一種環狀RA在HPV16陽性宮頸癌預后評估中的應用的制作方法
一種環狀rna在hpv16陽性宮頸癌預后評估中的應用
技術領域
1.本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種環狀rna在hpv16陽性宮頸癌預后評估中的應用。
背景技術：
2.宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，發病率和死亡率呈逐年升高的趨勢，居女性惡性腫瘤死亡率第二位。超過50％的宮頸癌患者存在高危人乳頭瘤病毒hpv16感染，是宮頸癌的主要致病元兇之一。雖然目前hpv16疫苗已在臨床上用于宮頸癌預防，但對已經感染hpv及其所致的宮頸癌和癌前病變，尚無特異性方法。最新重磅研究顯示：hpv16獨特的致癌性主要取決于病毒核心dna編碼的e7癌蛋白，e7促進了hpv16陽性宮頸癌的發生發展，但具體機制尚不明確。因此，以e7癌蛋白為切入點，深入探索hpv16相關宮頸癌的發生發展機制，挖掘其診療特異性靶標，具有非常現實的臨床轉化意義。
3.近年來不斷有研究報道病毒相關的腫瘤與非編碼rna(non-coding rna,ncrna)關系密切：如hbv相關肝癌中lncrna hbx-line1可通過emt途徑促進肝癌侵襲轉移，并與預后顯著相關；ebv編碼的mir-bart6-3p可通過emt下調lncrna-loc553103表達抑制ebv相關鼻咽癌和胃癌的侵襲轉移。在宮頸癌領域，mir-146a-5p通過上調kdm2b的表達促進了hpv16相關宮頸癌的侵襲轉移；e7癌蛋白通過下調lncrnahotair的表達激活下游促癌基因hoxd10表達，從而促進hpv16相關宮頸癌的惡性進展。環狀rna(circular rna，circrna)作為一類特殊的非編碼rna分子，可調控腫瘤的惡性進展。
技術實現要素：
4.發明目的：本發明所要解決的技術問題是提供了環狀rna circ-0036602或其檢測試劑在制備預防或宮頸癌或宮頸癌預后評估藥物中的應用
5.技術方案：本發明提供了環狀rna circ-0036602或其檢測試劑在制備預防或宮頸癌或宮頸癌預后評估藥物中的應用。
6.其中，所述宮頸癌為hpv16陽性宮頸癌。
7.本發明的環狀rna在hpv16陽性宮頸癌組織中高表達。
8.本發明的環狀rna在hpv16陽性宮頸癌細胞(caski和siha)中高表達，在hpv16陰性細胞(c33a)中及正常宮頸上皮細胞(hacat)中低表達或者不表達。
9.本發明的環狀rna在hpv16陽性宮頸癌組織中與患者預后相關，呈其表達越高，預后越差。基于此，我們提出環狀rna基因表達檢測可以應用于hpv16陽性宮頸癌的預后評估，指導個體化。
10.本發明內容還包括一種檢測宮頸癌組織或細胞或正常宮頸細胞或hpv16陰性細胞中環狀rnacirc-0036602表達水平的試劑或試劑盒。
11.其中，所述宮頸癌細胞為caski細胞或siha細胞，所述正常宮頸細胞為hacat細胞，所述hpv16陰性細胞為c33a細胞。
12.其中，所述試劑或試劑盒包括針對所述環狀rna的引物對。
13.其中，所述引物對序列如seq id：no.3和seq id：no.4所示，其長度約20bp，擴增產物約200bp
14.其中，所述試劑盒還可包含針對內參基因的核酸序列引物對，其內參引物對序列參見seq id：no.9和seq id：no.10所示。
15.其中，所述試劑盒包括反轉錄試劑盒或熒光定量pcr試劑盒。
16.其中，所述反轉錄試劑盒包括聚合酶鏈式反應所需的其他元件。
17.其中，所述熒光定量pcr試劑盒包括pcr反應管、預混合反應液和無菌水。
18.有益效果：與現有技術相比，本發明具備以下優點：本發明公開了環狀rna(circ-0036602)是一種可靠的與hpv16陽性宮頸癌預后相關分子靶標，可以通過檢測患者該類基因表達水平判斷預后，指導臨床制定個體化化療方案，提高療效。
附圖說明
