木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用
木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用
1.本技術(shù)是申請日為2020年5月25日、申請?zhí)枮?02010446988.x、發(fā)明名稱為“木犀草素及其衍生物在預(yù)防、高尿酸血癥及改善高尿酸導(dǎo)致的腎損傷藥物中的應(yīng)用”的發(fā)明專利的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
2.本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
3.據(jù)報道，我國高尿酸血癥(hyperuricemia，hua)患者約有1.2億(約占總?cè)丝诘?0％)，其中男性占19.4％，女性占7.9％。該病已成為繼高血壓、高血糖、高血脂這“三高”之后的第“四高”。尿酸是體內(nèi)嘌呤代謝的終產(chǎn)物，也是高尿酸血癥和痛風(fēng)發(fā)作的物質(zhì)基礎(chǔ)。人體內(nèi)尿酸的產(chǎn)生主要有2種途徑：一是通過攝入富含嘌呤類食物分解代謝產(chǎn)生(外源性)，占人體內(nèi)尿酸總量的20％；二是通過體內(nèi)核蛋白分解產(chǎn)生(內(nèi)源性)，占總量的80％。內(nèi)源或外源性嘌呤類物質(zhì)在黃嘌呤氧化酶的作用下生成次黃嘌呤，進一步生成尿酸，98％以鈉鹽形式存在。與其他哺乳動物相比，由于在進化過程中基因突變導(dǎo)致人類尿酸氧化酶缺失，無法將尿酸分解為可溶性化合物尿囊素，從而導(dǎo)致血中尿酸水平升高。生理條件下血漿尿酸鹽溶解的最大極限約417μmol/l(7mg/dl)(絕經(jīng)期前的女性約為360μmol/l)，并以此作為理化指標(biāo)來判斷高尿酸血癥。肝臟代謝尿酸生成增多、排泄減少均可導(dǎo)致高尿酸血癥。臨床研究顯示，90％的原發(fā)性高尿酸血癥屬于排泄不良型。
4.腎臟是尿酸排泄的主要器官，機體合成的尿酸2/3從腎臟排泄，1/3從腸道排泄。目前已發(fā)現(xiàn)多種轉(zhuǎn)運蛋白參與了腎臟近曲小管對尿酸鹽的轉(zhuǎn)運過程，分為重吸收蛋白和分泌蛋白兩大類，分布于近端腎小管上皮細胞頂膜和基底膜。尿酸重吸收蛋白包括：尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運體1(urat1)；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白9(glut9)；有機陰離子轉(zhuǎn)運體(oat)家族蛋白中的oat4、oat10。尿酸分泌蛋白包括：位于基底外側(cè)膜的oat1、oat2和oat3。尿液尿酸經(jīng)腎小管的尿酸重吸收蛋白重吸收入血，由分泌蛋白重新分泌入尿，最終排出體外。若尿酸重吸收增加或排泄減少，就會導(dǎo)致高尿酸血癥及其他相關(guān)的全身疾病。目前，臨床上高尿酸血癥的藥物主要有苯溴馬隆，別嘌呤醇，非布司他等，研究報道苯溴馬隆具有嚴重的肝、腎毒性，其他藥物也有不同程度的不良反應(yīng)。因此尋不良反應(yīng)小、安全有效的高尿酸血癥的藥物已成為該領(lǐng)域亟待解決的熱點問題。
5.木犀草素(luteolin)是一種天然黃酮類化合物，多以糖苷的形式存在于多種植物中，其中以全葉青蘭、野菊花、金銀花、紫蘇中含量較高。木犀草素和木犀草苷均具有顯著抗炎，抗氧化活性，且木犀草素的抗炎活性在一定程度上優(yōu)于木犀草苷。研究表明木犀草素具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化、抗氧化、抗微生物、抗糖尿病、神經(jīng)保護和抗過敏等多種作用。木犀草素對黃嘌呤氧化酶活性有抑制作用，并且可明顯降低高尿酸血癥模型小鼠的血清尿酸
水平。但是木犀草素能否通過調(diào)節(jié)尿酸轉(zhuǎn)運蛋白降尿酸改善腎損傷作用的研究目前尚未見報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
