具有新結構組分的納米粒疫苗的制作方法
具有新結構組分的納米粒疫苗
1.相關申請的交叉引用
2.本專利申請要求美國臨時專利申請號62/684,229(2018年6月13日提交；未決)的優先權權益。優先權申請的全部公開內容出于所有目的通過引用整體并入本文。
3.政府支持聲明
4.本發明是在美國國立衛生研究院(the national institutes of health)授予的資助號r01 ai129698-02和r56 ai125078-01的政府支持下進行的。政府擁有本發明的某些權利。
背景技術：
5.在設計用于抵抗多種病原體(例如病毒)感染的疫苗方面已經取得了實質性進展。hiv-1疫苗領域中最近建立的合理疫苗設計策略和新技術為其他病毒病原體和非病毒疾病靶標的疫苗開發提供了潛在的解決方案。合理的疫苗設計策略包括廣泛中和抗體(bnab)的鑒定、bnab-抗原復合物的結構分析以及基于結構的免疫原設計和測試。在免疫原設計的背景下，在多種病毒包膜(env)蛋白的穩定化和重新設計以及優化env蛋白在病毒樣顆粒(vlp)或類似幾何形狀的納米粒上的多價展示方面，已經看到了重大突破。由于其大的尺寸和表面抗原的密集展示，vlp可以引發強烈且持久的免疫應答。vlp已被開發為針對同源病毒的成功疫苗(用于人乳頭瘤病毒的)或用于外來抗原的運載體。已確定用于b細胞活化的最佳抗原間隔是間隔5至10nm的最少20至25個表位。因此，可以對具有vlp分子特征(球形，10至100個納米等)的自組裝納米粒進行重新改造以展示多種抗原，以用于開發有效的vlp型疫苗。
6.在多種病毒的env蛋白的穩定化和重新設計方面已經取得了重大進展。例如，由于積累了有關bnab和env結構的大量信息，hiv-1疫苗研究現在集中在抗原選擇和評價上。由于來自bg505 sosip.664gp140三聚體的有希望的早期數據，因此天然樣三聚體已成為理想的疫苗平臺。其他gp140設計(例如sc-gp140和nfl)也產生了天然樣三聚體。然而，所有這些設計在應用于非bg505 env時在三聚體產量、純度和穩定性方面具有重大損失，并且需要另外的env穩定化突變和復雜的純化方法來獲得天然樣三聚體。直到最近，env亞穩定性的主要原因——gp41胞外域(gp41ecto)中的hr1彎曲(第547至569位氨基酸)——才被確定并通過合理的重新設計直接靶向。所得三聚體構建體被稱為“未切割的融合前優化(uncleaved prefusion-optimized，ufo)”設計。最近還證明了gp41ecto是env亞穩定性的唯一來源，并且ufo設計的bg505gp41ecto可用于使多種hiv-1亞型穩定并具有大的三聚體產量、純度和穩定性，為基于三聚體的hiv-1疫苗設計提供了簡單、通用且有效的策略。
7.在使用自組裝納米粒展示env抗原作為疫苗候選物方面也取得了重大進展，特別是考慮到對單個抗原觀察到的差免疫原性。例如，已在野生型(wt)小鼠、人ig敲入小鼠、兔和非人靈長類動物(nhp)中測試了sosip和nfl的hiv-1三聚體的免疫原性，對于兔和nhp觀察到了自體2級nab應答，但是對于wt小鼠則沒有。這樣的2級nab應答的誘導通常需要6至12個月的免疫接種，表明可溶性三聚體可能不是最佳的疫苗形式。一致地，更近的研究表明，
具有固有穩定性和純度的ufo三聚體可以展示在包括24聚體鐵蛋白(fr)、60聚體e2p和60聚體i3-01的三種納米粒上，并且具有高產量高純度。參見he et al.，nat.commun.7：12041，2016。這樣的納米粒首次在8周后在小鼠中引發了明顯的2級hiv-1中和抗體應答，而所有可溶性三聚體均失敗。一種這樣的納米粒在6周后在兔中引發了明顯的2級hiv-1中和抗體反應，而可溶性三聚體需要另外8周(在第14周)才能產生這樣的應答。參見，he et al.，sci.adv.4(11)：eaau6769，2018。
8.盡管在疫苗設計中取得了實質性進展，但在醫學領域中仍然需要更有效和強效的疫苗免疫原，例如用于預防多種病毒或非病毒病原體的感染(例如，hiv-1感染)。本發明解決了本領域中未滿足的需求。
技術實現要素：
9.在一方面中，本發明提供了疫苗組合物，其包含(1)展示在自組裝納米粒的表面上的多肽免疫原和(2)嵌入在納米粒內部并且與自組裝納米粒的亞基連接的鎖定結構域(locking domain)。在這些疫苗組合物中，鎖定結構域是蛋白質亞基，其可以在溶液中與和附近納米粒亞基連接的另一鎖定結構域通過界面處的非共價相互作用自然形成二聚體。在一些實施方案中，所采用的鎖定結構域是與另一相同蛋白質結構域或亞基形成同二聚體的蛋白質結構域或亞基。在這些實施方案中的一些中，所采用的鎖定結構域的亞基具有如seq id no：1至9中任一個中所示的氨基酸序列、其保守修飾的變體或實質上相同的序列。
10.在本發明的一些疫苗組合物中，鎖定結構域與納米粒的亞基共價連接。在這些實施方案中的一些中，鎖定結構域的n末端通過接頭序列與納米粒亞基的c末端融合。本發明的一些疫苗組合物還可以包含泛反應性t細胞表位。在這些實施方案中的一些中，t細胞表位的n末端與鎖定結構域的c末端融合。本發明的一些疫苗組合物還可以包含插入在免疫原與納米粒亞基之間的頸部區域(neck region)。在這些實施方案中，頸部區域可以是3-螺旋蛋白結構域，其將免疫原升高以進一步遠離納米粒的表面。除了從內部使納米粒穩定的鎖定結構域之外，本發明的一些疫苗組合物還可包含插入在免疫原與納米粒亞基之間的蛋白質結構域，以進一步使免疫原多肽穩定。在一些優選的實施方案中，用于構建本發明的疫苗組合物的納米粒是具有旋轉對稱性的球形納米粒。在這些實施方案中的一些中，旋轉對稱性具有3次對稱軸和/或5次對稱軸。在這些實施方案中的一些中，所采用的納米粒具有二十面體結構。
11.在本發明的一些疫苗組合物中，展示在納米粒上的多肽免疫原是病毒免疫原。在這些實施方案中的一些中，展示的多肽免疫原是來自利用i類融合機制的病毒的病毒免疫原。作為示例，免疫原可來源于hiv-1病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、沙粒病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)和冠狀病毒。在另一些實施方案中，展示的多肽免疫原是來自利用ii類融合機制的病毒的病毒免疫原。作為示例，免疫原可來源于hcv或寨卡病毒。在另一些實施方案中，展示的多肽免疫原是非病毒免疫原。作為示例，展示的免疫原可以是來自惡性瘧原蟲(plasmodium falciparum)的抗原、來自結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，tb)的抗原或人蛋白質前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(pcsk9)。
12.本發明的一些疫苗組合物是展示hiv-1env來源的三聚體蛋白的hiv-1疫苗。在這些實施方案中的一些中，鎖定結構域的n末端通過包含ggggs(seq id no：17)的一個或更多
個串聯拷貝的接頭序列與納米粒亞基的c末端融合。在一些實施方案中，疫苗組合物還可以包含泛反應性t細胞表位。在這些實施方案中的一些中，t細胞表位的n末端與鎖定結構域的c末端融合。在這些實施方案中的一些中，t細胞表位具有序列akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在一些實施方案中，hiv-1三聚體蛋白的亞基的c末端與納米粒的亞基的n末端共價連接。在一些實施方案中，hiv-1三聚體蛋白亞基通過接頭序列與納米粒亞基融合。在多種實施方案中，所采用的接頭序列可以具有序列(gasb)n，其中a為1至5的整數，b為1至2的整數，并且n為1至5的整數。
13.在本發明的一些疫苗組合物中，自組裝納米粒具有形成三聚體的三聚體序列。在這些實施方案中的一些中，自組裝納米粒的亞基是這樣的多肽，其具有如seq id no：26(鐵蛋白)、seq id no：21(e2p)、seq id no：22(i3-01)或seq id no：25(i3-01變體)中所示的序列、其保守修飾的變體或實質上相同的序列。在一些hiv-1疫苗組合物中，展示的hiv-1env來源的三聚體蛋白來源于gp140。在一些實施方案中，hiv-1env來源的三聚體蛋白是未切割的融合前優化(ufo)gp140三聚體。在這些實施方案中的一些中，ufo gp140三聚體是包含來自hiv-1毒株bg505的經修飾gp41
ecto
結構域的嵌合三聚體。在一些實施方案中，ufo gp140三聚體的亞基具有seq id no：23中所示的序列、其保守修飾的變體或實質上相同的序列。