19.圖1：(a)e7干擾效率檢測；(b)caski-nc組和caski-shrna-e7組circrna表達譜芯片結果和go分析；(c)siha-nc組和siha-shrna-e7組circrna表達譜芯片結果和kegg分析；(d)芯片分析獲得的3條上調和3條下調的circrna基本信息；
20.圖2：(a-f)circ-0011968，circ-0005092，circ-0036602，circ-0013306，circ-0008995，circ-0008731在30例hpv16陽性和30例hpv16陰性宮頸癌組織中的表達水平；
21.圖3：(a)circ-0036602表達與e7癌蛋白表達正相關；(b-c)circ-0036602表達與分化程度及淋巴結轉移相關性分析；(d)kaplan-meier生存分析；(e)circ-0036602在hpv16陽性和hpv16陰性宮頸癌細胞株以及正常宮頸上皮細胞中的表達；(hpv16+cc：hpv16陽性宮頸癌，hpv16-cc：hpv16陰性宮頸癌)。
具體實施方式
22.根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
23.實施例
24.1、宮頸癌組織樣本收集
25.收集hpv16陽性宮頸癌組織和hpv16陰性宮頸癌組織各30例，所有樣本離體后立即放入液氮凍存，整個操作及保存過程遵循無酶原則。
26.2、rna提取
27.trizol裂解宮頸癌細胞和組織。利用細胞和組織rna抽提試劑盒(tiangen公司)提取總rna，具體操作詳見說明書。
28.3、rna樣品的質量分析
29.nanodrop2000檢測rna的濃度和純度，od260/280范圍區間為1.8-2.2，agilenttechnologies 2100 bioanalyzer檢測總rna的濃度、rin值、28s/18s和片段大小，rna完整性指數合格，濃度≥20ng/μl，進行mrna文庫構建。
30.4、逆轉錄和熒光定量pcr
31.將rna的定量統一后，按照takara反轉錄試劑盒(rt reagent kit with gdna eraser)的說明書進行第一鏈cdna的制備：
32.1)基因組dna的除去反應：
[0033][0034][0035]
2)基因組dna的除去反應程序：42℃反應2分鐘；4℃保存；
[0036]
3)逆轉錄反應：
[0037][0038]
4)程序：37℃反應15分鐘；85℃反應5秒鐘；4℃反應5分鐘；
[0039]
5)將逆轉錄所得到的cdna樣品以及剩余的rna樣品，-80℃冰箱內保存備用。
[0040]
6)熒光定量pcr
[0041]
10μl real-time pcr體系：
[0042][0043]
引物序列：
[0044]
在ncbi數據庫里面選擇znf592、circ-0036602、mir-34a-5p、mir-431-5p和β-actin，然后查到相應基因的dna序列。使用引物設計軟件primer 5.0進行引物設計，引物序列見下表：
[0045][0046][0047]
7)pcr擴增程序：95℃，3分鐘；
[0048][0049]
8)結果分析
[0050]
以β-actin為內參，應用熒光定量pcr儀進行擴增，檢測各個樣本的ct值，然后結果導出excel表格，相對定量使用公式2
?△△
ct進行計算，
△△
ct＝(目的基因ct值-β-actinct值)實驗組-(目的基因ct值-β-actinct值)對照組。
[0051]
5、統計學分析
[0052]
采用spss22.0和graphpadprism6.0軟件進行數據統計和結果分析，結果以平均值
±
標準誤表示。hpv16陽性宮頸癌組織和hpv16陰性宮頸癌組織兩組間比較時用獨立樣本t檢驗分析。以p＜0.05和p＜0.01為差異，具有統計學意義。
[0053]
6、實驗結果
[0054]
6.1功能circrna的篩選
[0055]