6.為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供木犀草素及其衍生物在預(yù)防、高尿酸血癥及改善高尿酸導(dǎo)致的腎損傷藥物中的應(yīng)用，建立高尿酸血癥腎損傷小鼠模型，確定木犀草素對高尿酸血癥及高尿酸導(dǎo)致的腎損傷的保護作用。
7.本發(fā)明的技術(shù)方案之一：木犀草素及其衍生物在預(yù)防、或改善高尿酸血癥藥物中的應(yīng)用。
8.進一步地，所述木犀草素及其衍生物通過抑制黃嘌呤氧化酶活性，降低血清尿酸水平，預(yù)防、或改善高尿酸血癥。
9.進一步地，所述木犀草素及其衍生物通過調(diào)節(jié)尿酸轉(zhuǎn)運蛋白表達水平，預(yù)防、或改善高尿酸血癥。
10.進一步地，所述木犀草素及其衍生物通過調(diào)節(jié)尿酸轉(zhuǎn)運蛋白abcg2，oct1，oct2，oat3，oat1的表達水平，降低血清尿酸水平，預(yù)防、或改善高尿酸血癥。
11.進一步地，所述木犀草素及其衍生物可制備成片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、口服液、懸浮劑、注射液，各種劑型中木犀草素的質(zhì)量占藥物總質(zhì)量的30％-60％。
12.本發(fā)明的技術(shù)方案之二：木犀草素及其衍生物在預(yù)防、或改善高尿酸導(dǎo)致的腎損傷藥物中的應(yīng)用。
13.進一步地，所述木犀草素及其衍生物通過抑制黃嘌呤氧化酶活性，降低血清尿酸水平，預(yù)防、或改善高尿酸導(dǎo)致的腎損傷。
14.進一步地，所述木犀草素及其衍生物通過調(diào)節(jié)尿酸轉(zhuǎn)運蛋白表達水平，預(yù)防、或改善高尿酸導(dǎo)致的腎損傷。
15.進一步地，所述木犀草素及其衍生物通過調(diào)節(jié)尿酸轉(zhuǎn)運蛋白abcg2，oct1，oct2，oat3，oat1的表達水平，預(yù)防、或改善高尿酸導(dǎo)致的腎損傷。
16.進一步地，所述木犀草素及其衍生物可制備成片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、口服液、懸浮劑、注射液，各種劑型中木犀草素的質(zhì)量占藥物總質(zhì)量的30％-60％。
17.本發(fā)明的有益效果是：
18.1.本發(fā)明確定了木犀草素及其衍生物可通過逆轉(zhuǎn)氧嗪酸鉀引起的黃嘌呤氧化酶活性升高，引起尿酸合成受阻從而降低血清及肝臟中的尿酸、血尿素氮水平和血清肌酐。
19.2.本發(fā)明首次確定了木犀草素及其衍生物可通過調(diào)節(jié)高尿酸小鼠尿酸轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的表達，促進尿酸排泄，減少尿酸重吸收，發(fā)揮降尿酸作用。
20.3.本發(fā)明還確定了木犀草素及其衍生物能減輕高尿酸引起的腎臟腫脹，逆轉(zhuǎn)高尿酸引起的腎臟損害，逆轉(zhuǎn)高尿酸引起的腎損傷因子kim-1蛋白表達升高，有腎臟保護功能，且對肝臟沒有損傷，無明顯毒副作用，療效確切，安全可控，價格低廉，可用于制備或改善高尿酸血癥、高尿酸導(dǎo)致的腎損傷藥物，根據(jù)需要按藥劑學(xué)的常規(guī)制備方法制成各類劑型，服用方便。
附圖說明
21.為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
22.圖1為實施例1中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠腎臟外觀的影響圖，其中，1-7分別代表溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組；
23.圖2為實施例1中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠腎臟指數(shù)的影響圖，其中，1-7分別代表溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組；
24.圖3為實施例2中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠血尿酸的影響圖，其中，1-7分別代表溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組；
