ACE2改造蛋白及其應用
ace2改造蛋白及其應用
技術領域：
1.本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及針對新型冠狀病毒具有中和效果的類抗體蛋白技術領域。
背景技術：
2.新冠肺炎疫情(covid-19)對人類健康和全球公共衛生安全造成重大威脅，其病原體為sars-cov-2，是21世紀以來引起人類傳染病疫情的第三種冠狀病毒。目前，雖然已有多種針對sars-cov-2的疫苗和單克隆抗體藥物獲得緊急使用許可，但是多數研究表明它們對當下廣泛傳播的新冠病毒變異毒株(如英國株n501y.v1、南非株n501y.v2和巴西株n501y.v3等)的保護效果降低。此外，大量研究數據表明蝙蝠等動物攜帶多種新冠相關冠狀病毒或sars樣冠狀病毒，如蝙蝠源ratg13及穿山甲源gx/p2v/2017和gd/1/2019，目前的研究結果顯示這三種病毒也可以利用血管緊張素轉化酶2(ace2)作為受體，提示它們存在感染人的潛力，因而亟需研發針對當下新冠變異毒株及未來可能出現的新的sars樣冠狀病毒疫情的廣譜藥物或疫苗，這不僅是當前covid-19疫情下，國家乃至全球的重大需求，也是關系到全球人類健康(one health)的重要舉措。
3.ace2屬于腎素-血管緊張素系統成員，通過調節血壓及電解質的平衡維持心血管、腎臟及呼吸系統的功能，此外作為sars-cov、sars-cov-2等病毒的受體介導病毒入侵。研究發現，外源性ace2重組蛋白(race2)可與內源性ace2競爭結合sars-cov和sars-cov-2，進而抑制病毒感染。臨床試驗發現race2在健康人和嚴重呼吸窘迫綜合癥患者(ards)身上是安全的。這些研究結果表明，對于以ace2為受體的冠狀病毒而言，race2是一種潛在的大分子藥物，因而設計開發高效race2具有潛在的臨床應用價值。目前，雖有多款race2被報道用于抑制sars-cov、sars-cov-2感染，其中兩款進入臨床前準備階段，一款進入臨床ⅱ期，但是它們對當下流行的新冠變異毒株的效果是未知的。
技術實現要素：
4.有鑒于此，本發明提供了一種ace2改造蛋白在制備和/或預防以ace2為受體的sars樣冠狀病毒引發疾病的藥物中的應用或在制備預防以ace2為受體的sars樣冠狀病毒感染的疫苗中的應用。
5.在本發明的一些具體實施方案中，所述以ace2為受體的sars樣冠狀病毒為sars-cov-2原始毒株和/或sars-cov-2變異毒株和/或新冠相關冠狀病毒等。
6.在本發明的一些具體實施方案中，所述的改造蛋白為hace2-hfc-m4-1改造蛋白，其基因序列如序列列表seq id no.5所示或氨基酸序列如序列列表seq id no.6所示。
7.在本發明的一些具體實施方案中，所述的改造蛋白為hace2-hfc-m4-2改造蛋白，其基因序列如序列列表seq id no.7所示或氨基酸序列如序列列表seq id no.8所示。
8.在本發明的一些具體實施方案中，所述的改造蛋白為hace2-hfc-m5改造蛋白，其基因序列如序列列表seq id no.9所示或氨基酸序列如序列列表seq id no.10所示。
9.在本發明的一些具體實施方案中，所述的sars-cov-2原始毒株為sars-cov-2wt。
10.在本發明的一些具體實施方案中，所述的sars-cov-2變異毒株為英國株n501y.v1、南非株n501y.v2或巴西株n501y.v3。
11.在本發明的一些具體實施方案中，所述的sars-cov-2變異毒株為水貂流行株y453f、水貂流行株f486l或水貂流行株n501t。
12.本發明的hace2改造片段與hfc的改造蛋白為類抗體蛋白，能夠用于由新冠病毒原始毒株及變異毒株引起的疾病，可以廣泛應用于由以ace2為受體的新冠相關冠狀病毒或sars樣冠狀病毒引起的疾病。
附圖說明
13.圖1.sars-cov-2rbd與人ace2復合物結構圖。
具體實施方式
14.基于此，發明人設計并篩選出了高效人ace2重組蛋白，具有廣譜中和sars-cov-2原始毒株及多種變異毒株的能力，同時排除了因ace2自身的酶活效應帶來的副作用，表明其可作為針對現有的或未來出現的新的新冠病毒變異毒株及將來可能出現的新的sars樣冠狀病毒的一種潛在廣譜大分子藥物。