選取hpv16陽性宮頸癌細胞株caski和siha，應用慢病毒構建e7蛋白敲減穩轉細胞株(caski-shrna-e7、siha-shrna-e7)，western blot檢測干擾效率，同時選取對照細胞株(caski-nc、siha-nc)分別進行circrna表達譜芯片檢測，caski-nc組與caski-shrna-e7組相比，共有1265個circrna差異表達，其中894條上調，371條下調(fold change》3，p《0.05)；對差異表達circrna所對應宿主基因進行go分析顯示，與細胞粘附、染體分離及細胞內外受體互作密切相關(圖1a)。siha-nc組與siha-shrna-e7組相比，共有1384個circrna差異表達，其中963條上調，421條下調(fold change》3，p《0.05)；對差異表達circrna所對應的宿主基因進行kegg pathway分析顯示，與細胞進程及調控、細胞的侵襲轉移等相關(圖1b)。進一步，將上述2類差異表達基因取交集，結合表達豐度高，均一性好，上下調一致原則，獲得3條高表達以及3條低表達差異circrna(圖1c)。
[0056]
6.2目標circrna的驗證
[0057]
為進一步篩選候選驗證靶標，我們采用qrt-pcr技術，針對上述6個差異表達circrna成環位點設計特異性背向引物(divergent primer)，在30例hpv16陽性和30例hpv16陰性宮頸癌組織中進行驗證，結果發現circ-0036602在hpv16陽性宮頸癌組織中表達差異最顯著，上調4.07倍，均一性好。(圖2a-f)。
[0058]
6.3 circ-0036602與宮頸癌患者臨床病理特征分析
[0059]
將circ-0036602與e7癌蛋白的表達進行相關性分析。發現circ-0036602與e7癌蛋白表達顯著相關(圖3a)，結合臨床病理特征，circ-0036602表達水平與分化(p＝0.02，圖3b)和淋巴結轉移密切相關(p＝0.017，圖3c)，并且表達越高患者預后越差(圖3d)。在hpv16陽性宮頸癌細胞株(caski和siha)中、hpv16陰性宮頸癌細胞株(c33a)和正常宮頸上皮細胞(hacat)中檢測，發現circ-0036602在caski和siha中表達高于c33a和hacat(圖3e)。
技術特征：
1.環狀rna circ-0036602或其檢測試劑在制備預防或宮頸癌或宮頸癌預后評估藥物中的應用。2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述宮頸癌為hpv16陽性宮頸癌。3.一種檢測宮頸癌組織或細胞或正常宮頸細胞或hpv16陰性細胞中環狀rna circ-0036602表達水平的試劑或試劑盒。4.根據權利要求3所述的試劑或試劑盒，其特征在于，所述宮頸癌細胞為caski細胞或siha細胞，所述正常宮頸細胞為hacat細胞，所述hpv16陰性細胞為c33a細胞。5.根據權利要求3所述的試劑或試劑盒，其特征在于，所述試劑或試劑盒包括針對所述環狀rna的引物對。6.根據權利要求5所述的試劑或試劑盒，其特征在于，所述引物對序列如seq id：no.3和seq id：no.4所示。7.根據權利要求5所述的試劑或試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還可包含針對內參基因的核酸序列引物對。8.根據權利要求5所述的試劑或試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括反轉錄試劑盒或熒光定量pcr試劑盒。9.根據權利要求7所述的試劑或試劑盒，其特征在于，所述反轉錄試劑盒包括聚合酶鏈式反應所需的其他元件。10.根據權利要求8所述的試劑或試劑盒，其特征在于，所述熒光定量pcr試劑盒包括pcr反應管、預混合反應液和無菌水。
技術總結
本發明公開了環狀RA circ-0036602或其檢測試劑在制備預防或宮頸癌或宮頸癌預后評估藥物中的應用。本發明還公開了檢測宮頸癌組織或細胞或正常宮頸細胞或HPV16陰性細胞中環狀RA circ-0036602表達水平的試劑或試劑盒。本發明公開的環狀RA（circ-0036602）是一種可靠的與HPV16陽性宮頸癌預后相關分子靶標，可以通過檢測患者該類基因表達水平判斷預后，指導臨床制定個體化化療方案，提高療效。提高療效。提高療效。