25.圖4為實施例2中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠血尿素氮的影響圖，其中，1-7分別代表溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組；
26.圖5為實施例2中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠血肌酐的影響圖，其中，1-7分別代表溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組；
27.圖6為實施例3中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠腎臟組織病理學(xué)的影響圖；
28.圖7為實施例3中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響圖；
29.圖8為實施例4中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響圖，其中，1-7分別代表溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組；
30.圖9為實施例4中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠血清黃嘌呤氧化酶活性的影響圖，其中，1-7分別代表溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組；
31.圖10為實施例5中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運蛋白表達水平的影響圖，其中，1-7分別代表溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組；
32.圖11為實施例5中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠腎臟損傷因子蛋白表達水平的影響圖，其中，1-7分別代表溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組；
33.圖12為實施例6中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠24h尿液排泄量的影響圖，其中，1-7分別代表溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組；
34.圖13為實施例6中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠24h尿總蛋白排泄量的影響圖，其中，1-7分別代表溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組；
35.圖14為實施例6中木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠24h尿微量白蛋白排泄量的影
響圖，其中，1-7分別代表溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組。
具體實施方式
36.現(xiàn)詳細說明本發(fā)明的多種示例性實施方式，該詳細說明不應(yīng)認為是對本發(fā)明的限制，而應(yīng)理解為是對本發(fā)明的某些方面、特性和實施方案的更詳細的描述。應(yīng)理解本發(fā)明中所述的術(shù)語僅僅是為描述特別的實施方式，并非用于限制本發(fā)明。
37.另外，對于本發(fā)明中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為還具體公開了該范圍的上限和下限之間的每個中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨立地包括或排除在范圍內(nèi)。