15.首先，根據sars-cov-2刺突蛋白受體結合區域(rbd)和人ace2(hace2)復合物結構(圖1)，發現ace2上參與rbd相互作用的氨基酸多為疏水性或帶電氨基酸，因而發明人選取了一系列位點進行突變，以增強其疏水性或電性，同時，將其與人igg1的fc段(hfc)融合表達，最終形成一系列hace2-hfc突變體。然后，通過測定這些hace2-hfc突變體與sars-cov-2原始毒株(sars-cov-2wt)rbd的親和力，篩選出親和力增強的hace2-hfc突變體，再將這些突變體進行組合，最終形成具有更強親和力的組合突變體，包括t27f、k31y、l79w和n330y這四個位點。
16.此外，由于ace2在調節血壓及電解質的平衡中發揮著重要作用，為了排除過多的外源性ace2蛋白可能導致的血壓過度調節等副作用，根據文獻報道，又將控制酶活性的關鍵氨基酸r273進行突變(r273q)，以破壞其酶活功能，但不影響結合sars-cov-2，下文稱為hace2-hfc-m4-1(包括t27f、k31y、n330y和r273q四個突變位點)、hace2-hfc-m4-2(包括t27f、l79w、n330y和r273q四個突變位點)和hace2-hfc-m5(包括t27f、k31y、l79w、n330y和r273q五個突變位點)，它們的編碼序列及氨基酸序列分別為seq id no.5-10。
17.表達純化獲得hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2和hace2-hfc-m5蛋白后，通過測定其與新冠病毒原始毒株及多種變異毒株rbd的親和力，其中變異毒株包括英國株n501y.v1、南非株n501y.v2、巴西株n501y.v3及三種水貂流行株y453f、f486l和n501t株，相比于野生型hace2-hfc(hace2-hfc-wt)，發現hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2結合新冠病毒原始毒株及變異毒株rbd的能力均增強(表1)，并且二者結合sars-cov-2wt和水貂流行株y453f株的能力相似，結合其他變異毒株的能力存在一定的差異，因而發明人又將hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2進行組合，形成hace2-hfc-m5。
18.hace2-hfc-m5結合新冠病毒原始毒株及變異毒株rbd是hace2-hfc-wt的3.7～29.5倍，并且略高于hace2-hfc-m4-1和hace2-hfc-m4-2，其結合變異毒株(水貂流行株
y486l株除外)的能力高于sars-cov-2wt(表1)。
19.相比于hace2-hfc-wt，hace2-hfc-m4-1和hace2-hfc-m4-2中和sars-cov-2原始毒株及變異毒株假病毒的能力均明顯提高，分別提高8.3～104.1倍和6.5～44.6倍，尤其中和南非株501y.v2和巴西株501y.v3最為明顯(表2)。hace2-hfc-m5中和新冠病毒原始毒株及變異毒株假病毒是hace2-hfc-wt的8.7～126倍，整體上高于或相似于hace2-hfc-m4-1和hace2-hfc-m4-2，尤其中和南非株501y.v2和巴西株501y.v3的能力進一步提高(表2)，這與親和力的結果是相符的。
20.當新冠病毒侵染人體細胞時，本發明的hace2改造蛋白優先識別并結合病毒，再加上融合了人igg1 fc段，從而形成了hace2-hfc類抗體蛋白，進一步降低了半衰期，延長了中和病毒的能力。
21.本發明的三種hace2改造片段的hfc融合蛋白特別適用于對新冠病毒突變株，例如英國株、巴西株、南非株及水貂流行株的或預防，推測對以ace2為受體的新冠相關冠狀病毒或sars樣冠狀病毒及未來出現的新的變異毒株也有作用，具有潛在的廣泛應用價值。
22.本發明的hace2改造蛋白可以通過本領域常規使用的方法得到。首先，將野生型hace2氨基酸編碼序列與hfc編碼序列無縫連接構建至pcaggs表達載體上，形成pcaggs-hace2-hfc，然后在此基礎上進行氨基酸位點定點突變，進而得到hace2改造蛋白的表達質粒，pcaggs-hace2-hfc-m4-1，pcaggs-hace2-hfc-m4-2，pcaggs-hace2-hfc-m5。
23.實施例1
24.hace2-hfc改造蛋白的獲得