14.一些特定的hiv-1疫苗組合物包含從n末端到c末端含有以下的亞基序列：如seq id no：23中所示的hiv-1env來源的ufo gp140三聚體亞基、如seq id no：21(e2p)中所示的自組裝納米粒亞基、如seq id no：1(ld4)中所示的鎖定結構域，以及t細胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在這些實施方案中的一些中，亞基序列還可以包含在gp140三聚體亞基與納米粒亞基之間的第一接頭序列(ggggs)2(seq id no：24)，和/或在納米粒亞基與鎖定結構域之間的第二接頭序列ggggs(seq id no：17)。一些其他特定的hiv-1疫苗組合物包含從n末端到c末端含有以下的亞基序列：如seq id no：23中所示的hiv-1env來源的ufo gp140三聚體、如seq id no：22或25(i3-01)中所示的自組裝納米粒亞基、如seq id no：2(ld7)中所示的鎖定結構域，以及t細胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在這些實施方案中的一些中，亞基序列還可以包含在gp140三聚體亞基與納米粒亞基之間的第一接頭序列(ggggs)2(seq id no：24)，和/或在納米粒亞基與鎖定結構域之間的第二接頭序列ggggs(seq id no：17)。
15.在一個相關方面中，本發明提供了包含本文所述的疫苗組合物的藥物組合物。藥物組合物通常還包含可藥用載體。在一些實施方案中，藥物組合物可還包含佐劑。
16.在另一方面中，本發明提供了多核苷酸，其編碼包含n末端免疫原多肽、自組裝納米粒亞基和鎖定結構域亞基的融合蛋白。融合蛋白中的鎖定結構域是蛋白質亞基，其可以在溶液中與和附近納米粒亞基連接的另一鎖定結構域通過界面處的非共價相互作用自然形成二聚體。在本發明的一些多核苷酸中，編碼的融合蛋白中的鎖定結構域是與另一相同蛋白質亞基形成同二聚體的蛋白質亞基。在一些實施方案中，編碼的融合蛋白中的免疫原多肽與納米粒亞基的n末端融合。在一些實施方案中，編碼的融合蛋白中的免疫原多肽是多聚體蛋白的亞基。在一些實施方案中，編碼的融合蛋白中的鎖定結構域位于納米粒亞基的c末端。在一些實施方案中，編碼的融合蛋白還包含在c末端的t細胞表位。在一些實施方案中，編碼的融合蛋白中的免疫原多肽是hiv-1env來源的三聚體蛋白的亞基。在這些實施方
案中的一些中，編碼的融合蛋白可還包含在蛋白質的不同組分之間的一個或更多個接頭序列。在這些實施方案中的一些中，編碼的融合蛋白可包含在免疫原多肽與納米粒亞基間的第一接頭序列，和/或在納米粒亞基與鎖定結構域之間的第二接頭序列。在多個實施方案中，所采用的接頭序列可以各自獨立地具有(gasb)n的序列，其中a為1至4的整數，b為1至2的整數，并且n為1至6的整數。
17.本發明的一些特定的多核苷酸編碼本文所述的hiv-1多肽疫苗組合物。在這些實施方案中的一些中，編碼的融合蛋白從n末端到c末端包含以下：seq id no：23中所示的ufo gp140三聚體亞基、如seq id no：21(e2p)中所示的自組裝納米粒亞基、如seq id no：1(ld4)中所示的鎖定結構域，以及t細胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在一些實施方案中，編碼的融合多肽還可以包含在gp140三聚體亞基與納米粒亞基之間的第一接頭序列(ggggs)2(seq id no：24)，和/或在納米粒亞基與鎖定結構域之間的第二接頭序列ggggs(seq id no：17)。在一些另外的實施方案中，編碼的融合蛋白從n末端到c末端包含以下：seq id no：23中所示的ufo gp140三聚體亞基、如seq id no：22或25(i3-01)中所示的自組裝納米粒亞基、如seq id no：2(ld7)中所示的鎖定結構域，以及t細胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在一些實施方案中，編碼的融合多肽還可以包含在gp140三聚體亞基與納米粒亞基之間的第一接頭序列(ggggs)2(seq id no：24)，和/或在納米粒亞基與鎖定結構域之間的第二接頭序列ggggs(seq id no：17)。
18.在一些相關的實施方案中，本發明提供了由本文所述的多核苷酸編碼的多肽。在一些相關的實施方案中，本發明提供了具有一種或更多種本文所述的多核苷酸的載體。在另一些相關的實施方案中，本發明提供了包含一種或更多種本文所述的多核苷酸或載體的藥物組合物。
19.在另一方面中，本發明提供了用于在對象中或預防hiv-1感染的方法。這些方法包括向對象施用包含有效量的本文所述的hiv-1多肽疫苗組合物的藥物組合物。在這些實施方案中的一些中，所施用的hiv-1疫苗組合物從n末端至c末端包含以下：seq id no：23中所示的ufo gp140三聚體亞基、如seq id no：21(e2p)中所示的自組裝納米粒亞基、如seq id no：1(ld4)中所示的鎖定結構域，以及t細胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在另一些實施方案中，所施用的hiv-1疫苗組合物從n末端到c末端包含以下：seq id no：23中所示的ufo gp140三聚體亞基、如seq id no：22或25(i3-01)中所示的自組裝納米粒亞基、如seq id no：2(ld7)中所示的鎖定結構域，以及t細胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在一些相關的實施方案中，本發明提供了通過向對象施用包含有效量的本文所述的多核苷酸或表達載體的藥物組合物來在對象中或預防hiv-1感染的方法。在這些實施方案中的一些中，所施用的多核苷酸或載體編碼融合蛋白，所述融合蛋白從n末端至c末端包含以下：seq id no：23中所示的ufo gp140三聚體亞基、如seq id no：21(e2p)中所示的自組裝納米粒亞基、如seq id no：1(ld4)中所示的鎖定結構域，以及t細胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在另一些實施方案中，所施用的多核苷酸或載體編碼融合蛋白，所述融合蛋白從n末端至c末端包含以下：seq id no：23中所示的ufo gp140三聚體亞基、如seq id no：22或25(i3-01)中所示的自組裝納米粒亞基、如seq id no：2(ld7)中所示的鎖定結構域，以及t細胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。
20.通過參考說明書的其余部分和權利要求書，可以實現對本發明的本質和優點的進
一步理解。
附圖說明
21.圖1示出了hiv-1ufo gp140納米粒疫苗的結構。
22.圖2示意性示出了表達本文所述的鎖定結構域穩定的hiv-1納米粒免疫原的實例的cmv載體的結構。
23.圖3示出了通過多種測定對cho/expicho產生的納米粒蛋白質的品質評估的結果。
24.圖4示出了兩種鎖定結構域穩定的hiv-1納米粒免疫原的抗原和結構分析的體外評估。
25.圖5示出了在小鼠和兔中兩種示例性的鎖定結構域穩定的hiv-1納米粒免疫原的免疫原性活性的體內研究。
26.圖6示意性地示出了用不同鎖定結構域穩定的hiv-1納米粒免疫原的構建體設計，以及顯示了在expicho細胞中瞬時表達的疫苗免疫原的產量和純度的尺寸排阻譜法(sec)譜。
27.圖7示出了用不同鎖定結構域穩定的hiv-1納米粒免疫原的藍天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(bn-page)分析，以及一些良好形成的納米粒的負染電子顯微術(em)圖像。
28.圖8示出了埃博拉gpδmuc三聚體展示納米粒的分子模型、尺寸排阻譜法(sec)和負染em圖像，接著是具有多種鎖定結構域的埃博拉gpδmuc三聚體展示納米粒的設計理念和分子模型、生物化學和生物物理分析(例如sec和藍天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(bn-page))和抗原表征(例如elisa)。示出了與e2p組合的ld1-ld7以及與i3-01組合的ld4-ld9(其均展示埃博拉gpδmuc-ufog三聚體)的sec譜。
29.圖9示出了拉沙病毒(lasv)gpc三聚體展示納米粒的分子模型，以及24聚體鐵蛋白納米粒上和具有鎖定結構域ld4和t細胞表位padre的60聚體e2p納米粒上gpc三聚體的負染em圖像。
30.圖10示出了人呼吸道合胞病毒(hrsv)f三聚體展示納米粒的分子模型，以及24聚體鐵蛋白納米粒上、具有鎖定結構域ld4和t細胞表位padre的60聚體e2p納米粒上、和具有鎖定結構域ld7和padre的60聚體i3-01納米粒上hrsvf三聚體的負染em圖像。
31.圖11示出了mers冠狀病毒s三聚體展示納米粒的分子模型，以及24聚體鐵蛋白納米粒上、具有鎖定結構域ld4和t細胞表位padre的60聚體e2p納米粒上、和具有鎖定結構域ld7和padre的60聚體i3-01納米粒上mers冠狀病毒s三聚體矛(pike)的負染em圖像。