38.除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的方法和材料，但是在本發(fā)明的實施或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說明書中提到的所有文獻通過引用并入，用以公開和描述與所述文獻相關(guān)的方法和/或材料。在與任何并入的文獻沖突時，以本說明書的內(nèi)容為準(zhǔn)。
39.在不背離本發(fā)明的范圍或精神的情況下，可對本發(fā)明說明書的具體實施方式做多種改進和變化，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。由本發(fā)明的說明書得到的其他實施方式對技術(shù)人員而言是顯而易見的。本發(fā)明說明書和實施例僅是示例性的。
40.以下實施例中通過收集小鼠尿液，檢測排尿量，試劑盒檢測血清尿酸、尿素氮、肌酐水平、尿總蛋白水平、尿微量白蛋白(mua)水平；通過蛋白免疫印跡、免疫組化檢測尿酸轉(zhuǎn)運蛋白、氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白、腎臟損傷因子水平；he染、免疫組化方法觀察肝、腎病理學(xué)變化，檢測木犀草素能否改善高尿酸血癥小鼠的腎損傷；通過試劑盒檢測高尿酸血癥小鼠的腎功能指標(biāo)、腎損傷指標(biāo)；通過western blot檢測高尿酸血癥小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運蛋白urat1，glut9，abcg2，oct1，oct2，oat3，oat1及腎損傷分子kim-1的表達水平。
41.實施例1
42.動物建模與分組給藥，具體步驟如下：
43.1.實驗動物
44.spf級icr雄性小鼠70只，隨機分為7組，每組10只，體重22
±
2g，購自湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心，合格證號：no.42000900000308。小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水、飲食，室溫(25
±
2)℃，相對濕度50％-70％。
45.2.藥物與試劑
46.氧嗪酸鉀鹽(sigma)；次黃嘌呤(sigma)；苯溴馬隆(宜昌長江藥業(yè)有限公司)；非布司他(華中海威)；木犀草素(寶雞辰光)。
47.3.實驗方法
48.3.1高尿酸血癥動物模型的建立、給藥與取材方法
49.spf級icr雄性小鼠70只，分為7組，每組10只，分別為溶劑對照組，模型組，陽對照組：苯溴馬隆組(20mg/kg)、非布司他組(10mg/kg)，木犀草素低、中、高劑量組(10，30，90mg/kg)。第1-7天每天18:00灌胃給藥，溶劑對照組、模型組、陽對照組灌胃給予生理
鹽水，木犀草素低、中、高劑量組灌胃給藥；從第8天開始，每天12:00，溶劑對照組腹腔注射給予生理鹽水，模型組、苯溴馬隆組、非布司他組、木犀草素低、中、高劑量組均腹腔注射給予上述氧嗪酸鉀與次黃嘌呤混合溶液(其中氧嗪酸鉀與次黃嘌呤各300mg/kg)；同時，每天18:00溶劑對照組和模型組灌胃給予生理鹽水，其他各組分別灌胃相應(yīng)藥物，連續(xù)7天；在收集尿液前將小鼠放入代謝籠中提前適應(yīng)48h，收集末次小鼠灌胃給藥前24h的小鼠尿液。在末次小鼠灌胃給藥前12h禁食，自由飲水，在末次灌胃給藥2h后，摘眼球取血，4000rpm，4℃離心10min，取上清液用于檢測血清尿酸、肌酐、尿素氮水平及黃嘌呤氧化酶活性。采血后頸部脫臼處死小鼠，用預(yù)冷的生理鹽水進行心臟灌流，將肝臟腎臟中的血液排除干凈。冰上取兩小塊肝臟，一塊迅速置于ep管中冰浴，用于制備肝組織勻漿液。另一塊肝臟固定于4％多聚甲醛溶液，用于觀察肝臟病理學(xué)變化。取下兩腎，拍照并稱重，計算腎臟指數(shù)。腎臟指數(shù)計算公式如下：
50.腎臟指數(shù)(％)＝雙腎重量(g)*100/體重(g)
51.其中一腎剝外膜，縱切成兩份，置4％多聚甲醛中固定，用于組織病理學(xué)檢查。另外一腎縱切成兩份，分別置2ml已標(biāo)記的ep管中，一份置-80℃冰箱保存，一份投入液氮中保存。所有操作均在冰上進行。上述各組灌胃、腹腔注射生理鹽水及給藥均按照0.4ml/20g進行。