25.首先，將編碼野生型hace2蛋白的基因序列(序列如序列表seq id no.1所示)與編碼人igg1 fc段蛋白基因(序列如序列表seq id no.2所示)連接，將得到的序列人工合成(由蘇州金唯智提供合成服務)，得到野生型hace2-hfc融合蛋白基因(序列如序列表seq id no.3)，并將該融合蛋白基因克隆到pcaggs真核細胞表達載體上，得到野生型hace2-hfc融合蛋白的表達載體pcaggs-hace2-hfc，再通過氨基酸定點突變的方法將第27位氨基酸t突變成氨基酸f，第31位氨基酸k突變成氨基酸y，第79位氨基酸l突變成氨基酸w，第330位氨基酸n突變成氨基酸y，第273位氨基酸r突變成氨基酸q，得到pcaggs-hace2-hfc-m4-1載體(包含突變位點t27f、k31y、n330y和r273q，基因序列如序列表seq id no.5所示)、pcaggs-hace2-hfc-m4-2載體(包含突變位點t27f、l79w、n330y和r273q，基因序列如序列表seq id no.7所示)、pcaggs-hace2-hfc-m5載體(包含突變位點t27f、k31y、l79w、n330y和r273q，基因序列如序列表seq id no.9所示)。
26.使用pcaggs-hace2-hfc載體和pcaggs-hace2-hfc-m4-1，pcaggs-hace2-hfc-m4-2，pcaggs-hace2-hfc-m5載體表達并純化，分別得到了hace2-hfc-wt融合蛋白(氨基酸序列如序列表seq id no.4所示)，hace2-hfc-m4-1改造蛋白(氨基酸序列如序列表seq id no.6所示)，hace2-hfc-m4-2改造蛋白(氨基酸序列如序列表seq id no.8所示)，hace2-hfc-m5改造蛋白(氨基酸序列如序列表seq id no.10所示)。
27.氨基酸定點突變的方法：
28.通過設計引物將野生型hace2基因特定位點氨基酸突變成目標氨基酸，然后經pcr擴增出突變后的目的片段，然后目的片段與線性化的載體pcaggs進行同源重組，最終形成含有目的片段的環狀載體，并經序列測序正確后，方可用于后續目的蛋白的表達。
29.突變位點包括：將第27位氨基酸t密碼子(aca)突變為氨基酸f密碼子(ttt)，第31位氨基酸k密碼子(aag)突變成氨基酸y密碼子(tac)，第79位氨基酸l密碼子(ctt)突變成氨基酸w密碼子(tgg)，第330位氨基酸n密碼子(aat)突變成氨基酸y密碼子(tat)，第273位氨基酸r密碼子(aga)突變成氨基酸q密碼子(cag)。
30.表達純化的方法：
31.將重組好的目的質粒轉染至hek293f細胞中，細胞密度約為2
×
106/ml。轉染后5-7天收集細胞上清，離心過濾，經蠕動泵將含有hace2-hfc-wt，hace2-hfc-m4-1，hace2-hfc-m4-2，hace2-hfc-m5改造蛋白的細胞上清在4℃環境下經過protein a親和層析柱，使改造蛋白與親和層析柱充分結合。用結合緩沖液(20mm na3hpo4，ph8.0)洗脫雜蛋白，用洗脫液(0.1m glycine，ph3.0)洗脫改造蛋白，蛋白收集管里預先加入1m tris-hcl(ph9.0)緩沖液，防止蛋白在過酸的環境下失活，最后經分子篩將蛋白換液至pbs緩沖液中。
32.實施例2
33.hace2改造蛋白與新冠病毒突變株的rbd的親和力
34.發明人利用表面等離子共振技術(spr)，檢測了sars-cov-2原始毒株(sars-cov-2wt)及變異毒株(英國株501y.v1、南非株501y.v2、巴西株501y.v3、水貂流行453f株、水貂流行486l株、水貂流行n501t株)的rbd分別與hace2-hfc-wt、hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2、hace2-hfc-m5改造蛋白的親和力。
35.儀器與材料：
36.rbd蛋白：sars-cov-2原始毒株、英國株501y.v1、南非株501y.v2、巴西株501y.v3、水貂流行y453f株、水貂流行f486l株、水貂流行n501t株的rbd蛋白均由申請人實驗室表達純化。
37.設備：biacore 8k，cm5芯片(ge healthcare)
38.具體實驗步驟如下：
39.a.芯片預處理：將識別human igg1 fc的二抗利用氨基偶聯的方式固定在cm5芯片表面。cm5芯片共有8個通道，每個通道中包含兩個flow cell(fc 1和2)，fc 2注射流動相蛋白樣品，fc 1作為對照。
40.b.進樣：首先用運行緩沖液(20mm hepes,150mm nacl,0.005％(vol/vol)tween 20,ph 7.4)稀釋樣品，此實驗樣品含有不同突變株的rbd。
