nicotiana tabacum。
27.試驗(yàn)所用pbi121載體由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；植物dna提取試劑盒和5mintm ta/blunt-zero cloning kit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；通用型dna純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和dna分子量makerdl2000(天根生化科技(北京)有限公司)；t4 dna連接酶(neb北京有限公司)；trans 5αchemically competent cell(全式金生物)；限制性內(nèi)切酶hindⅲ和bamhⅰ(賽默飛世爾科技)；lba4404 chemically competent cell(上海唯地生物技術(shù)有限公司)；纖維素酶r-10、離析酶r-10、x-gluc、10
×
pbs緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)；引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司負(fù)責(zé)合成。
28.1.2方法
29.1.2.1金銀花u6啟動(dòng)子的克隆
30.取金銀花葉片，采用植物基因組dna提取試劑盒提取金銀花的dna，利用設(shè)計(jì)的u6啟動(dòng)子引物(如表1所示，引物一列代表某個(gè)啟動(dòng)子的引物)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，32個(gè)循環(huán)；72℃5min；4℃保存。反應(yīng)體系為ddh2o 11μl、2
×
m5 hiper plus taq hifi 10μl、dna模板1μl、上下游引物各0.5μl，共20μl體系。
31.1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，切膠回收獲得目的dna片段，分別為lju61-f1、lju61-f2、lju62-f1、lju62-f2。將啟動(dòng)子片段與ta/blunt-zero cloning kit連接，轉(zhuǎn)化trans5α感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)dnaman進(jìn)行序列比對(duì)分析，正確的質(zhì)粒分別命名為t-lju61-f1、t-lju61-f2、t-lju62-f1、t-lju62-f2。
32.表1本研究使用引物序列
[0033][0034]
1.2.2啟動(dòng)子順式作用元件分析
[0035]
將測(cè)序結(jié)果提交啟動(dòng)子元件在線分析網(wǎng)站plantcare，對(duì)金銀花u6啟動(dòng)子中的順式作用元件進(jìn)行分析。
[0036]
1.2.3融合表達(dá)載體的構(gòu)建
[0037]
分別用hindⅲ和bamhⅰ對(duì)t-lju61-f1、t-lju61-f2、t-lju62-f1、t-lju62-f2質(zhì)粒及植物表達(dá)載體pbi121進(jìn)行雙酶切，切膠回收目的片段，將克隆的得到lju6啟動(dòng)子取代pbi121載體中的camv35s啟動(dòng)子，并與gus基因連接，從而構(gòu)建pbi121融合表達(dá)載體。將融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化trans5α感受態(tài)細(xì)胞，其一次活化菌液經(jīng)pcr驗(yàn)證正確后，二次活化菌液提取質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)lba4404，28℃倒置培養(yǎng)2d，挑取單克隆于lb液體培養(yǎng)基(kan50μg.ml-1
，rif 20μg.ml-1
)進(jìn)行一次活化，對(duì)一次活化菌液進(jìn)行pcr驗(yàn)證，驗(yàn)證成功后，
保存一次活化菌液于-80℃?zhèn)溆谩?br/>[0038]
1.2.4不同啟動(dòng)子在煙草葉片中的瞬時(shí)表達(dá)分析
[0039]
gus組織化學(xué)染法參考蒲艷等的方法(蒲艷,劉超,李繼洋,等.番茄u6啟動(dòng)子的克隆及crispr/cas9基因編輯體系的建立[j].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2018,51:315-326.)，以不加入目的基因的農(nóng)桿菌作為陰性對(duì)照，camv35s-pbi121作為陽性對(duì)照。將構(gòu)建的4個(gè)lju6-pbi121融合表達(dá)載體以及陽性對(duì)照camv35s-pbi121、陰性對(duì)照純農(nóng)桿菌的一次活化農(nóng)桿菌菌液劃線培養(yǎng)，挑取單克隆于lb液體培養(yǎng)基中(kan 50μg.ml-1
，rif 20μg.ml-1
)，28℃，200r.min-1
進(jìn)行活化，培養(yǎng)至菌液od
600
＝0.6～0.8；分別吸取不同體積的活化菌液接種到5ml lb培養(yǎng)基(含50μg.ml-1
kan和20μg.ml-1
rif)中，使每個(gè)農(nóng)桿菌起始菌液od值相同，再次28℃，200r.min-1
搖菌至所有菌液的od
600
＝1.2時(shí)，12 000
×
g離心5min收集菌體，棄上清液，重懸于buffer(50mmol.l-1
mgcl2、200mmol.l-1
mes、20mmol.l-1
乙酰丁香酮)至1ml，室溫放置3h后分別注射到生長2～3周的煙草葉片中，注射完成后做好標(biāo)記，進(jìn)行過夜暗培養(yǎng)。用剪刀分別剪下暗培養(yǎng)過夜后的煙草葉片，浸泡在100μlgus染液中(20mmol.l-1
x-gluc，50mmol.l-1
pbs緩沖液)，抽真空30min。每種農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化進(jìn)行技術(shù)重復(fù)3次，生物學(xué)重復(fù)3次。將抽完真空后的煙草葉片置于37℃，180r.min-1
