一種改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑及其制備與應用
1.本發明屬于環境污染生物處理技術領域，涉及一種改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑的及其制備及與應用。
背景技術：
2.多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，pahs)是一類廣泛存在于環境中的有機污染物，由兩個或兩個以上稠合苯環組成的芳香族碳氫化合物，主要源于石油、煤等化石燃料以及木材、天然氣、秸稈等有機物的不完全燃燒或在還原條件下經熱分解而生成，土壤是環境中pahs的最終去向。多環芳烴具有長期殘留性、生物蓄積性以及致癌、致畸、致突變的特性，由于高疏水性和高立體化學穩定性的特點，它極易在環境中累積并在食物鏈中進行富集，對人類的健康和生態環境的安全構成極大的威脅。環境中的pahs可通過呼吸道、皮膚、消化道進入人體，對肝、腎等臟器以及神經系統、生殖系統產生損害作用，且傷害人體免疫系統。因此，對pahs污染土壤的修復尤為重要。
3.微生物修復是一種低成本、高效益和環境友好的修復方法。然而，在實際應用中直接向污染土壤中投加游離微生物的修復方法，由于游離微生物難以適應復雜環境而不能有效發揮作用，導致游離微生物活性低，降解效果不理想。微生物固定化技術是微生物修復的一種，與游離微生物降解相比具有生物量高、不易流失和抗毒害能力強的優點，在pahs污染環境修復中受到廣泛關注。
4.生物炭是由農業廢棄物等生物質熱解產生的富碳固體，具有多孔結構和大的比表面積，有利于微生物附著生長并能夠抵御不良條件侵害。生物炭表面豐富的營養元素能為微生物生長提供營養。然而，有限的吸附能力限制了生物炭在實際中的應用。因此將改性生物炭作為固定化載體負載混合菌劑用于污染土壤中pahs修復是一種綠環保、且高效的修復技術。
技術實現要素：
5.本發明的首要目的在于提供一種改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑。
6.本發明的另一目的在于提供所述改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑的制備方法。
7.本發明的再一目的在于提供所述改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑的應用。
8.本發明的目的通過以下技術方案實現：
9.一種改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑，包括mno2改性生物炭、以及固定在mno2改性生物炭上的微生物菌，所述的微生物為惡臭假單胞菌(pseudomonas putida)和黃孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium burdsall)。
10.所述的mno2改性生物炭通過包括以下步驟的方法制備得到：將生物炭和mnso4加入
到水中充分混合，攪拌下再滴入kmno4溶液，混勻后靜置老化，過濾、洗滌、干燥，得到mno2改性生物炭。其中，kmno4溶液的濃度優選為10-20g/l；mnso4與kmno4的摩爾比優選為1.5:1；靜置老化的條件優選為室溫靜置24-48h；干燥的條件優選為80-90℃、7-9h。
11.所述的改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑的制備方法，包括以下步驟：將滅菌的mno2改性生物炭加入到滅菌的培養基中充分浸潤，加入黃孢原毛平革菌和惡臭假單胞菌進行培養，得到改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑。其中，培養基與改性生物炭的比例優選為1-2ml/g；浸潤的時間優選為10-15h；黃孢原毛平革菌和惡臭假單胞菌的加入比例優選為1:1。
12.進一步的，所述的改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑的制備方法中，以10％(w/w)的比例加入黃孢原毛平革菌懸液、惡臭假單胞菌懸液的混合菌懸濁液，適量補充培養基，在30℃條件下培養7-9d。其中，黃孢原毛平革菌懸液的密度優選為2
×
108cfu/ml，惡臭假單胞菌懸液的密度優選為2
×
108cfu/ml，黃孢原毛平革菌和惡臭假單胞菌的加入比例優選為1:1。
13.進一步的，所述的培養基的配方為：蔗糖4.0g/l，酵母膏0.3g/l，kh2po
4 0.05g/l，mgso4·
h2o 0.025g/l，(nh4)2hpo
4 0.2g/l，ph為7.1～7.2。
14.所述的改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑在降解多環芳烴中的應用。
15.所述的改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑在修復多環芳烴污染土壤中的應用。
16.進一步的，所述的多環芳烴包括萘、菲、芘。
17.本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
18.(1)本發明采用mno2改性生物炭，提高了生物炭比表面積和吸附能力，使微生物可附著面積增加。另外，二氧化錳可以作為金屬催化劑，提高生物炭對污染物的選擇性和去除能力。