32.圖12示出了具有和不具有鎖定結構域的丙型肝炎病毒(hcv)糖蛋白e2核芯展示納米粒的疫苗理念、分子模型、生物化學和生物物理分析(例如尺寸排阻譜法(sec)、藍天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(bn-page)和負染em圖像)以及抗原表征，例如elisa結合。
33.圖13示出了寨卡病毒(zikv)diii-10gs-i3-01納米粒的分子模型，接著是24聚體鐵蛋白納米粒上、60聚體e2p納米粒上、和具有鎖定結構域ld7和t細胞表位padre的60聚體i3-01納米粒上展示的diii結構域的生物化學和生物物理表征，例如尺寸排阻譜法(sec)、藍天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(bn-page)和負染em分析。
34.圖14示出了惡性瘧原蟲(p.falciparum(瘧疾))抗原pfs25及其與已知中和抗體的復合物的結構，具有頸部結構域的pfs25納米粒的設計理念，以及24聚體鐵蛋白納米粒上、
具有鎖定結構域ld4和t細胞表位padre的60聚體e2p納米粒上、和具有鎖定結構域ld7和padre的60聚體i3-01上(其均具有插入在pfs25與納米粒之間的頸部結構域)pfs25的負染em圖像。
35.圖15示出了惡性瘧原蟲(瘧疾)抗原環子孢子蛋白(csp)的示意性組成，gsk rts，s疫苗的示意性組成，設計基于csp的納米粒疫苗的分步策略的流程圖，60聚體鐵蛋白上和具有鎖定結構域ld7和t細胞表位padre的60聚體i3-01納米粒上抗原csp的多種組分的負染em圖像，以及尺寸排阻譜法(sec)譜。
36.圖16示出了前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(pcsk9)的結構，具有頸部結構域的pcsk9納米粒的設計理念，以及24聚體鐵蛋白納米粒上和具有鎖定結構域ld7和t細胞表位padre的60聚體i3-01納米粒上(其均具有插入在pcsk9與納米粒之間的頸部結構域)pcsk9的負染em圖像。
具體實施方式
37.i.概述
38.本發明部分地基于本發明人針對多種病毒或非病毒靶標(例如，hiv-1env、埃博拉gp、hcv e2蛋白或結核分枝桿菌(m.tuberculosis)抗原)的新疫苗免疫原以及表現出改善的穩定性和活性的納米粒展示的免疫原(即疫苗組合物)的開發。通常來說，本發明的疫苗或疫苗組合物包含展示在自組裝納米粒或病毒樣顆粒(vlp)上的免疫原多肽或蛋白質(例如，hiv-1env來源的三聚體蛋白)。納米粒疫苗還包含一種或更多種本文所述的新結構組分。這些另外的結構組分發揮促進免疫原在納米粒表面上的展示，增強展示的免疫原的穩定性和/或改善自組裝蛋白質疫苗的產量和純度的作用。在一些實施方案中，本發明的納米粒疫苗包含使納米粒穩定的鎖定結構域。如本文實施例中詳述的，鎖定結構域從內部使納米粒穩定，以使得展示免疫原多肽(例如，hiv-1env來源的三聚體蛋白)的納米粒在制造、疫苗配制和免疫接種過程中可以保持完整。由此構建的新疫苗免疫原具有顯著增強的穩定性。另外，鎖定機制獨立于納米粒平臺。如本文中示例的(例如hiv-1疫苗)，其可以應用于不同的納米粒，例如60聚體i3-01和e2p納米粒并且具有幾乎相同的結局，如通過sec、bn-page、dsc、負染em和抗原譜分析指示的。
39.除了鎖定結構域以外，編碼疫苗的構建體可以另外地或替代地包含多種其他結構組分。例如，可以在免疫原多肽序列與納米粒亞基序列之間添加以下的編碼序列：用于使免疫原多肽穩定的蛋白質結構域，例如t4纖維蛋白(fibritin)的三聚化基序(“foldon”)的編碼序列，或用于將免疫原多肽從納米粒表面升高的蛋白質結構域，例如三螺旋束(“頸部結構域”)的編碼序列，或用于促進免疫親和純化的蛋白質結構域，例如具有已知結合抗體的蛋白質結構域的編碼序列。可以將用作化學綴合的活性位點的多肽片段或基序的編碼序列在合適的位置插入構建體中。如本文所述，還可以將另外的結構組分(例如cd4+t輔助表位或cd8+t細胞表位)在合適的位置插入構建體中。如本文示例的，一個或更多個接頭(接頭序列、基序或部分)可用于連接構建體中的多種結構組分。
40.如本文中所詳述的，本發明的疫苗組合物是由包含本文所述的結構組分的可操作地連接的編碼序列的構建體表達并自組裝的。在構建體中，免疫原多肽編碼序列在其c末端與納米粒亞基編碼序列的n末端直接或間接融合。如本文所述，將編碼其他結構組分的序列
在合適的位置插入構建體中。例如，當使用鎖定結構域時，鎖定結構域編碼序列可以與納米粒亞基編碼序列的c末端直接或間接融合。
41.本文示例的納米粒疫苗構建體表現出高產量、高純度和高穩定性，具有在表面上展示的天然樣抗原結構、增強的天然樣抗原譜，以及在動物中增強的免疫原性。例如，hiv-1納米粒疫苗在6至8周內在野生型小鼠和兔中引發了2級(tier-2)自體中和抗體應答，而一起的可溶性三聚體不能在小鼠中誘導任何2級中和抗體，并且需要最少2至3個月的時間來進行抗體引發。因此，本發明的改善的hiv-1疫苗免疫原更適合于疫苗生產，并且能在疫苗接種中產生更好的免疫應答。
42.除非本文另有說明，否則本發明的疫苗免疫原、編碼多核苷酸、表達載體和宿主細胞以及相關的應用都可以根據本文示例的程序或本領域中公知的常規實踐方法產生或進行。參見，例如methods in enzymology，volume 289：solid-phase peptide synthesis，j.n.abelson，m.i.simon，g..b.fields(editors)，academic press；1st edition(1997)(isbn-13：978-0121821906)；美國專利no.4,965,343和5,849,954；sambrook et al.，molecular cloning：a laboratory manual，cold spring harbor press，n.y.，(3
rg ed.，2000)；brent et al.，current protocols in molecular biology，john wiley&sons，inc.(ringbou ed.，2003)；davis et al.，basic methods in molecular biology，elsevier science publishing，inc.，new york，usa(1986)；或methods in enzymology：guide to molecular cloning techniques vol.152，s.l.berger和a.r.kimmerl eds.，academic press inc.，san diego，usa(1987)；current protocols in protein science(cpps)(john e.coligan，et.al.，ed.，john wiley and sons，inc.)，current protocols in cell biology(cpcb)(juan s.bonifacino et.al.ed.，john wiley and sons，inc.)，以及culture of animal cells：a manual of basic technique by r.ian freshney，publisher：wiley-liss；5th edition(2005)，animal cell culture methods(methods in cell biology，vol.57，jennie p.mather和david barnes editors，academic press，1st edition，1998)。以下各節提供了實施本發明的組合物和方法的其他指導。
43.ii.定義
44.除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。以下參考文獻為技術人員提供了本發明中使用的許多術語的一般定義：academic press dictionary of science and technology，morris(ed.)，academic press(1
st ed.，1992)；oxford dictionary of biochemistry and molecular biology，smith et al.(eds.)，oxford university press(revised ed.，2000)；encyclopaedic dictionary of chemistry，kumar(ed.)，anmol publications pvt.ltd.(2002)；dictionary of microbiology and molecular biology，singleton et al.(eds.)，john wiley&sons(3
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th ed.，2000)。
b c d e f g h p h c p c。其中h代表疏水性殘基，c通常代表帶電荷的殘基，并且p代表極性(并且因此，親水性)殘基。
