一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法
1.本發明屬于微生物工程技術領域，具體涉及一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法。
背景技術：
2.豆血紅蛋白（leghemoglobin，legh）是根瘤菌感染大豆后共同產生的植物來源的血紅蛋白。豆血紅蛋白作為植物肉生產過程中的添加劑，可以很大程度上提高植物肉的澤和質地，使其與動物肉更為接近。目前豆血紅蛋白的主要來源還是從大豆中提取，但是大豆種植周期長，而且天然的豆血紅蛋白在大豆中產量比較低，提取較為困難，后期加工成本較高，因此利用微生物表達豆血紅蛋白受到人們的廣泛關注，且具有很大的市場前景。
3.巴斯德畢赤酵母（pichia pastoris）是一種常用的外源蛋白生產菌，目前已有美國impossible foods公司利用重組畢赤酵母商業化生產豆血紅蛋白的報道，但關于畢赤酵母產豆血紅的相關研究報道還比較少，且存在血紅蛋白的產量較低的問題。
技術實現要素：
4.針對現有技術中存在的豆血紅蛋白產量低的問題，本發明設計的目的在于提供一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法，該方法能夠提高發酵液中菌體密度，提高豆血紅蛋白產率。本發明通過以下技術方案加以實現。
5.所述的一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法，該方法包括以下步驟：1）畢赤酵母重組菌種子液的制備；2）將步驟1）得到的畢赤酵母重組菌種子液接種到生長培養基中進行菌體發酵培養；3）待培養至對數生長中期后，將發酵液靜置或離心，使菌液分離，傾倒出上清液，得到對數生長期的畢赤酵母菌體，向畢赤酵母菌體中補入與傾倒出的上清液等體積新鮮的發酵培養基，重新進行發酵，發酵過程中，每隔24h，向發酵培養基中補入適量的甲醇，使發酵培養基中甲醇終濃度維持在0.8-1.2%之間；4）發酵結束后，將發酵液靜置，小心傾倒進行菌液分離，得到含有豆血紅蛋白的發酵液清液，進行豆血紅蛋白的含量測定。
6.進一步地，步驟1）中，畢赤酵母重組菌種子液制備用的培養基體系中含有1%的葡萄糖，1%的甘油，2%的普通蛋白胨，1%的酵母提取物。
7.進一步地，步驟1）中，畢赤酵母重組菌種子液培養條件為：培養時間為24h，培養溫度30℃，搖床轉速250r/min，畢赤酵母重組菌種子液的接種量為2%。
8.進一步地，步驟2）中生長培養基的體系中含有1%的酵母粉，2%的蛋白胨，0.34%的無氨基酵母氮源，1%的硫酸銨，4
×
10-5
%的生物素，1%的甘油，100mm ph為6.0的磷酸鉀緩沖液。
9.進一步地，步驟2）菌體發酵培養的條件為：培養溫度30℃，搖床轉速250r/min。
10.進一步地，步驟3）中發酵培養基的體系中含有1%的酵母粉，2%的蛋白胨，0.34%的ynb，1%的硫酸銨，4
×
10-5 %的生物素，1%的甲醇，100mm ph為6.0的磷酸鉀緩沖液，10μm/l的鐵鹽。
11.進一步地，步驟3）中，發酵培養基的培養條件為：培養溫度28℃，搖床轉速250r/min。
12.進一步地，步驟3）中，發酵培養基中甲醇終濃度維持為0.8-1.2%，發酵時間為96h。
13.進一步地，所述蛋白胨為酵母蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉蛋白胨及魚蛋白胨中的任一種。
14.進一步地，所述鐵鹽為血紅素、高鐵血紅素、氯化血紅素、檸檬酸鐵、硫酸亞鐵及氯化亞鐵中的任一種。
15.進一步地，本發明還提供了上述技術方案中所用的發酵培養基中添加不同來源的蛋白胨和不同種類的鐵鹽在畢赤酵母生產豆血紅蛋白中的應用。
16.本發明方法通過采用向發酵培養基中加入不同來源的蛋白胨和不同種類的鐵鹽進行發酵生產，在發酵周期結束后，通過分離菌體細胞和發酵液，得到含豆血紅蛋白的發酵液，經測定發酵液中的菌體密度和豆血紅蛋白的產率都有所提高。
具體實施方式
17.以下結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明，以更好地理解本技術方案。
18.實施例1步驟1：選取培養良好的平板菌種挑取單菌落接種于種子培養基中，裝液量為250ml三角瓶中50ml種子培養基，于搖床28℃，250 r/min培養24h；上述種子培養基體系含有：葡萄糖1%（單獨滅菌，接種前加入），普通蛋白胨2%，酵母提取物1%，甘油1%。