19.(2)本發明采用mno2改性生物炭，提高了菌劑的保存時間，相比于游離菌劑，30d后mno2改性生物炭固定化菌劑的酶活性明顯更高。
20.(3)本發明采用mno2改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑對多環芳烴的降解率高，試驗60天對萘的降解率達到99.3％；對菲的降解率達到95.26％；對芘的降解率達到63.06％。
21.(4)產品無毒，對環境友好。
附圖說明
22.圖1為本發明實施例提供的一種mno2改性生物炭固定化菌劑的制備方法的流程圖。
23.圖2為本發明實施例中處理的土壤酶活性分析圖。
24.圖3為游離混合菌劑、mno2改性生物炭固定化混合菌劑對萘污染土壤的去除性能。
25.圖4為游離混合菌劑、mno2改性生物炭固定化混合菌劑對菲污染土壤的去除性能。
26.圖5為游離混合菌劑、mno2改性生物炭固定化混合菌劑對芘污染土壤的去除性能。
具體實施方式
27.以下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
28.下述實施例中所使用的惡臭假單胞菌(pseudomonas putida)372-24m(cgmcc 1.1003)購于中國普通微生物菌種保藏管理中心、黃孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium burdsall)bkmf-1767購于中國典型培養物保藏中心。
29.實施例1 mno2改性生物炭固定化混合菌劑的制備
30.一種mno2改性生物炭固定化菌劑的制備方法的流程如圖1所示，其具備包括以下步驟：
31.(1)mno2改性生物炭的制備
32.將2.0g木質生物炭c和0.2333g mnso4·
h2o放入燒杯中，并加入100ml去離子水混合，將該懸浮液超聲混合30min以確保兩者充分接觸。之后將燒杯放至磁力攪拌器上進行攪拌，將10ml去離子水溶解的kmno4(0.1454g)緩慢逐滴加入攪拌的懸浮液中，滴加過程中會發現黑的生物炭懸浮液中出現了暗棕沉淀，滴完之后再攪拌30min，然后將混合后的溶液于露天環境下靜置老化24h，老化后的上清液清澈透明。最后用去離子水進行過濾、洗滌、抽濾，將所得粉末在80℃下干燥8h，得到改性比為1:10的mno2改性生物炭mn-c(1:10)。
33.(2)mno2改性生物炭固定化混合菌劑的制備
34.配制固定化增殖培養基：稱取4.0g蔗糖、0.3g酵母膏、0.05g kh2po4、0.025g mgso4·
h2o、0.2g(nh4)2hpo4，溶解于1000ml蒸餾水中，調節ph為7.1～7.2，于121℃條件下滅菌20min。
35.稱取一定量實施例1制備的mno2改性生物炭于錐形瓶中進行滅菌，以1ml/g的比例加入滅菌后的固定化增殖培養基，浸潤12h。以10％(w/w)的比例加入黃孢原毛平革菌(真菌)和惡臭假單胞菌(細菌)懸液的混合菌懸濁液，黃孢原毛平革菌懸液密度為2
×
108cfu/ml，惡臭假單胞菌懸液密度為2
×
108cfu/ml，混合菌接種比例為1:1，適量補充增殖培養基，在培養箱中30℃培養7d，得到mno2改性生物炭固定化混合菌劑。將制備的固定化混合菌劑用去離子水洗滌三次，再懸浮在去離子水中。
36.實施例2 mno2改性生物炭固定化混合菌劑降解萘的性能
37.(一)模擬污染土壤的配制
38.于湖北省武漢市郊區取用農用土壤為供試土壤。選取具有代表性的pahs萘進行人工土壤染毒。配制一定濃度萘的丙酮溶液，加入土壤中，于通風櫥中每天進行翻堆攪拌，老化該土壤一到兩周，最終得到萘含量皆為20mg/kg的污染土壤。本實驗有三個處理組，分別在燒杯中加入200g污染土壤，每個處理組做3份平行實驗，加去離子水以保持土壤含水量50％。
39.(二)方法
40.三個處理組分別為空白組、加入50ml游離混合菌和50ml實施例2制備的mno2改性生物炭固定化混合菌劑(固定混合菌)，其中，兩種混合菌液中黃孢原毛平革菌的密度均為1
×
108cfu/ml，惡臭假單胞菌的密度均為1
×
108cfu/ml。在30℃黑暗環境中進行為期60d的降解試驗。培養30天時取樣部分土壤用于土壤酶活性檢測，結果如圖2所示。在第7、14、21、60天檢測土壤中萘的濃度，降解試驗結果如圖3所示。
41.通過比較三個處理組的酶活性，加入mno2改性生物炭固定化混合菌劑的處理組明顯較高，并且對萘的降解效果最好，試驗60d的降解率達到99.3％，表明采用mno2改性生物炭固定化混合菌劑可以有效提高混合菌在土壤中的活性，對土壤中的萘具有良好的降解效果。
42.實施例3 mno2改性生物炭固定化混合菌劑降解菲的性能
43.(一)模擬污染土壤的配制
44.于湖北省武漢市郊區取用農用土壤為供試土壤。選取具有代表性的pahs菲進行人工土壤染毒。配制一定濃度菲的丙酮溶液，加入土壤中，于通風櫥中每天進行翻堆攪拌，老化該土壤一到兩周，最終得到菲含量為40mg/kg的污染土壤。本實驗有三個處理組，分別在燒杯中加入200g污染土壤，每個處理組做3份平行實驗，加去離子水以保持土壤含水量50％。
45.(二)方法
46.三個處理組分別為空白組、加入50ml游離混合菌和50ml實施例2制備的mno2改性生物炭固定化混合菌劑(固定混合菌)，其中，兩種混合菌液中黃孢原毛平革菌的密度均為1
×
10
8c
fu/ml，惡臭假單胞菌的密度均為1
×