52.hiv-1包膜蛋白(env)最初被合成為大小為845至870個氨基酸的較長的前體蛋白，稱為gp160。gp160形成同三聚體，并且在高爾基體中經歷糖基化。在體內，gp160糖蛋白被內切蛋白水解加工成成熟的包膜糖蛋白gp120和gp41，其在病毒表面彼此非共價締合成復合物。gp120表面蛋白包含對人cd4(hiv的主要受體)的高親和力結合位點，以及與融合共受體(例如趨化因子受體ccr5和cxcr4)相互作用的結構域。gp41蛋白跨過病毒膜，并且在其氨基末端包含對病毒膜與細胞膜的融合重要的氨基酸序列。hiv-1包膜糖蛋白復合物的天然、可融合形式是由三個gp120和三個gp41亞基構成的三聚體結構。受體結合(cd4和共受體)位點位于gp120部分中，而融合肽位于gp41組分中。野生型gp160多肽的示例性序列在genbank中，例如以登錄號aab05604和aad12142示出。
53.gp140是指hiv包膜蛋白的寡聚形式，其包含全部gp120和整個gp41胞外域。如本文所用，hiv-1gp140三聚體免疫原通常包含gp140結構域和gp140的經修飾或重新設計的胞外域(gp41
ecto
)。
54.gp120是人免疫缺陷病毒(hiv)的包膜蛋白。gp120包含hiv包膜糖蛋白復合物的大多數外部表面暴露結構域，并且gp120與細胞cd4受體和細胞趨化因子受體(例如ccr5)二者結合。成熟的gp120野生型多肽在一級序列中具有約500個氨基酸。gp120被高度n-糖基化，導致約120kd的表觀分子量。該多肽由五個保守區(c1-05)和五個高變區(v1-v5)構成。在其三級結構中，gp120糖蛋白由三個主要結構域(外部結構域、內部結構域和橋接片)加上可變環構成。參見，例如，wyatt et al.，nature393，705-711，1998；以及kwong et al.，nature393，649-59，1998。認為內部結構域與gp41包膜糖蛋白相互作用，而外部結構域暴露在組裝的包膜糖蛋白三聚體上。
55.gp120的可變區1和可變區2(v1/v2結構域)由約50至90個殘基構成，其包含hiv-1的最高可變部分中的兩個(v1環和v2環)，并且v1/v2結構域的十分之一殘基被n-糖基化。
56.gp41是前體hiv包膜蛋白的蛋白水解產物。其包含n末端融合肽(fp)、跨膜結構域以及連接融合肽與跨膜結構域的胞外域。gp41保持三聚體構型，并以非共價方式與gp120相互作用。示例性gp41的氨基酸序列在genbank中以登錄號cad20975給出。
57.bg505 sosip.664gp140是用來自進化枝a毒株bg505的gp140三聚體開發的hiv-1env免疫原。其包含在切割的gp120與gp41
ecto
之間利用工程化二硫鍵的共價連接(稱為sos)。此外，其具有i559p突變(稱為ip)以使gp41融合后的構象不穩定，并且還有膜近端外部區域(mper)在664位殘基處的截短以改善溶解性。這種hiv-1免疫原具有出的抗原譜和對天然刺突(spike)的出結構模擬。使用sosip三聚體作為分選探針，已經鑒定和表征了新的bnab。sosip設計也已擴展到其他hiv-1毒株，并允許引入其他穩定突變。最近，報道了sosip三聚體在兔和非人靈長類動物中的免疫原性，為人疫苗試驗鋪平了道路。
58.免疫原是能夠在哺乳動物(例如被病原體感染或有被病原體感染的風險的哺乳動物)中誘導免疫應答的蛋白質或其部分。免疫原的施用可導致針對目的病原體的保護性免疫和/或主動免疫(proactive immunity)。
59.免疫應答是指免疫系統的細胞(例如b細胞、t細胞或單核細胞)對刺激的應答。在一些實施方案中，應答對特定抗原是特異性的(“抗原特異性應答”)。在一些實施方案中，免
疫應答是t細胞應答，例如cd4+應答或cd8+應答。在另一些實施方案中，應答是b細胞應答，并導致特異性抗體的產生。
60.免疫原性組合物是指包含免疫原性多肽的組合物，所述免疫原性多肽誘導針對表達免疫原性多肽的病毒的可測量ctl應答，或誘導針對免疫原性多肽的可測量b細胞應答(例如抗體的產生)。
61.兩個或更多個核酸序列或者兩個或更多個氨基酸序列之間的序列同一性或相似性以序列之間的同一性或相似性表示。序列同一性可以以百分比同一性來衡量；百分比越高，序列越相同。當出于在比較窗口上或指定區域上針對最大對應性比較和比對時，如使用以下序列比較算法之一或通過手動比對和目測測量的，如果兩個序列具有指定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即，在指定區域，或在未指定時在整個序列上，具有60％同一性，任選地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，則該兩個序列“實質上相同”。任選地，同一性存在于長度為至少約50個核苷酸(或10個氨基酸)的區域上，或更優選地存在于長度為100至500或者1000或更多個核苷酸(或20、50、200或更多個氨基酸)的區域上。
62.當使用標準方法比對時，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有相對高度的序列同一性/相似性。用于比較的序列比對方法是本領域公知的。以下中描述了多種程序和比對算法：smith&waterman，adv.appl.math.2：482，1981；needleman&wunsch，j.mol.biol.48：443，1970；pearson&lipman，proc.natl.acad.sci.usa 85：2444，1988；higgins&sharp，gene，73：237-44，1988；higgins&sharp，cabios 5：151-3，1989；corpet et al.，nuc.acids res.16：10881-90，1988；huang et al.computer appls.in the biosciences 8，155-65，1992；以及pearson et al.，meth.mol.bio.24：307-31，1994。altschul et al.，j.mol.biol.215：403-10，1990，其給出了序列比對方法和同源性計算的詳細考慮。
63.術語“對象”是指被分類為哺乳動物的任何動物，例如人和非人哺乳動物。非人動物的實例包括狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔等。除非另有說明，否則術語“患者”或“對象”在本文中可互換使用。優選地，對象是人。
64.術語“”或“減輕”包括向對象施用化合物或藥劑以阻止或延遲疾病(例如，hiv感染)的癥狀、并發癥或生化指標的開始，減輕癥狀或者阻止或抑制疾病、病癥或障礙的進一步發展。需要的對象包括已經患有疾病或障礙的那些以及處于患疾病的風險中的那些。可以是預防性的(預防或延緩疾病的發作，或者預防其臨床或亞臨床癥狀的表現)，或是疾病表現之后癥狀的性抑制或緩解。
65.未切割的融合前優化(ufo)三聚體是指由gp120蛋白和重新設計的gp41
ecto
結構域形成的hiv-1gp140三聚體蛋白，其導致更穩定的hiv-1gp140三聚體(圖1)。重新設計的gp41
ecto
結構域基于原型hiv-1毒株bg505(以及原型gp140三聚體bg505 sosip.664gp140)，并且相對于野生型bg505 gp41
ecto
序列包含一個或更多個修飾。這些修飾包括(1)用較短的環序列替換hr1的21個殘基n末端(第548至568位殘基)以使融合前gp140結構穩定，以及(2)用柔性接頭序列(例如ggggs(seq id no：17)基序的串聯重復)替代gp120與gp41之間的弗林蛋白酶切割位點(第508至511位殘基)。在一些實施方案中，ufo三聚體還可包含在gp120與gp41之間的工程化二硫鍵和/或gp41中的穩定化突變。例如，基于hiv-1毒株bg505的ufo三聚體可以包含在殘基a501c與t605c之間的工程化二硫鍵。ufo三聚體的詳細描述在例如
kong et al.，nat.comm.7：12040，2016中提供。除了基于bg505毒株序列的ufo三聚體外，工程化gp41
ecto
結構域可用于與來自許多不同hiv-1毒株或亞型的gp120多肽配對以形成“嵌合”gp140三聚體。這樣的嵌合三聚體被稱為“ufo-bg”或“ufo
2-bg”，如本文示例的。ufo-bg和ufo
2-bg三聚體的詳細描述在例如he et al.，sci adv.4(11)：eaau6769，2018中提供。
66.疫苗是指在對象中引起預防性或性免疫應答的藥物組合物。在一些情況下，免疫應答是保護性免疫應答。通常，疫苗引起針對病原體(例如病毒病原體)的抗原或與病理狀況相關的細胞成分的抗原特異性免疫應答。疫苗可包括多核苷酸(例如，編碼公開的抗原的核酸)、肽或多肽(例如公開的抗原)、病毒、細胞或者一種或更多種細胞成分。在本發明的一些實施方案中，疫苗或疫苗免疫原或疫苗組合物從融合構建體表達并自組裝到在表面上展示免疫原多肽或蛋白質的納米粒中。