19.步驟2：將制備好的種子液以2%的比例接種至生長培養基中，裝液量為250ml三角瓶中50ml種子培養基，于搖床28℃，250 r/min培養16h；上述生長培養基體系含有：酵母粉1%，大豆蛋白胨2%，無氨基酵母氮源0.34%，1 %硫酸銨，生物素4
×
10-5 %，甘油1%， 磷酸鉀緩沖液（ph 6.0）100mm。
20.步驟3：將步驟2發酵后的發酵液靜置沉降分離出上清液，補入同體積的發酵培養基；上述發酵培養基體系中含有：酵母粉1%，大豆蛋白胨2%，ynb 0.34%，硫酸銨1%，生物素4
×
10-5 %，甲醇1%，磷酸鉀緩沖液（ph 6.0）100mm，血紅素10μm/l。
21.步驟4：向步驟3中的發酵液中每隔24h補充入一定甲醇，使甲醇濃度維持在1%，并且發酵持續96h后結束發酵，將震蕩混勻后的發酵液靜置一段時間后，小心傾倒進行菌液分離，得到含有豆血紅蛋白的發酵液清液。
22.經測定，在生長培養基和發酵培養基中采用大豆蛋白胨，并在發酵培養基中添加10μm/l的血紅素，與使用普通蛋白胨和不添加血紅素的培養基相比，豆血紅蛋白的產量提高了40.7%。
23.實施例2步驟1：選取培養良好的平板菌種挑取單菌落接種于種子培養基中，裝液量為
250ml三角瓶中50ml種子培養基，于搖床28℃，250 r/min培養24h；上述種子培養基體系含有：葡萄糖1%（單獨滅菌，接種前加入），普通蛋白胨2%，酵母提取物1%，甘油1%。
24.步驟2：將制備好的種子液以2%的比例接種至生長培養基中，裝液量為250ml三角瓶中50ml種子培養基，于搖床28℃，250 r/min培養16h；上述生長培養基體系含有：酵母粉1%，大豆蛋白胨2%，無氨基酵母氮源0.34%，1 %硫酸銨，生物素4
×
10-5 %，甘油1%， 磷酸鉀緩沖液（ph 6.0）100mm。
25.步驟3：將步驟2發酵后的發酵液靜置沉降分離出上清液，補入同體積的發酵培養基；上述發酵培養基體系中含有：酵母粉1%，大豆蛋白胨2%， ynb 0.34%，硫酸銨1%，生物素4
×
10-5 %，甲醇1%，磷酸鉀緩沖液（ph 6.0）100mm，檸檬酸鐵10μm/l。
26.步驟4：向步驟3中的發酵液中每隔24h補充入一定甲醇，使甲醇濃度維持在0.8%，并且發酵持續96h后結束發酵，將震蕩混勻后的發酵液靜置一段時間后，小心傾倒進行菌液分離，得到含有豆血紅蛋白的發酵液清液。
27.經測定，在生長培養基和發酵培養基中采用大豆蛋白胨，并在發酵培養基中添加10μm/l的檸檬酸鐵，與使用普通蛋白胨和不添加檸檬酸鐵的培養基相比，豆血紅蛋白產量提高了28.3%。
28.實施例3步驟1：選取培養良好的平板菌種挑取單菌落接種于種子培養基中，裝液量為250ml三角瓶中50ml種子培養基，于搖床28℃，250 r/min培養24h；上述種子培養基體系含有：葡萄糖1%（單獨滅菌，接種前加入），普通蛋白胨2%，酵母提取物1%，甘油1%。
29.步驟2：將制備好的種子液以2%的比例接種至生長培養基中，裝液量為250ml三角瓶中50ml種子培養基，于搖床28℃，250 r/min培養16h；上述生長培養基體系含有：酵母粉1%，大豆蛋白胨2%，無氨基酵母氮源0.34%，1 %硫酸銨，生物素4
×
10-5 %，甘油1%， 磷酸鉀緩沖液（ph 6.0）100mm。
30.步驟3：將步驟2發酵后的發酵液靜置沉降分離出上清液，補入同體積的發酵培養基；上述發酵培養基體系中含有：酵母粉1%，大豆蛋白胨2%， ynb 0.34%，硫酸銨1%，生物素4
×
10-5 %，甲醇1%，磷酸鉀緩沖液（ph 6.0）100mm。
31.步驟4：向步驟3中的發酵液中每隔24h補充入一定甲醇，使甲醇濃度維持在1%，并且發酵持續96h后結束發酵，將震蕩混勻后的發酵液靜置一段時間后，小心傾倒進行菌液分離，得到含有豆血紅蛋白的發酵液清液。
32.經測定，在生長培養基和發酵培養基中采用大豆蛋白胨代替普通蛋白胨，豆血紅蛋白產量提高了15.2%。
33.實施例4步驟1：選取培養良好的平板菌種挑取單菌落接種于種子培養基中，裝液量為250ml三角瓶中50ml種子培養基，于搖床28℃，250 r/min培養24h；上述種子培養基體系含有：葡萄糖1%（單獨滅菌，接種前加入），普通蛋白胨2%，酵
母提取物1%，甘油1%。
34.步驟2：將制備好的種子液以2%的比例接種至生長培養基中，裝液量為250ml三角瓶中50ml種子培養基，于搖床28℃，250 r/min培養16h；上述生長培養基體系含有：酵母粉1%，普通蛋白胨2%，無氨基酵母氮源0.34%，1 %硫酸銨，生物素4
×
10-5 %，甘油1%，磷酸鉀緩沖液（ph 6.0）100mm。
35.步驟3：將步驟2發酵后的發酵液靜置沉降分離出上清液，補入同體積的發酵培養基；上述發酵培養基體系中含有：酵母粉1%，普通蛋白胨2%，ynb 0.34%，硫酸銨1%，生物素4