52.4.實驗結(jié)果
53.圖1中，1-7分別是溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組的小鼠腎臟外觀圖。由圖中可以看出，模型組、苯溴馬隆組和非布司他組小鼠腎臟明顯腫脹，隨著木犀草素劑量增加小鼠腎臟腫脹減輕，腎臟顏也逐漸恢復(fù)。
54.圖2為溶劑對照組，模型組，苯溴馬隆組，非布司他組，木犀草素低劑量組，木犀草素中劑量組，木犀草素高劑量組的小鼠腎臟指數(shù)圖，由圖中可以看出，模型組和苯溴馬隆組小鼠腎臟指數(shù)明顯增高，隨著木犀草素劑量增加小鼠腎臟指數(shù)明顯降低、趨于正常。
55.結(jié)論：木犀草素能減輕高尿酸血癥引起的腎臟腫脹。
56.實施例2
57.對實施例1取到的血清進行血清尿酸、肌酐、尿素氮水平檢測
58.1.藥物與試劑
59.尿酸、肌酐、尿素氮檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所，貨號分別為c012-2、c011-1、c013-2。
60.2.實驗方法
61.將上述離心取得的血清置于冰上，分別按照南京建成試劑盒說明書檢測小鼠血清尿酸、血清肌酐、血清尿素氮水平。
62.3.實驗結(jié)果
63.3.1木犀草素能明顯降低hua小鼠的血清尿酸水平
64.圖3為木犀草素對高尿酸血癥模型小鼠血尿酸的影響，由圖中可以看出，與溶劑對照組比較，模型組小鼠血清尿酸水平具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，提示造模成功。與模型組比較，苯溴馬隆組能降低hua小鼠血清尿酸水平；非布司他組能顯著降低hua小鼠血清尿酸水平，且他們的降尿酸效果與木犀草素比較無統(tǒng)計學(xué)意義；低、中、高劑量木犀草素組均能顯
著降低血清尿酸水平，且呈劑量依賴性。
65.3.2木犀草素能明顯降低hua小鼠血清肌酐和尿素氮水平
66.由圖4和圖5可以看出，與溶劑對照組比較，模型組血尿素氮水平和血清肌酐顯著升高。與模型組比較，苯溴馬隆組、非布司他組和低、中、高劑量木犀草素組均能顯著降低hua小鼠的血尿素氮水平和血清肌酐。
67.結(jié)論：木犀草素能降低高尿酸血癥小鼠尿酸水平，血尿素氮水平和血清肌酐，減輕高尿酸血癥及高尿酸引起的腎臟損傷。
68.實施例3對實施例1取到的腎臟和肝臟進行組織病理學(xué)檢查
69.1.藥物與試劑
70.蘇木素-伊紅(he)染試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號為c0105。
71.2.實驗方法
72.小鼠的腎臟和肝臟組織放入4％多聚甲醛固定液固定24h后，于組織包埋機中進行脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋。采用輪轉(zhuǎn)式切片機連續(xù)切片(3-4μm厚度)，he染，經(jīng)脫蠟、水洗、分化、返藍、伊紅染、脫水、透明和封片之后，在顯微鏡下觀察腎臟和肝臟組織的病理學(xué)變化。
73.3.實驗結(jié)果
74.3.1木犀草素能逆轉(zhuǎn)高尿酸引起的腎臟損害
75.如圖6所示，小鼠腎臟he染結(jié)果顯示：模型對照組、苯溴馬隆組、非布司他組均出現(xiàn)腎小管擴張和腎小管上皮萎縮(圖中黑箭頭代表腎小管擴張，紅箭頭代表腎小管上皮萎縮)，而木犀草素中、高劑量組與溶劑對照組比較無顯著性差異。
76.結(jié)論：木犀草素能逆轉(zhuǎn)高尿酸引起的腎臟損害。
77.3.2木犀草素對肝臟基本無影響
78.如圖7所示，模型對照組肝細胞形態(tài)與溶劑對照組相近。與模型對照組比較，苯溴馬隆組出現(xiàn)明顯的肝細胞高度水腫，肝竇消失及部分細胞壞死，這與文獻中報道的苯溴馬隆存在嚴重的肝毒性的結(jié)論相一致。非布司他和木犀草素各組均未出現(xiàn)明顯肝臟損傷。
79.實施例4對實施例1取到的血清和肝臟進行黃嘌呤氧化酶活性檢測
80.1.藥物與試劑
81.黃嘌呤氧化酶試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號為a002-1-1。
82.2.實驗方法