67.病毒樣顆粒(vlp)是指來源于多種病毒中任一種的非復制性病毒殼。vlp通常由一種或更多種病毒蛋白質構成，例如但不限于被稱為衣殼蛋白、外殼蛋白、殼蛋白、表面蛋白和/或包膜蛋白的那些蛋白質或者來源于這些蛋白質的顆粒形成多肽。在適當的表達系統中蛋白質的重組表達之后，vlp可以自發形成。用于產生特定vlp的方法是本領域中已知的。病毒蛋白質重組表達之后vlp的存在可以使用本領域中已知的常規技術(例如通過電子顯微術、生物物理表征等)來檢測。參見，例如，baker et al.(1991)biophys.j.60：1445-1456；以及hagensee et al.(1994)j.virol.68：4503-4505。例如，vlp可以通過密度梯度離心分離和/或通過特征性密度帶鑒定。替代地，可以對所討論的vlp制劑的玻璃化含水樣品進行冷凍電子顯微術，并在適當的曝光條件下記錄圖像。
68.自組裝納米粒是指具有數十納米的直徑和良好確定的表面幾何學的球形蛋白質殼，其由能夠自動組裝成具有與vlp類似外觀的納米粒的非病毒蛋白的相同拷貝形成。已知實例包括鐵蛋白(fr)，其在物種間保守并且形成24聚體，以及嗜熱脂肪芽孢桿菌二氫硫辛酰基酰基轉移酶(e2p)、風產液菌(aquifex aeolicus)二氧四氫喋啶合酶(lumazine synthase，ls)和海棲熱袍菌(thermotoga maritima)encapsulin，其均形成60聚體。在適當的表達系統中蛋白質重組表達之后，自組裝納米粒可以自發形成。可以使用為vlp開發的相同技術進行納米粒的產生、檢測和表征方法。
69.iii.用于產生疫苗組合物的免疫原多肽或蛋白質
70.任何多肽免疫原或多聚體蛋白質均可用于本發明的疫苗設計。這些包括來自可期望針對其引起免疫應答的病原體的任何蛋白質或多肽。因此，本發明的疫苗組合物可以利用來源于任何病毒、細菌或其他病原性生物體的免疫原多肽。用于本發明的合適的免疫原多肽也可以來源于非病原性物種，包括人蛋白質，針對其引起的免疫應答可具有作用，減輕疾病癥狀或改善總體健康。通常，免疫原多肽可以是包含至少約10個氨基酸殘基的任何結構或功能多肽或肽。在一些實施方案中，免疫原多肽的長度為約10至約10,000個氨基酸殘基。在一些實施方案中，免疫原多肽的長度為約25至約2,000個氨基酸殘基。在一些實施方案中，免疫原多肽的長度為約50至約500個氨基酸殘基。因此，適用于本發明的免疫原多肽或蛋白質的分子量可以為約1kda至約1,000kda，并且優選約2.5kda至約250kda。在一些更優選的實施方案中，所采用的免疫原多肽的分子量為約5kda至約25kda或50 kda。
71.在一些實施方案中，用于本發明疫苗組合物中的免疫原多肽或蛋白質可以來源于病毒表面或核芯蛋白(靶多肽)。有許多對于宿主細胞的病毒感染重要的已知病毒蛋白。實
例包括但不限于hiv的糖蛋白(或表面抗原，例如gp120和gp41)和衣殼蛋白(或結構蛋白，例如p24蛋白)；甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒的表面抗原或核芯蛋白(例如小乙型肝炎病毒表面抗原(s-hbsag)和丙型肝炎病毒的核芯蛋白ns3、ns4和ns5抗原)；eb病毒(ebv)的糖蛋白gp350/220，呼吸道合胞病毒(rsv)的糖蛋白(g蛋白)或融合蛋白(f蛋白)；單純皰疹病毒hsv-1和hsv-2的表面和核芯蛋白(例如，來自hsv-2的糖蛋白d)，脊髓灰質炎病毒的表面蛋白(例如，gb、gc、gd、gh和gl)，麻疹病毒(mv)的包膜糖蛋白血凝素(h)和融合蛋白(f)，淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(lcmv)的糖蛋白g，腺病毒的纖維和五鄰體基底蛋白(penton base protein)，冠狀病毒的s刺突蛋白，黃病毒(例如登革熱病毒、黃熱病病毒和寨卡病毒)的包膜(e)蛋白，以及小核糖核酸病毒的無包膜衣殼蛋白。
72.在一些實施方案中，適用于本發明的病毒免疫原可來源于利用i類融合機制進行感染的病毒。i類病毒融合蛋白是三聚體，其在細胞進入過程中會經歷劇烈的構象變化。病毒蛋白中的特定區域可以完全重折疊以促進膜融合。如本文中示例的，利用i類融合機制的病毒的免疫原的實例包括獲自以下的結構蛋白或多肽：hiv-1、引起出血熱的病毒例如絲狀病毒(例如埃博拉病毒和馬爾堡病毒)和沙粒病毒(例如拉沙病毒)、呼吸道合胞病毒(rsv)、以及冠狀病毒如mers-cov和sars-cov。如本文示例的，合適的免疫原可以是來源于hiv-1ufo三聚體、埃博拉gp胞外域、lasv糖蛋白復合物(gpc)、rsv糖蛋白f和mers-cov刺突蛋白s的任何蛋白質和多肽。這些免疫原或者來源于利用i類融合機制的其他病毒的結構蛋白的免疫原中的任一種均可用于本發明的疫苗設計。
73.在一些實施方案中，適用于本發明的病毒免疫原可以來源于利用ii類融合機制進行感染的病毒。ii類病毒融合蛋白以異二聚體(例如丙型肝炎病毒)或同二聚體(例如登革熱和寨卡病毒)的形式存在，其將在膜融合之前重新折疊以形成三聚體刺突。如本文示例的，合適的免疫原可以是來源于hcv包膜糖蛋白(例如，e2)、寨卡病毒e蛋白(例如，diii結構域)或利用ii類融合機制的其他病毒的任何結構蛋白的任何蛋白質和多肽。這些免疫原中的任一種都可以容易地用于本發明的疫苗設計中。
74.在一些實施方案中，本發明的疫苗組合物中使用的免疫原多肽或蛋白質可以來源于非病毒靶標。這些包括可以從任何非病毒病原體(例如細菌病原體)以及哺乳動物宿主(例如人)體內的寄生生物體獲得的免疫原。在一些實施方案中，對于細菌感染重要的細菌蛋白質適合于獲得本發明的疫苗設計中的免疫原多肽。合適的免疫原可以是來源于細菌的結構蛋白的任何蛋白質和多肽，例如本文以結核分枝桿菌(tb)為例的ag85復合物和mtb72。在一些實施方案中，對于寄生蟲傳播、在宿主中繁殖和生命周期重要的寄生蛋白質適合于獲得本發明的疫苗設計中的免疫原多肽。合適的免疫原可以是來源于寄生生物的結構蛋白的任何蛋白質和多肽，例如如本文示例的惡性瘧原蟲(瘧疾)的pfs25、環子孢子蛋白(csp)和網織紅細胞結合蛋白同源物5(pfrh5)。
75.在一些實施方案中，所采用的免疫原多肽可以是來自期望針對其引起免疫應答的哺乳動物宿主(例如人)的內源蛋白。這些包括例如如本文示例的用于調節膽固醇水平的pcsk9，以及用于控制食欲的食欲刺激素(ghrelin)。多種其他哺乳動物蛋白也可用于獲得合適的免疫原多肽，以用于構建根據本發明的設計的疫苗。在一些實施方案中，用于疫苗設計的非病毒靶標可以是參與人疾病的其他蛋白質。這些包括參與癌癥發生的蛋白質。癌癥相關免疫原的實例還包括非突變的自身抗原，例如，mage-a3、melan-a/martl、gp100、her2/
neu和ny-eso-1。在另一些實施方案中，用于本發明疫苗組合物的免疫原多肽或蛋白質包括參與其他慢性人疾病或病癥的蛋白質。這樣的人靶標的實例包括，例如針對高血壓的ang-ii、針對炎癥的tnf-α、針對病原體誘導的嗜酸性粒細胞增多的il-9、針對哮喘的il-5、針對中風的n-甲基-d-天冬氨酸受體-1，以及針對降低的激素水平的人絨毛膜促性腺激素(hcg)。
76.iv.鎖定結構域
77.如上所述，本發明的一些納米粒疫苗或免疫原利用發明人開發的鎖定機制。鎖定機制是指用于在展示免疫原蛋白或多肽(例如，env來源的hiv-1三聚體蛋白)時從內部使納米粒穩定的蛋白質結構域(“鎖定結構域”)。通常，鎖定結構域可以是能夠形成二聚體的任何蛋白質。在多種實施方案中，鎖定結構域是蛋白亞基，其可以與溶液中的另一蛋白質亞基通過界面處的非共價相互作用自然形成二聚體。在一些優選的實施方案中，兩個蛋白質亞基可以在序列上相同并且形成同二聚體。在另一些情況下，兩個蛋白質亞基可以是不同的蛋白質或通過工程化得到的單個蛋白質的兩個不同結構域，其可以通過界面處的非共價相互作用在溶液中形成異二聚體。通常，鎖定結構域與免疫原多肽(例如，hiv-1env來源的三聚體蛋白的亞基)連接的納米粒亞基共價融合。在一些優選的實施方案中，鎖定結構域選自具有不超過約500個氨基酸的二聚體蛋白，以使得其可以被包封在納米粒殼內。在一些實施方案中，鎖定結構域來源于具有不超過約400、300、250、200、150個或更少氨基酸的二聚體蛋白。在一些實施方案中，鎖定結構域來源于包含約30至約100個氨基酸的二聚體蛋白。如本文所述，鎖定結構域可以是能夠通過特定相互作用(例如疏水性(范德華力)接觸、氫鍵和/或鹽橋)形成界面的任何二聚體蛋白。在一些實施方案中，鎖定結構域可以是能夠通過螺旋、片層、環或上述結構元件的任何組合的相互作用形成界面的任何二聚體蛋白。在一些實施方案中，鎖定結構域可以是能夠形成界面的任何二聚體蛋白，在該界面處可以改造共價鍵，例如二硫鍵或特定的化學連接。在多種實施方案中，二聚體的兩個亞基之間的親和力足夠強以抵抗外部干擾，例如熱和化學加工，在其他情況下缺少這種鎖定結構域的野生型(wt)納米粒將不能耐受該外部干擾。