41.c.芯片再生：用再生緩沖液(10mm glycine,ph 1.5)對芯片進行再生。
42.d.數據分析：用biacore 8k評價軟件對數據進行分析，得出結合常數ka，解離常數kd及平衡解離常數kd。
43.表1.ace2改造蛋白與野生型蛋白親和力對比數據表
44.[0045][0046]
結果顯示，與野生型hace2-hfc(hace2-hfc-wt)相比，發現三種hace2改造蛋白(hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2和hace2-hfc-m5)結合新冠病毒原始毒株及變異毒株rbd的能力均增強，尤其是hace2-hfc-m5提高最為顯著。
[0047]
實施例3
[0048]
hace2-hfc改造蛋白的中和作用
[0049]
測定了hace2-hfc-wt，hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2、hace2-hfc-m5改造蛋白在vero e6細胞中對sars-cov-2原始毒株(sars-cov-2wt)及變異毒株(包括英國株n501y.v1、南非株n501y.v2、巴西株n501y.v3及水貂流行株y453f、水貂流行株f486l和水貂流行株n501t)假病毒的中和效果。
[0050]
設置了vero e6細胞(細胞陰性對照組)，vero e6細胞+假病毒+培養基(無蛋白的陰性對照)，vero e6細胞+假病毒+hace2-hfc野生型蛋白(hace2-hfc-wt組)、vero e6細胞+假病毒+hace2-hfc-m4-1蛋白(hace2-hfc-m4-1組)、vero e6細胞+假病毒+hace2-hfc-m4-2蛋白(hace2-hfc-m4-2組)、vero e6細胞+假病毒+hace2-hfc-m5蛋白(hace2-hfc-5組)。
[0051]
實驗儀器和材料：
[0052]
vero e6細胞(申請人實驗室保存)，hace2-hfc-wt蛋白基因(由蘇州金唯智合成，其編碼序列為seq id no.3)，hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2、hace2-hfc-m5蛋白序列均為實施例1中得到的，sars-cov-2原始毒株及其變異毒株假病毒由申請人實驗室包裝獲得。
[0053]
蛋白原液配制：分別將hace2-hfc-wt，hace2-hfc-m4-1，hace2-hfc-m4-2，hace2-hfc-m5改造蛋白在超凈工作臺中經0.22μm無菌濾器過濾，用bca法測定濃度，用含2％fbs的dmem培養基配制成濃度60μg/ml的溶液。
[0054]
改造蛋白的梯度稀釋液的配制：用含2％fbs的dmem培養基將各hace2改造蛋白原液進行2倍倍比稀釋，共稀釋11個梯度，每個梯度8個復孔，每孔50μl。
[0055]
假病毒稀釋液：將sars-cov-2原始毒株及變異毒株假病毒液在vero e6細胞上進行定量，將出現1000個ffu時的稀釋度作為中和實驗時的病毒用量。
[0056]
具體步驟如下：
[0057]
a.提前一天在96孔細胞培養板中鋪vero e6細胞，使第二天細胞匯合密度達到80-90％。
[0058]
b.取上述各hace2改造蛋白的梯度稀釋液，在各孔中加入等體積(50μl)的上述假
病毒稀釋液，混勻后，在37℃孵育1h。
[0059]
c.將96孔細胞培養板上清小心棄去，加入上述蛋白-病毒混合液(100μl/孔)，在培養箱中繼續培養15h。
[0060]
b.利用顯微鏡統計被感染了的細胞數，計算各濃度下的抑制率，再利用graphpad計算出ic
50
。
[0061]
表2.ace2改造蛋白與野生型蛋白中和活性對比數據表
[0062][0063]
結果顯示，相比于hace2-hfc-wt，三種hace2改造蛋白(hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2和hace2-hfc-m5)中和sars-cov-2原始毒株及變異毒株假病毒的能力均明顯提高，尤其對原始毒株、南非株501y.v2、巴西株501y.v3和水貂流行株f486l株提高的較為顯著。
[0064]
從整體上看，hace2-hfc-m5的中和活性高于或相似于hace2-hfc-m4-1和hace2-hfc-m4-2，但是其中和南非株501y.v2和巴西株501y.v3的能力進一步提高，這與親和力的結果也是相符的。
[0065]
實施例4
[0066]