83.采用黃嘌呤氧化酶檢測試劑盒，按其使用說明書操作步驟進行測定。取小鼠肝組織約0.1g，根據(jù)黃嘌呤氧化酶檢測試劑盒要求加入0.9ml的生理鹽水，在冰浴中以眼科剪刀迅速剪碎、勻漿，勻漿機開至第6檔，勻漿3次，每次停10s。16000g，4℃離心10min，取上清液用于檢測肝臟黃嘌呤氧化酶活性。血清中黃嘌呤氧化酶活性亦根據(jù)上述黃嘌呤氧化酶檢測試劑盒要求進行檢測。
84.3.實驗結(jié)果
85.3.1木犀草素能逆轉(zhuǎn)高尿酸引起的黃嘌呤氧化酶活性升高
86.如圖8所示，與模型對照組比較，非布司他和木犀草素各組的肝臟黃嘌呤氧化酶活性具有統(tǒng)計學(xué)意義，檢測結(jié)果顯示非布司他組的該酶活性與溶劑對照組無明顯差異，這與非布司他降尿酸的作用原理相一致，即非布司他作為一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，它可使該
酶活性喪失引起尿酸合成受阻從而消除高尿酸血癥。木犀草素各組的該酶活性與模型組相比，也均有所降低，且呈劑量依賴性。同時，我們對血清中的黃嘌呤氧化酶活性進行了檢測，結(jié)果如圖9所示，圖中顯示血清中黃嘌呤氧化酶活性變化趨勢與肝臟中基本一致。
87.結(jié)論：木犀草素能逆轉(zhuǎn)氧嗪酸鉀引起的黃嘌呤氧化酶活性升高。
88.實施例5對實施例1取到的腎臟進行腎臟尿酸轉(zhuǎn)運蛋白urat1，glut9，abcg2，oct1，oct2，oat3，oat1的表達水平、腎損傷因子kim-1表達水平的檢測
89.1.藥物與試劑
90.ripabuffer(cell signaling technology，9806s)；cocktail(amresco，3235c020)；bca試劑盒(thermo scientific，pl212739)；預(yù)染蛋白marker(普利萊基因技術(shù)有限公司，p1103)；β-actin(cell signaling，#4970)；urat1(abbiotec，250521)；glut9(thermo fisher scientific，pa5-22966)；abcg2，oat3，oct1(biosynthesis biotechnology,bs-0662r,bs-0609r,bs-20814r)及oat1，oct2(abcam,ab135924,ab170871)；goat anti-rabbit igg h&amp；l(hrp)(abcam，ab97051)；superecl plus(普利萊基因技術(shù)有限公司，p1010)
91.2.實驗方法
92.按照每100mg組織加入1000μl裂解液(10μl cocktail和990μl ripa)。冰上眼科剪將組織迅速剪碎、勻漿3次，每次停10s，之后超聲10下，冰浴中放置30min。12000g，4℃離心20min，取上清至新的ep管中，即得到組織總蛋白產(chǎn)物。10倍稀釋蛋白樣品，bca法進行蛋白濃度測定。蒸餾水調(diào)平各組蛋白濃度，加入2
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loading buffer(含2％β-巰基乙醇)混勻，封口膜密封，沸水中煮10min，之后冰浴5min。根據(jù)蛋白濃度和每次電泳需要的蛋白量進行分裝，-80℃儲存。取等量的蛋白樣品(約30μg)經(jīng)sds-page電泳分開后，按照免疫印跡的方法將蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜上。用含5％脫脂奶粉的封閉液將膜在室溫，搖床上封閉2h。用tbst清洗封閉液，然后孵育一抗，一抗稀釋比例為urat1(1:800)，glut9(1:2000)，abcg2(1:2000)，oat1(1:2000)，oat3(1:500)，oct1(1:500)，oct2(1:2000)，kim-1(1:2000)和內(nèi)參β-actin(1:2000)，在室溫下?lián)u床孵育2h，tbst緩沖液洗膜三次，每次10min，換為對應(yīng)的辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的二抗標(biāo)記(1:10000)進行孵育，室溫孵育1.5h，tbst緩沖液洗膜三次，每次10min。然后取化學(xué)發(fā)光底物試劑盒中的a、b兩種試劑各300μl，混勻后迅速蓋上pvdf膜，膜上發(fā)光，顯影，最后用imagequant las4000凝膠成像儀進行光密度值分析。