78.在本發明的實踐中，本領域中已知的許多蛋白質可以用作鎖定結構域。這些包括例如本文在以下實施例中示例的兩個鎖定結構域ld4(seq id no：1)和ld7(seq id no：2)。seq id no：3至16中示出了適用于本發明的一些其他示例性鎖定結構域。如本文針對hiv-1疫苗示例的，通過鎖定結構域ld4或ld7穩定的hiv-1納米粒ufo三聚體疫苗表現出出乎意料的強免疫原性特性。除了具有這些示例性序列中的任一個的鎖定結構域之外，還可以使用保守修飾的變體或具有實質上相同的序列的變體。
79.合適的鎖定結構域可以容易地從來自蛋白質數據庫(pdb)的已知蛋白質中鑒定。例如，可以使用關鍵詞例如“同二聚體”或搜索標準例如“蛋白質化學計量a2(protein stoichiometry a2)”從蛋白質數據庫(pdb)(https：//www.rcsb.org/)或其他數據庫中到二聚體蛋白。這些二聚體蛋白可根據其大小(特別是30至100個氨基酸)進一步過濾。可以目測檢查剩余的蛋白質，以鑒定具有緊湊結構折疊或其他期望特性的蛋白質。如本文中示例的，使用這些程序，鑒定了若干二聚體蛋白，并且根據需要如下所詳述的進行了修飾。在由此鑒定的約20種二聚體蛋白中，9種被測試為鎖定結構域以使60聚體納米粒e2p和i3-01穩定。下面列出了9種測試的鎖定結構域的序列。與其原始序列相比，出于工程化目的，實際
使用的鎖定結構域的序列(seq id no：1至9)可以在柔性n和/或c末端中包含一些殘基的截短。就經工程化的ld9(seq id no：9)而言，除了在原始序列的n和c末端截短外，其還在第42位殘基處包含s->a突變。
80.ld1 1ni8_a：
[0081][0082]
ld2 4aya_b：
[0083][0084]
ld31ovx_a：
[0085][0086]
ld4 2mg4_a：
[0087][0088]
ld5 2jv7_a：
[0089][0090]
ld6 1jr5_a：
[0091][0092]
ld7 1pzq_a：
[0093][0094]
ld8 1r2a_a：
[0095][0096]
ld9 2jrx_a：
[0097][0098]
除了這些測試的ld之外，具有相似結構特征的其他二聚體蛋白也可用于使納米粒表面穩定。這樣的其他序列的實例包括：
[0099]
1l6e_a：
[0100][0101]
1pzr_a：
[0102][0103]
1r05_a：
[0104][0105]
1tkv_a：
[0106][0107]
2dsm_a：
[0108][0109]
2jpq_a：
[0110][0111]
2k01_a：
[0112][0113]
除了這些特定的ld和二聚體蛋白之外，與上述標準匹配的其他蛋白質(其已經存在或可以容易地從蛋白質數據庫(pdb)獲得)也可以用作本發明的鎖定結構域。此外，如果符合上述結構和功能要求，大二聚體蛋白的界面形成部分或結構域可以用作獨立的鎖定結構域。
[0114]
v.其他結構組分或基序
[0115]
除了鎖定結構域外，本發明的納米粒展示的免疫原疫苗構建體和所得疫苗組合物可以另外地或替代地包含其他結構組分或基序。在一些實施方案中，本發明的鎖定結構域穩定的納米粒疫苗還包含t細胞表位，以促進穩健的t細胞應答并引導b細胞向bnab發展。t細胞表位可以位于相對于其他結構組分的任何位置，只要其不影響免疫原多肽在納米粒表面上的展示即可。因此，在一些實施方案中，t細胞表位位于納米粒亞基的c末端，例如通過t細胞表位的n末端與納米粒亞基的c末端融合。在另一些實施方案中，t細胞表位位于免疫原多肽的c末端與納米粒亞基的n末端之間。本領域中已知的任何t細胞表位序列或肽均可用在本發明的實踐中。其包括任何包含mhc ii類表位并且在免疫后可以有效活化cd4+和cd8+t細胞的多肽序列，例如活化cd4+t輔助細胞的t-輔助表位。參見，例如alexander et al.，immunity 1，751-761，1994；ahlers et al.，j.clin.invest.108：1677-1685，2001；fraser et al.，vaccine 32，2896-2903，2014；de groot et al.，immunol.cell biol.8：255-269，2002；以及gene ther.21：225-232，2014。在一些優選的實施方案中，采用的t輔助表位是通用的泛反應性t細胞表位肽akfvaawtlkaaa(seq id no：18)(alexander et al.，immunity 1，751-761，1994)。合適的t細胞表位的其他實例包括肽qsialsslmvaqaip(seq id no：19)和ilmqyikanskfigipmglpqsialsslmvaq(seq id no：20)，或這些示例性t細胞表位肽中任一個的保守修飾的變體或實質上相同(例如，至少90％、95％或99％相同)的序列。
[0116]
作為本文所述的鎖定結構域和其他結構組分的替代或補充，本發明的一些納米粒疫苗包含頸部區域或結構域，以促進免疫原在納米粒表面上的展示。如本文用pcsk9疫苗和用于瘧疾疫苗的惡性瘧原蟲免疫原pfs25示例的，頸部區域構成了來源于病毒蛋白的三螺
旋束。通常，頸部結構域插入在免疫原與納米粒亞基之間，從而使免疫原多肽從納米粒表面升高。任選地，接頭序列(例如10gs接頭)可用于頸部結構域的插入。用于頸部結構域的合適蛋白質的實例包括來源于本文示例的亨德拉病毒結構域(pdb id：4heo)和麻疹病毒結構域(pdb id：1oks)的螺旋束。如所證明的，這樣的結構設計可以進一步改善所得納米粒疫苗的產量和純度。
[0117]
作為本文所述的鎖定結構域和其他結構組分的替代或補充，本發明的一些納米粒疫苗可包含用于使免疫原多肽穩定的蛋白質結構域。在一些實施方案中，實現該目的所采用的蛋白質結構域可以是本領域中公知的t4纖維蛋白的c末端三聚化基序(foldon)。該foldon結構域構成來自噬菌體t4的三聚體蛋白纖維蛋白的c末端30個氨基酸殘基，并用于促進纖維蛋白的折疊和三聚化。參見，例如，papanikolopoulou et al.，j.biol.chem.279：8991-8998，2004；以及guthe et al.，j.mol.biol.337：905-915，2004。如本文用用于mers-cov疫苗的s刺突蛋白三聚體示例的，該蛋白質結構域可以容易地插入在s刺突蛋白亞基與納米粒亞基之間。任選的接頭(例如10gs接頭)可用于插入。與插入在納米粒亞基的c末端的鎖定結構域不同，該蛋白質結構域(foldon)插入在納米粒亞基的n末端。如本文用mers-cov疫苗所證明的，這種結構組分(例如foldon)在單獨使用或與鎖定結構域組合使用時可以增強在納米粒表面上展示的免疫原的穩定性。
[0118]
在多種實施方案中，展示本文所述的任何免疫原多肽或蛋白質(例如，hiv-1env來源的三聚體免疫原)的納米粒可通過將免疫原多肽或多聚體免疫原蛋白(例如三聚體免疫原)的亞基與納米粒的亞基(例如e2p或i3-01亞基)和鎖定結構域以及本文所述的其他任選或替代組分融合來構建。為了構建本發明的展示融合疫苗免疫原的納米粒，可以采用一個或更多個接頭基序或部分來促進連接不同組分并維持不同組分的結構完整性。因此，在一些實施方案中，接頭基序可用于將免疫原多肽(例如，hiv-1三聚體蛋白亞基)的c末端與納米粒亞基的n末端連接。另外地或可替代地，第二接頭基序可用于將納米粒亞基的c末端(或免疫原多肽的c末端)與鎖定結構域的n末端連接。在另一些實施方案中，第三接頭基序可用于連接t細胞表位，例如，將鎖定結構域的c末端和t細胞表位的n末端連接，或將t細胞表位的c末端與鎖定結構域的n末端連接。如本文示例的，接頭也可用于將頸部結構域或foldon結構域插入納米粒疫苗構建體中。通常來說，接頭基序包含短肽序列。在多種實施方案中，接頭或接頭基序可以是連接兩個蛋白質結構域而不干擾其功能的任何柔性肽。例如，在構建體中使用的這些接頭中的任一個可以是具有(gasb)n序列的富含gc的肽，其中a是約1至5的整數，b是約0至2的整數，并且n是約1至5的整數。在另一些實施方案中，t細胞表位可以用作免疫原多肽的c末端與納米粒亞基的n末端之間的接頭或接頭的一部分。
[0119]
本發明的具有本文所述的新結構組分(例如，用鎖定結構域穩定的hiv-1三聚體免疫原)的疫苗組合物可以根據本文所述的方案(例如，實施例1至15)和/或本領域中(例如he et al.，nat.comm.7，12041，2016；kong et al.，nat.comm.7，12040，2016；以及he et al.，sci adv.4(11)：eaau6769，2018)描述的其他方法重組構建。作為示例，本文描述了兩種特定的hiv-1納米粒疫苗構建體。第一種構建體表達從n末端到c末端包含以下的融合多肽：hiv-1ufo bg505.sosip.664gp140亞基、e2p亞基(例如seq id no：21)、上述接頭基序(g
a
s
b
)
n
(例如(ggggs)2(seq id no：24))、如seq id no：1(ld4)中所示的鎖定結構域，以及t細胞表位(例如seq id no：18中所示的padre表位)。任選地，免疫原多肽(例如，用于hiv-1