×
10-5 %，甲醇1%，磷酸鉀緩沖液（ph 6.0）100mm，血紅素10μm/l。
36.步驟4：向步驟3中的發酵液中每隔24h補充入一定甲醇，使甲醇濃度維持在1%左右，發酵持續96h后結束發酵，將振蕩混勻后的發酵液靜置一段時間后，小心傾倒進行菌液分離，得到含有豆血紅蛋白的發酵液清液。
37.經測定，在生長培養基和發酵培養基中采用普通蛋白胨、在發酵培養基中添加血紅素10μm/l的血紅素，與不添加血紅素相比，豆血紅蛋白產量提高了17.1%。
技術特征：
1.一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：1）畢赤酵母重組菌種子液的制備；2）將步驟1）得到的畢赤酵母重組菌種子液接種到生長培養基中進行菌體發酵培養；3）待培養至對數生長中期后，將發酵液靜置或離心，使菌液分離，傾倒出上清液，得到對數生長期的畢赤酵母菌體，向畢赤酵母菌體中補入與傾倒出的上清液等體積新鮮的發酵培養基，重新進行發酵，發酵過程中，每隔24h，向發酵培養基中補入適量的甲醇，使發酵培養基中甲醇終濃度維持在0.8-1.2%之間；4）發酵結束后，將發酵液靜置，小心傾倒進行菌液分離，得到含有豆血紅蛋白的發酵液清液，進行豆血紅蛋白的含量測定。2.如權利要求1所述的一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法，其特征在于步驟1）中，畢赤酵母重組菌種子液制備用的培養基體系中含有1%的葡萄糖，1%的甘油，2%的普通蛋白胨，1%的酵母提取物。3.如權利要求1所述的一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法，其特征在于步驟1）中，畢赤酵母重組菌種子液培養條件為：培養時間為24h，培養溫度30℃，搖床轉速250r/min，畢赤酵母重組菌種子液的接種量為2%。4.如權利要求1所述的一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法，其特征在于步驟2）中生長培養基的體系中含有1%的酵母粉，2%的蛋白胨，0.34%的無氨基酵母氮源，1%的硫酸銨，4
×
10-5
%的生物素，1%的甘油，100mm ph為6.0的磷酸鉀緩沖液。5.如權利要求1所述的一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法，其特征在于步驟2）菌體發酵培養的條件為：培養溫度30℃，搖床轉速250r/min。6.如權利要求1所述的一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法，其特征在于步驟3）中發酵培養基的體系中含有1%的酵母粉，2%的蛋白胨，0.34%的ynb，1%的硫酸銨，4
×
10-5 %的生物素，1%的甲醇，100mm ph為6.0的磷酸鉀緩沖液，10μm/l的鐵鹽。7.如權利要求1所述的一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法，其特征在于步驟3）中，發酵培養基的培養條件為：培養溫度28℃，搖床轉速250r/min。8.如權利要求1所述的一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法，其特征在于步驟3）中，發酵培養基中甲醇終濃度維持為0.8-1.2%，發酵時間為96h。9.如權利要求4或6所述的一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法，其特征在于所述蛋白胨為酵母蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉蛋白胨及魚蛋白胨中的任一種。10.如權利要求6所述的一種提高重組畢赤酵母產豆血紅蛋白的方法，其特征在于所述鐵鹽為血紅素、高鐵血紅素、氯化血紅素、檸檬酸鐵、硫酸亞鐵及氯化亞鐵中的任一種。
技術總結
本發明公開了一種提高重組畢赤酵母發酵產豆血紅蛋白的方法，涉及微生物工程技術領域，本發明方法通過在發酵培養基中添加不同來源的蛋白胨和不同種類的鐵鹽以促進畢赤酵母豆血紅蛋白的發酵生產。菌體在生長培養基中培養一定時間后，將菌體沉淀后，棄去上清液，補入添加不同來源蛋白胨和不同種類鐵鹽的新鮮發酵培養基將菌體重新懸浮后繼續發酵，進行豆血紅蛋白的誘導表達。本發明利用向發酵培養基中加入不同種類的蛋白胨和鐵鹽，提高了發酵液中重組畢赤酵母的菌體密度和豆血紅蛋白的產率。重組畢赤酵母的菌體密度和豆血紅蛋白的產率。