振蕩染6～7h，吸盡gus染液。最后加入300μl95％乙醇進(jìn)行脫處理，脫時(shí)，每3～4h更換一次脫液，直至葉片綠褪去，觀察脫后的葉片并拍照。
[0040]
gus定量測(cè)定參考張利娜等的方法(張利娜,劉瑜,林擁軍.水稻cdpk12基因啟動(dòng)子的表達(dá)模式及其逆境應(yīng)答元件分析[j].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2015,23(10):1261-1272.)，采用jeff erson(jefferson ra,kavanagh ta,bevan mw.gus fusions：beta-glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[j].the embo journ al,1987,6(13):3901-3907.)報(bào)道的方法測(cè)定gus蛋白活性，結(jié)以所生成的4-甲基傘形酮(4-methylumbel-liferone,4-mu)的量與總蛋白含量和時(shí)間的比值(pmol.mg-1
.min-1
)表示。
[0041]
根據(jù)染情況及定量測(cè)定結(jié)果篩選出高效轉(zhuǎn)錄的u6啟動(dòng)子。
[0042]
2.結(jié)果與分析
[0043]
2.1金銀花啟動(dòng)子片段鑒定
[0044]
從金銀花基因組dna中成功克隆出lju61-f1、lju61-f2、lju62-f1、lju62-f2共4個(gè)lju6啟動(dòng)子片段，長度分別為336bp、708bp、359bp、602bp，核苷酸序列如seq id no.1～4所示。將啟動(dòng)子片段分別與ta/blunt-zero cloning kit連接，轉(zhuǎn)化trans5α感受態(tài)細(xì)胞后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示序列正確。
[0045]
2.2啟動(dòng)子序列分析
[0046]
通過序列分析(表2和表3)，可以發(fā)現(xiàn)4個(gè)啟動(dòng)子中均含有tata框以及caat框等典型的啟動(dòng)子順式元件，lju61中還存在at富集區(qū)，脫落酸反應(yīng)順式作用元件abre(acgtg)、防御和應(yīng)激反應(yīng)順式作用元件tc-rich repeats(attctctaac)、生長素反應(yīng)元件auxre(tgtctcaataag)等，此外還含有多個(gè)光反應(yīng)或光反應(yīng)相關(guān)的元件ace(gacacgtatg)、g-box(tacgtg)、box ii(tggtaataa)、gt1-motif(ggttaa)等，與lju61相比，lju62中含有順式作用元件種類較少，主要為光反應(yīng)或光反應(yīng)相關(guān)的元件4cl-cma1b(attccgataaact)、box 4(attaat)及ga-motif(atagataa)等，此外還含有參與逆境反應(yīng)元件ccaat-box。
[0047]
表2 lju61啟動(dòng)子順式作用元件分析
[0048][0049]
表3 lju62啟動(dòng)子順式作用元件分析
[0050]
[0051][0052]
2.3融合表達(dá)載體的構(gòu)建
[0053]
金銀花不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus基因的融合表達(dá)載體示意圖如圖1所示。hindⅲ和bamhⅰ雙酶切t-lju61-f1、t-lju61-f2、t-lju62-f1、t-lju62-f2質(zhì)粒和植物表達(dá)載體pbi121，1％瓊脂糖凝膠電泳得到目的片段，其大小與預(yù)測(cè)片段大小相符(圖2)；切膠回收不同lju6片段及切除camv35s啟動(dòng)子后pbi121載體大片段，將目的片段用t4連接酶連接后轉(zhuǎn)化trans5α感受態(tài)細(xì)胞，利用其一次活化菌液進(jìn)行pcr鑒定，1％瓊脂糖凝膠電泳顯示可擴(kuò)增出啟動(dòng)子條帶且大小與預(yù)期相符(圖3)，表明融合表達(dá)載體構(gòu)建成功，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；菌液二次活化后提取質(zhì)粒，將融合表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)lba4404，對(duì)其一次活化菌液進(jìn)行pcr鑒定，1％瓊脂糖凝膠電泳顯示可擴(kuò)增出目的條帶且大小與預(yù)期相符(圖4)，表明轉(zhuǎn)化成功。
[0054]
2.4不同啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分析
[0055]
將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體lju61-f1-pbi121、lju61-f2-pbi121、lju62-f1-pbi121、lju62-f2-pbi121、陽性對(duì)照camv35s-pbi121、陰性對(duì)照純農(nóng)桿菌通過農(nóng)桿菌注射法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片，通過gus組織化學(xué)染脫后可發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照及l(fā)ju62-f1啟動(dòng)子處理葉片未觀察到藍(lán)，camv35s、lju61-f1、lju61-f2、lju62-f2啟動(dòng)子處理的煙草葉片可觀察到藍(lán)，說明克隆的4個(gè)lju6啟動(dòng)子中有3個(gè)能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因gus的表達(dá)，且轉(zhuǎn)錄活性各不相同(圖5)。
[0056]