疫苗的gp140亞基)可以通過接頭序列例如ggggs(seq id no：17)或(ggggs)2(例如，seq id no：24)與納米粒亞基(例如，e2p)連接。第二種構建體表達從n末端到c末端包含以下的融合多肽：hiv-1ufo bg505.sosip.664gp140、接頭序列(ggggs)2(seq id no：24)、i3-01亞基(例如、seq id no：22或25)、上述第二接頭(g
a
s
b
)
n
(例如ggggs(seq id no：17))、如seq id no：2(ld7)中所示的鎖定結構域，以及t細胞表位(例如，如seq id no：18所示的表位)。任選地，在本發明的任何疫苗構建體中，可以將二肽接頭gs插入鎖定結構域與t細胞表位之間。疫苗免疫原(例如，hiv-1納米粒免疫原)的抗原性和結構完整性可通過標準測定(例如抗體結合測定和負染電子顯微術(em))容易地分析。如本文示例的，融合分子可以全部自組裝成展示env來源的三聚體(例如gp140)的免疫原性表位的納米粒。通過引起穩健的三聚體特異性bnab，本發明的納米粒疫苗可用于針對本文所示例的多種病毒(例如，hiv-1、埃博拉、拉沙和hcv病毒)對個體進行疫苗接種。
[0120]
vi.呈遞支架(presenting scaffold)
[0121]
在本發明疫苗的構建中，任何異源支架都可用于呈遞免疫原蛋白或多肽(例如，hiv-1env三聚體蛋白)。這包括病毒樣顆粒(vlp)，例如噬菌體q
β vlp和納米粒。在一些優選的實施方案中，用于呈遞或展示三聚體hiv-1蛋白的異源支架是自組裝納米粒。多種納米粒平臺可用于產生本發明的疫苗組合物。通常來說，用于本發明的納米粒需要由單個亞基的多個拷貝形成。納米粒通常是球形的，和/或具有旋轉對稱性(例如，具有3次對稱和5次對稱軸)，例如具有本文示例的二十面體結構。另外地或替代地，顆粒亞基的氨基末端必須暴露于并緊鄰3次對稱軸，并且三個氨基末端的間隔必須緊密匹配多種hiv-1三聚體組分的羧基末端的間隔。在一些優選的實施方案中，免疫原包含具有約20nm或更小的直徑和在顆粒表面上的3次對稱軸的自組裝納米粒(通常由12個、24個或60個亞基組裝)。這樣的納米粒提供了合適的顆粒平臺以產生多價疫苗，例如如本文示例的hiv-1三聚體疫苗。
[0122]
在一些優選的實施方案中，免疫原蛋白或多肽(例如，hiv-1三聚體蛋白)呈遞在自組裝納米粒上，例如來源于本文示例的鐵蛋白(fr)、e2p和i3-01的自組裝納米粒。e2p是來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的二氫硫辛酰基酰基轉移酶的重新設計變體，已顯示其自組裝成熱穩定的60聚體納米粒。參見，例如，he et al.，nat.commun.7：12041，2016。類似地，i3-01是可自組裝成超穩定的納米粒的工程化蛋白。參見，例如，hsia et al.，nature535，136-139，2016。這些蛋白質的亞基的序列是本領域中已知的。參見，例如，wo2017/192434。如本文示例的e2p和i3-01納米粒亞基的氨基酸序列分別顯示在seq id no：21和22中。相對于原始序列，seq id no：21中所示的e2p序列在第92位殘基處包含ala替換，如以下序列中突出顯示的。除了seq id no：22中所示的i3-01亞基序列外，seq id no：25中所示的重新設計的i3-01亞基序列也可用于本發明的實踐中。在多種實施方案中，本發明的hiv-1納米粒疫苗可以使用任何這些已知的納米粒，以及它們的保守修飾的變體或具有實質上相同(例如，至少90％、95％或99％相同)的序列的變體。
[0123]
e2p亞基序列(seq id no：21)
[0124]
[0125]
i3-01亞基序列(seq id no：22)
[0126][0127]
i3-01-jz9變體序列(seq id no：25)
[0128][0129]
鐵蛋白序列(seq id no：26)
[0130][0131]
除了這些示例性的納米粒序列外，本領域中已知的許多其他納米粒或vlp也可用于本發明的實踐中。這些包括，例如，風產液菌二氧四氫喋啶合酶、海棲熱袍菌encapsulin、黃黏球菌(myxococcus xanthus)encapsulin、噬菌體qβ病毒顆粒、獸棚病毒(flock house virus，fhv)顆粒、orsay病毒顆粒和傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，ibdv)顆粒。
[0132]
如上所述，許多疫苗免疫原可用于本發明的疫苗設計中。這些包括多種病毒免疫原和非病毒蛋白。在hiv-1疫苗的情況下，任何env來源的hiv-1三聚體蛋白均可用于納米粒呈遞疫苗組合物中。可以從多種hiv-1毒株獲得env來源的三聚體蛋白。在一些實施方案中，納米粒呈遞基于hiv-1env的糖蛋白或結構域(例如gp140、gp120或v1v2結構域)的天然三聚體形式。在一些實施方案中，所采用的hiv-1env來源的三聚體蛋白是未切割的融合前優化(ufo)gp140三聚體。在一些實施方案中，env來源的三聚體來自hiv-1毒株bg505，例如bg505.sosip.664gp140三聚體。在一些實施方案中，納米粒呈遞經修飾的gp140三聚體免疫原，例如kong et al.，nat.comm.7，12040，2016中描述的hr1修飾的gp140三聚體(“ufo三聚體”)。該hr1修飾的gp140三聚體蛋白的亞基的氨基酸序列顯示在seq id no：23中。在一些實施方案中，用于本發明的hiv-1三聚體免疫原可以是ufo
2-bg三聚體。ufo
2-bg三聚體是嵌合gp140三聚體，其包含(1)具有重新設計的hr1 n末端彎曲和切割位點接頭的bg505gp41結構域(如kong et al.，nat.comm.7，12040，2016中所述)和(2)來自其他多種hiv-1毒株或亞型之一的gp120蛋白。除了來自bg505毒株的重新設計的gp41
ecto
結構域外，適合于本發明的嵌合gp140三聚體中的gp41結構域也可以是來源于hiv-1序列數據庫的共有gp41
ecto
結構域。也可用于構建本發明的hiv-1納米粒疫苗的是本文所述的多種hiv-1三聚體蛋白的保守修飾的變體，或其具有實質上相同的序列的變體。
[0133]
hr1修飾的gp140三聚體的序列(seq id no：23)
[0134][0135]
vii.多核苷酸和表達構建體
[0136]
本發明的疫苗組合物通常是通過首先產生表達構建體(即表達載體)產生的，所述表達構建體包含可操作連接的本文所述的多種結構組分的編碼序列。因此，在一些有關方面中，本發明提供了基本上純化的多核苷酸(dna或rna)，其編碼具有本文所述的新結構組分的納米粒展示的免疫原(例如，用鎖定結構域穩定的hiv-1env三聚體展示納米粒)，以及具有這樣的多核苷酸的表達載體(例如本文示例的cmv載體)和用于產生疫苗免疫原的宿主細胞(例如本文示例的expicho細胞)。由多核苷酸編碼或由載體表達的融合多肽也包括在本發明中。如本文所述，這樣的多肽將自組裝成在其表面上展示免疫原多肽或蛋白質的納米粒疫苗。
[0137]
多核苷酸和相關載體可以通過標準分子生物學技術或本文示例的方案容易地產生。例如，用于克隆、轉染、瞬時基因表達和獲得穩定轉染的細胞系的一般方案在本領域中描述，例如，sambrook et al.，molecular cloning：a laboratory manual，cold spring harbor press，n.y.，(3
rd ed.，2000)；以及brent et al.，current protocols in molecular biology，john wiley&sons，inc.(ringbou ed.，2003)。可以如以下中所述進行通過pcr將突變引入多核苷酸序列，例如pcr technology：principles and applications for dna amplification，h.a.erlich(ed.)，freeman press，ny，ny，1992；pcr protocols：a guide to methods and applications，innis et al.(ed.)，academic press，san diego，ca，1990；mattila et al.，nucleic acids res.19：967，1991；以及eckert et al.，pcr methods and applications 1：17，1991。
[0138]
特定載體的選擇取決于融合多肽的預期用途。例如，選擇的載體必須能夠驅動期望細胞類型中融合多肽的表達，無論該細胞類型是原核還是真核的。許多載體包含允許可操作地連接的基因序列的真核表達和原核載體復制二者的序列。可用于本發明的載體可以自主復制，即，該載體在染體外存在，并且其復制不一定與宿主細胞基因組的復制直接聯系。替代地，載體的復制可以與宿主染體dna的復制聯系，例如，載體可以整合到宿主細胞的染體中，如通過逆轉錄病毒載體和在穩定轉染的細胞系中所實現的。基于病毒的表達載體和基于非病毒的表達載體二者均可用于在哺乳動物宿主細胞中產生免疫原。非病毒載