hace2-hfc改造蛋白在小鼠模型上的保護作用
[0067]
將hace2-hfc-wt、hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2、hace2-hfc-m5改造蛋白注入小鼠模型體內，通過測定小鼠肺內病毒載量和肺組織he染評價ace2改造蛋白新冠病毒感染情況。
[0068]
設置病毒+pbs組(陰性對照組)，病毒+hace2-hfc-wt蛋白(hace2-hfc-wt組)，病毒+hace2-hfc-m4-1蛋白(hace2-hfc-m4-1組)，病毒+hace2-hfc-m4-2蛋白(hace2-hfc-m4-2組)，病毒+hace2-hfc-m5蛋白(hace2-hfc-m5組)。
[0069]
實驗材料：
[0070]
新冠病毒活病毒(中國科學院微生物所p3實驗室)，balb/c小鼠(購自維通利華實驗動物公司)，hace2-hfc-wt、hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2、hace2-hfc-m5改造蛋白為實施例1中得到。
[0071]
設備條件：中國科學院微生物所p3實驗室
[0072]
實驗步驟如下：
[0073]
a.注射新冠病毒：將5
×
105tcid
50
新冠病毒通過滴鼻感染的方式注入小鼠體內，每組5只。
[0074]
b.注射ace2改造蛋白：在攻毒后的第二天，將ace2改造蛋白按10mg/kg劑量通過腹腔注射方式注入小鼠體內。
[0075]
c.組織檢測：在攻毒后的第五天，取小鼠肺組織，其中每組中的3只用于提取病毒rna，測病毒載量，另外兩只用于做組織切片，he染。
[0076]
d.數據分析：根據肺組織中病毒載量和he染結果，判定ace2改造蛋白保護小鼠抵抗新冠病毒感染情況。
[0077]
本發明的hace2改造片段與hfc的融合蛋白為類抗體蛋白，能夠廣泛用于由新冠病毒原始毒株及變異毒株引起的疾病，可用于由以ace2為受體的多數新冠相關冠狀病毒或sars樣冠狀病毒引起的疾病。
[0078]
本發明的hace2改造片段與hfc的融合蛋白特別適用于對新冠病毒變異毒株的或預防，例如英國株、巴西株、南非株以及水貂流行株等，也可以廣泛用于臨床、流行病學調查及相應藥物或疫苗的制備。
技術特征：
1.ace2改造蛋白在制備和/或預防以ace2為受體的sars樣冠狀病毒引發疾病的藥物中的應用或在制備預防以ace2為受體的sars樣冠狀病毒感染的疫苗中的應用。2.依據權利要求1所述的ace2改造蛋白，其特征在于，所述以ace2為受體的sars樣冠狀病毒為sars-cov-2原始毒株和/或sars-cov-2變異毒株和/或新冠相關冠狀病毒等。3.依據權利要求1或2的ace2改造蛋白，其特征在于，所述的ace2改造蛋白為hace2-hfc-m4-1改造蛋白，其基因序列如序列列表seq id no.5所示或氨基酸序列如序列列表seq id no.6所示。4.依據權利要求1或2的ace2改造蛋白，其特征在于，所述的ace2改造蛋白為hace2-hfc-m4-2改造蛋白，其基因序列如序列列表seq id no.7所示或氨基酸序列如序列列表seq id no.8所示。5.依據權利要求1或2的ace2改造蛋白，其特征在于，所述的ace2改造蛋白為hace2-hfc-m5改造蛋白，其基因序列如序列列表seq id no.9所示或氨基酸序列如序列列表seq id no.10所示。6.依據權利要求1或2的ace2改造蛋白，其特征在于，所述的sars-cov-2原始毒株為sars-cov-2wt。7.依據權利要求1或2的ace2改造蛋白，其特征在于，所述的sars-cov-2變異毒株為英國株n501y.v1、南非株n501y.v2或巴西株n501y.v3等變異毒株。8.依據權利要求1或2的ace2改造蛋白，其特征在于，所述的sars-cov-2變異毒株為水貂流行株y453f、水貂流行株f486l或水貂流行株n501t。
技術總結
本發明涉及基因工程技術領域。本發明提供一種ACE2改造蛋白在制備和/或預防以ACE2為受體的SARS樣冠狀病毒引發疾病的藥物中的應用或在制備預防以ACE2為受體的SARS樣冠狀病毒感染的疫苗中的應用。本發明的hACE2改造片段與hFc的改造蛋白為類抗體蛋白，能夠廣泛用于由新冠病毒原始毒株及變異毒株引起的疾病，預期可以由以ACE2為受體的新冠相關冠狀病毒或SARS樣冠狀病毒引起的疾病。關冠狀病毒或SARS樣冠狀病毒引起的疾病。關冠狀病毒或SARS樣冠狀病毒引起的疾病。