93.3.實驗結(jié)果
94.3.1木犀草素能顯著上調(diào)hua小鼠腎臟oat3、oct2和abcg2的蛋白表達，并且能夠逆轉(zhuǎn)高尿酸引起的腎損傷因子kim-1蛋白表達升高
95.如圖10所示，與溶劑對照組相比，模型組尿酸分泌蛋白表達量明顯降低。模型組尿酸排泄障礙導(dǎo)致高尿酸血癥，與血尿酸檢測結(jié)果一致。與模型組相比，木犀草素組abcg2，oct2，oat3尿酸分泌蛋白表達量明顯升高，并具有劑量依耐性，而對oct1，oat1表達量有微弱的上調(diào)。苯溴馬隆組能上調(diào)abcg2，oct1，oct2，oat1和oat3蛋白表達水平。非布司他能明顯上調(diào)oat3蛋白表達水平。而木犀草素組對urat1和glut9尿酸重吸收蛋白表達水平影響不明顯。
96.結(jié)論：木犀草素能顯著上調(diào)hua小鼠腎臟oat3、oct2和abcg2的促尿酸分泌轉(zhuǎn)運蛋白表達水平，促進尿酸排泄。
97.如圖11所示，與溶劑對照組相比，模型組腎損傷因子kim-1蛋白表達量明顯升高。而木犀草素組能夠逆轉(zhuǎn)高尿酸引起的腎損傷因子kim-1蛋白表達升高。
98.結(jié)論：木犀草素能夠逆轉(zhuǎn)高尿酸引起的腎損傷因子kim-1蛋白表達升高，緩解高尿酸引起的小鼠腎臟損傷。
99.實施例6對實施例1取到的尿液進行尿總蛋白和尿微量白蛋白的檢測
100.1.藥物與試劑
101.小鼠微量白蛋白尿(microalbuminuria,mau)elisa試劑盒(武漢新啟迪生物科技有限公司，pl212739)；bca試劑盒(thermo scientific，pl212739)
102.2.實驗方法
103.對實施例1收集到的尿液，16000g，4℃離心10min，取上清，根據(jù)上述小鼠尿微量白蛋白(mau)elisa試劑盒要求進行檢測小鼠尿微量白蛋白。根據(jù)上述bca試劑盒要求進行檢測小鼠尿總蛋白濃度。再根據(jù)24h尿液排泄量計算出24總蛋白和微量白蛋白排泄量。
104.3.實驗結(jié)果
105.3.1高尿酸血癥小鼠24h尿液、總蛋白、微量白蛋白排泄量明顯增加，木犀草素能顯著減少hua小鼠24h尿液、總蛋白和微量白蛋白排泄量。
106.如圖12，13，14所示，與溶劑對照組相比，模型組24h尿液、總蛋白、微量白蛋白排泄量明顯增多。而木犀草素組能夠逆轉(zhuǎn)高尿酸引起的24h尿液、總蛋白、微量白蛋白排泄量明顯增多。
107.結(jié)論：木犀草素能緩解高尿酸引起的小鼠腎臟損傷。
108.本發(fā)明以次黃嘌呤和氧嗪酸鉀的混合溶液對小鼠進行腹腔注射，建立小鼠高尿酸血癥模型，氧嗪酸鉀是一種尿酸酶抑制劑，通過抑制尿酸酶從而抑制尿酸在體內(nèi)的分解誘發(fā)高尿酸血癥。次黃嘌呤經(jīng)黃嘌呤氧化酶催化可最終轉(zhuǎn)化尿酸。陽性對照藥物苯溴馬隆通過阻斷近曲腎小管對尿酸的重吸收，從而促進尿酸的排泄；非布司他是一種口服的非嘌呤選擇性黃嘌呤氧化酶抑制劑,通過抑制黃嘌呤氧化酶活性，使尿酸生成減少，具有良好的降低血清尿酸作用。
109.腎臟是尿酸排泄的主要器官，hua是尿酸排泄減少所引起的細胞外液尿酸鹽超飽和狀態(tài)。尿酸排泄需多種表達于腎小管上皮細胞的尿酸重吸收蛋白和分泌蛋白共同協(xié)調(diào)完成，這些轉(zhuǎn)運蛋白是腎臟調(diào)節(jié)和保持體內(nèi)尿酸水平穩(wěn)定的關(guān)鍵，也是多種內(nèi)源性和外源性降尿酸物質(zhì)的作用靶點。本發(fā)明通過以尿酸轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白為靶點探索木犀草素降尿酸作用機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木犀草素具有顯著的、抑制黃嘌呤氧化酶活性減少尿酸生成、促進尿酸排泄，且可以通過調(diào)節(jié)尿酸轉(zhuǎn)運蛋白abcg2，oct1，oct2，oat3，oat1的表達水平，預(yù)防、或改善高尿酸血癥及高尿酸導(dǎo)致的腎損傷。并且木犀草素為純植物提取活性成分，具有毒副作用小，療效確切，安全可控，價格低廉等優(yōu)點，可將木犀草素開發(fā)為新的降尿酸并改善高尿酸腎損傷的藥物及健康產(chǎn)品，具有好的應(yīng)用前景。