為進(jìn)一步精確分析不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus的表達(dá)差異，對(duì)gus酶活性進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果如圖6所示，結(jié)果顯示陰性對(duì)照以及l(fā)ju62-f1啟動(dòng)子處理的煙草葉片幾乎檢測(cè)不到酶活性，lju61-f1與camv35s活性相差不大，且活性較高，為lju61-f2的1.5倍，lju62-f2活性最低，這與gus染結(jié)果一致。
[0057]
3.討論
[0058]
本研究首次克隆得到金銀花lju6啟動(dòng)子，并對(duì)其進(jìn)行順式作用元件進(jìn)行分析，現(xiàn)有研究表明啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)包括順式作用元件的排列位置及距離影響其與rna聚合酶的識(shí)別、結(jié)合，從而影響基因表達(dá)水平；同時(shí)，順式作用元件caat框?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄具有較強(qiáng)的激活作用，在tata框上游含有caat框?qū)⑹够虻谋磉_(dá)量大幅度增加。在本研究中發(fā)現(xiàn)相較于lju62，lju61中含有更多的caat框，這可能是其轉(zhuǎn)錄活性高于lju62的一個(gè)原因。
[0059]
本研究利用gus作為報(bào)告基因，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片后染顏深淺以及定量測(cè)定結(jié)果判斷啟動(dòng)子活性，gus組織化學(xué)染結(jié)果及定量測(cè)定結(jié)果顯示，克隆的4個(gè)u6啟動(dòng)子在煙草葉片中的轉(zhuǎn)錄效率各不相同，相對(duì)于lju61-f2，lju61-f1的轉(zhuǎn)錄活性更高，lju62-f2轉(zhuǎn)錄活性低于lju61-f2。lju62-f1在gus染中未顯藍(lán)且?guī)缀鯔z測(cè)不到酶活性，觀察序列發(fā)現(xiàn)lju62-f1中除少數(shù)tata以及光響應(yīng)序列無其他結(jié)構(gòu)，其是否因?yàn)槿鄙倌承┰鴨适Я宿D(zhuǎn)錄活性仍有待進(jìn)一步研究。
[0060]
給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供上述實(shí)施例，以完全公開和描述如何實(shí)施和使用所主張的
實(shí)施方案，而不是用于限制本文公開的范圍。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的修飾將在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
技術(shù)特征：
1.金銀花u6啟動(dòng)子，其核苷酸序列如seq id no.1所示。2.金銀花u6啟動(dòng)子，其核苷酸序列如seq id no.2所示。3.金銀花u6啟動(dòng)子，其核苷酸序列如seq id no.4所示。4.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的金銀花u6啟動(dòng)子在金銀花基因編輯中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：專門應(yīng)用于金銀花crispr/cas9編輯系統(tǒng)，用于驅(qū)動(dòng)sgrna的表達(dá)。6.一種基因編輯載體，其特征在于：含有如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的金銀花u6啟動(dòng)子。7.權(quán)利要求6所述的基因編輯載體在金銀花基因編輯中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：專門應(yīng)用于金銀花crispr/cas9編輯系統(tǒng)，用于驅(qū)動(dòng)sgrna的表達(dá)。9.一種pbi121融合表達(dá)載體，其特征在于：由植物表達(dá)載體pbi121與gus基因連接而成，植物表達(dá)載體pbi121的啟動(dòng)子為權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的金銀花u6啟動(dòng)子。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了金銀花U6啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ ID O.1、SEQ ID O.2或SEQ ID O.4所示。本發(fā)明從金銀花基因組中克隆到了4個(gè)LjU6啟動(dòng)子，將LjU6啟動(dòng)子連接至攜帶β-葡萄糖苷酸酶基因的pBI121載體，通過農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草葉片，并對(duì)葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染，染結(jié)果顯示其中3個(gè)啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄活性，其中LjU61-F1轉(zhuǎn)錄活性最高且長度最短。本發(fā)明的金銀花U6啟動(dòng)子適用于金銀花CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，可用于啟動(dòng)sgRA引導(dǎo)序列的表達(dá)，本發(fā)明為金銀花CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)。術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)。術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)。