108cfu/ml。在30℃黑暗環境中進行為期60d的降解試驗，培養30天時取樣部分土壤用于土壤酶活性檢測，結果如圖2所示。在第7、14、21、60天檢測土壤中菲的濃度，結果如圖4所示。
47.通過比較三個處理組的酶活性，加入mno2改性生物炭固定化混合菌劑的處理組明顯較高，對菲的降解效果最好，試驗60d的降解率達到95.26％，表明mno2改性生物炭固定化混合菌劑可以有效提高混合菌在土壤中的活性，對土壤中的菲具有良好的降解效果。
48.實施例4 mno2改性生物炭固定化混合菌劑降解芘的性能
49.(一)模擬污染土壤的配制
50.于湖北省武漢市郊區取用農用土壤為供試土壤。選取具有代表性的pahs芘進行人工土壤染毒。配制一定濃度芘的丙酮溶液，加入土壤中，于通風櫥中每天進行翻堆攪拌，老化該土壤一到兩周，最終得到芘含量為60mg/kg的污染土壤。加去離子水以保持土壤含水量50％。本實驗有三個處理組，每在燒杯中加入200g污染土壤，每個處理組做3份平行實驗，加去離子水以保持土壤含水量50％。
51.(二)方法
52.三個處理組分別為空白組、加入50ml游離混合菌和50ml實施例2制備的mno2改性生物炭固定化混合菌劑(固定混合菌)，其中，兩種混合菌液中黃孢原毛平革菌的密度均為1
×
10
8c
fu/ml，惡臭假單胞菌的密度均為1
×
108cfu/ml。在30℃黑暗環境中進行為期60d的降解試驗，培養30天時取樣部分土壤用于土壤酶活性檢測，結果如圖2所示。在第7、14、21、60天檢測土壤中芘的濃度，結果如圖5所示。
53.通過比較三個處理組的酶活性，加入mno2改性生物炭固定化混合菌劑的處理組明顯較高，對芘的降解效果最好，試驗60d的降解率達到63.06％，表明mno2改性生物炭固定化混合菌劑可以有效提高混合菌在土壤中的活性，對土壤中芘具有良好的降解效果。
54.上述實施例2-4中的模擬土壤為萘、菲、芘三種污染物同時處理的土壤，分別分析了三種污染物的降解效果。
55.上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的
限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
技術特征：
1.一種改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑，其特征在于：包括mno2改性生物炭、以及固定在mno2改性生物炭上的微生物菌，所述的微生物為惡臭假單胞菌和黃孢原毛平革菌。2.根據權利要求1所述的改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑，其特征在于：所述的mno2改性生物炭通過包括以下步驟的方法制備得到：將生物炭和mnso4加入到水中充分混合，攪拌下再滴入kmno4溶液，混勻后靜置老化，過濾、洗滌、干燥，得到mno2改性生物炭。3.根據權利要求2所述的改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑，其特征在于：所述的kmno4溶液的濃度為10-20g/l。4.根據權利要求2所述的改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑，其特征在于：mnso4與kmno4的摩爾比為1.5:1。5.根據權利要求2所述的改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑，其特征在于：所述的靜置老化的條件為室溫靜置24-48h；所述的干燥的條件為80-90℃、7-9h。6.權利要求1-5任一項所述的改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：將滅菌的mno2改性生物炭加入到滅菌的培養基中充分浸潤，加入黃孢原毛平革菌和惡臭假單細胞菌進行培養，得到改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑。7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于：培養基與改性生物炭的比例為1-2ml/g；浸潤的時間為10-15h；黃孢原毛平革菌和惡臭假單細胞菌的加入比例為1:1。8.權利要求1-5任一項所述的改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑在降解多環芳烴中的應用。9.權利要求1-5任一項所述的改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑在修復多環芳烴污染土壤中的應用。10.根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于：所述的多環芳烴包括萘、菲、芘。
技術總結
本發明公開了一種改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑及其制備與應用，屬于環境污染生物處理技術領域。本發明的改性生物炭固定化多環芳烴降解混合菌劑包括MnO2改性生物炭、以及固定在MnO2改性生物炭上的微生物菌，所述的微生物為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium burdsall)。本發明的菌劑具有良好的生物活性，可實現對土壤中多環芳烴的高效降解。效降解。效降解。