110.實施例7將木犀草素制備成片劑
111.取木犀草素，加入淀粉等片劑常規(guī)輔料，研磨混合過篩，干法制粒，整粒，壓制成片劑，其中木犀草素質(zhì)量占藥物總質(zhì)量的30％。
112.實施例8將木犀草素制備成膠囊劑
113.取木犀草素，加入淀粉、乳糖等膠囊劑常規(guī)輔料，混勻，過篩，灌裝制備成膠囊劑，
其中木犀草素質(zhì)量占藥物總質(zhì)量的60％。
114.實施例9將木犀草素衍生物：木犀草素苷，制備成顆粒劑
115.取木犀草素苷，加入淀粉、糖粉、硬脂酸鎂等顆粒劑常規(guī)輔料，混勻，過篩，干法制粒，整粒制備成顆粒劑，其中木犀草素衍生物質(zhì)量占藥物總質(zhì)量的50％。
116.實施例10將木犀草素制備成注射劑
117.取木犀草素，加入甘露醇、注射用水等制備注射劑的常規(guī)輔料，按照常規(guī)注射劑的生產(chǎn)方法制備得到注射液，其中木犀草素質(zhì)量占藥物總質(zhì)量的40％。
118.以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
技術(shù)特征：
1.木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物用于上調(diào)所述尿酸分泌蛋白的表達水平，并逆轉(zhuǎn)所述腎損傷因子的表達升高。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述尿酸分泌蛋白包括abcg2、oct1、oct2、oat3、oat1。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述腎損傷因子為kim-1。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物對abcg2、oct2、oat3的蛋白表達水平的上調(diào)程度大于對oct1、oat1的蛋白表達水平的上調(diào)程度。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物對abcg2、oct2、oat3的蛋白表達水平的上調(diào)具有劑量依賴性。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物的使用劑量為10～90mg/kg。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物通過上調(diào)所述尿酸分泌蛋白的表達水平，能夠促進尿酸排泄，預(yù)防、或改善高尿酸血癥。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物通過逆轉(zhuǎn)所述腎損傷因子的表達升高，能夠緩解腎臟損傷。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物的質(zhì)量占所述藥物總質(zhì)量的30％～60％。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述藥物為片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、口服液、懸浮劑、注射液中的一種。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了木犀草素及其衍生物在調(diào)節(jié)尿酸分泌蛋白及腎損傷因子表達水平的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明研究確定了木犀草素及其衍生物能夠上調(diào)尿酸分泌蛋白的表達水平，并逆轉(zhuǎn)腎損傷因子的表達升高，從而起到促進尿酸排泄、緩解腎臟損傷的作用，不僅為木犀草素及其衍生物提供了新的用途，也為高尿酸血癥及高尿酸導(dǎo)致的腎損傷的預(yù)防、、改善提供了新的藥物選擇。且木犀草素及其衍生物的成分無明顯毒副作用，療效確切，安全可控，價廉易得。價廉易得。價廉易得。