體和系統包括質粒、附加體載體(通常具有用于表達蛋白質或rna的表達盒)和人人工染體(參見，例如，harrington et al.，nat.genet.15：345，1997)。可用的病毒載體包括基于慢病毒或其他逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、巨細胞病毒、皰疹病毒的載體，基于sv40的載體、乳頭瘤病毒、hbp eb病毒、牛痘病毒載體和塞姆利基森林病毒(sfv)。參見，brent et al.，同上；smith，annu.rev.microbiol.49：807，1995；以及rosenfeld et al.，cell 68：143，1992。
[0139]
取決于用于表達融合多肽的特定載體，多種已知細胞或細胞系可用于本發明的實踐。宿主細胞可以是可以引入攜帶本發明融合體的重組載體的任何細胞，并且其中允許驅動融合多肽表達的載體可用于本發明。其可以是原核的，例如許多細菌菌株中的任一種，或者可以是真核的，例如酵母或其他真菌細胞、昆蟲或兩棲動物細胞，或哺乳動物細胞，包括例如嚙齒動物、猿猴或人細胞。表達本發明融合多肽的細胞可以是原代培養細胞或可以是已建立的細胞系。因此，除了本文示例的細胞系(例如cho細胞)外，本領域中公知的許多其他宿主細胞系也可用于本發明的實踐。這些包括例如多種cos細胞系、hela細胞、hek293、att20、bv2和n18細胞、骨髓瘤細胞系、轉化的b細胞和雜交瘤。
[0140]
使用哺乳動物組織細胞培養物來表達多肽在例如winnacker，from genes to clones，vch publishers，n.y.，n.y.，1987中進行了一般討論。可以通過本領域技術人員已知的許多合適方法中的任一種將融合多肽表達載體引入選擇的宿主細胞。為了將融合多肽編碼載體引入哺乳動物細胞，所使用的方法將取決于載體的形式。對于質粒載體，可以通過許多轉染方法中的任一種引入編碼融合多肽序列的dna，所述方法包括例如脂質介導的轉染(“脂質轉染(1ipofection)”)、deae-葡聚糖介導的轉染、電穿孔或磷酸鈣沉淀。這些方法例如在上文的brent et al中有詳細描述。適合于瞬時轉染廣泛多種轉化的和未轉化的或原代細胞的脂質轉染試劑和方法是廣泛可獲得的，使得脂質轉染成為將構建體引入真核尤其是培養的哺乳動物細胞的有吸引力的方法。例如，lipofectamine
tm
(life technologies)或lipotaxi
tm
(stratagene)試劑盒是可獲得的。提供用于脂質轉染的試劑和方法的其他公司包括bio-rad laboratories、clontech、glen research、life technologies、jbl scientific、mbi fermentas、panvera、promega、quantum biotechnologies、sigma-aldrich和wako chemicals usa。
[0141]
為了長期高產量地生產重組融合多肽，優選穩定表達。代替使用包含病毒復制起點的表達載體，可以用由適當的表達控制元件(例如啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制的融合多肽編碼序列和選擇標志物轉化宿主細胞。重組載體中的選擇標志物賦予對選擇的抗性，并允許細胞將載體穩定整合到其染體中。常用的選擇標志物包括neo，其賦予對氨基糖苷g-418的抗性(colberre-garapin，et al.，j.mol.biol.，150：1，1981)；和hygro，其賦予對潮霉素的抗性(santerre et al.，gene，30：147，1984)。通過適當的選擇，轉染的細胞可以包含融合多肽編碼序列的整合拷貝。
[0142]
viii.藥物組合物和應用
[0143]
在另一方面中，本發明提供了使用具有本文所述的新結構組分(例如，鎖定結構域)的納米粒疫苗組合物的藥物組合物和相關的方法。在一些實施方案中，hiv-1env三聚體疫苗組合物可用于預防和hiv-1感染。在多種其他實施方案中，本文所述的包含不同病毒或非病毒免疫原的納米粒疫苗可用于預防或相應疾病，例如由多種病原體引起
的感染。本發明的一些實施方案涉及ebov疫苗用于預防或埃博拉病毒感染的用途。本發明的一些實施方案涉及lasv疫苗用于預防或拉沙病毒感染的用途。本發明的一些其他實施方案涉及使用本文所述的rsv疫苗用于預防或rsv感染。本發明的一些其他實施方案涉及使用本文所述的hcv疫苗用于預防或hcv感染。本發明的另一些其他實施方案涉及使用本文所述的cov疫苗用于預防或mers-cov感染。在一些其他實施方案中，本發明提供了使用zikv疫苗用于預防或寨卡病毒感染的方法。在一些其他實施方案中，本發明提供了使用惡性瘧原蟲免疫原(例如，pfs25)來源的疫苗用于預防或瘧疾的方法。在一些其他實施方案中，本發明提供了使用來源于結核分枝桿菌免疫原ag85a或mtb72的疫苗用于預防或結核病的方法。在另一些其他實施方案中，本發明提供了使用pcsk9疫苗來降低人對象中的ldl膽固醇的方法。
[0144]
在本發明的多種方法的實踐中，向需要預防或疾病或病癥(例如，hiv-1感染或瘧疾)的對象施用本文所述的相應納米粒疫苗、免疫原多肽或編碼多核苷酸。通常，本文公開的納米粒疫苗、免疫原多肽或編碼多核苷酸包含在藥物組合物中。藥物組合物可以是制劑或預防制劑。通常，該組合物還包含一種或更多種可藥用載劑，以及任選地其他成分(例如，抗生素或抗病毒藥物)。組合物中也可以使用多種可藥用添加劑。
[0145]
因此，本發明的一些藥物組合物是疫苗組合物。對于疫苗組合物，還可以包含合適的佐劑。合適的佐劑的實例包括例如氫氧化鋁、卵磷脂、弗氏佐劑、mpl
tm
和il-12。在一些實施方案中，本文公開的疫苗組合物或納米粒免疫原(例如，hiv-1疫苗或瘧疾疫苗組合物)可以被配制為控釋或延時釋放制劑。這可以在包含緩釋聚合物的組合物中或通過微囊化遞送系統或生物黏附凝膠來實現。可以根據本領域公知的標準程序來制備多種藥物組合物。參見，例如，remington’s pharmaceutical sciences，19
th ed.，mack publishing company，easton，pa.，1995；sustained and controlled release drug delivery systems，j.r.robinson，ed.，marcel dekker，inc.，new york，1978)；美國專利no.4,652,441和4,917,893；美國專利no.4,677,191和4,728,721；以及美國專利no.4,675,189。
[0146]
本發明的藥物組合物可以容易地用于多種或預防應用中，例如用于在對象中hiv-1感染或瘧疾，或者引起針對hiv-1或惡性瘧原蟲的免疫應答。在多種實施方案中，疫苗組合物可用于或預防由納米粒疫苗中展示的免疫原多肽所來源的病原體引起的感染。因此，本發明的疫苗組合物可用于多種臨床環境中，以或預防由多種病毒(例如，hiv-1、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙病毒、rsv、mers-cov、sars-cov、hcv、登革熱病毒或寨卡病毒)或其他病原體(例如細菌如結核分枝桿菌，和寄生生物例如惡性瘧原蟲)引起的感染。其還可用于在哺乳動物對象(例如人)中誘導針對內源靶標的期望免疫應答，例如引起針對pcsk9或食欲刺激素的抗體應答。除非另有說明，否則本文提供的用于示例hiv-1疫苗組合物的應用的公開內容可以類似地應用于展示任何其他病毒或非病毒免疫原的納米粒疫苗。
[0147]
作為示例，可以將hiv-1納米粒疫苗組合物施用于對象以誘導針對hiv-1的免疫應答，例如，誘導針對hiv-1的廣泛中和的抗體的產生。對于處于發生hiv感染的風險中的對象，可以施用本發明的疫苗組合物以提供針對病毒感染的預防性保護。可以類似地進行來源于本文所述的其他免疫原的疫苗的性和預防性應用。取決于具體的對象和病癥，本發明的藥物組合物可以通過本領域普通技術人員已知的多種施用方式施用于對象，例如，
肌內、皮下、靜脈內、動脈內、關節內、腹膜內或腸胃外途徑。通常，將藥物組合物在足以預防、抑制和/或改善所選疾病或病癥或者其一種或更多種癥狀的條件下施用于需要這樣的的對象持續一定時間。以足以誘導針對hiv-1的免疫應答的量施用免疫原性組合物。對于應用，組合物應包含有效量的本文所述的hiv-1納米粒免疫原。對于預防應用，組合物應包含預防有效量的本文所述的hiv-1納米粒免疫原。可以基于待或預防的特定疾病或病癥、嚴重程度、對象的年齡以及特定對象的其他個人屬性(例如，對象健康的總體狀態和對象免疫系統的穩健性)來確定免疫原的合適的量。有效劑量的確定還由動物模型研究隨后進行人臨床試驗指導，并由顯著降低對象中所靶向的疾病癥狀或病癥的發生或嚴重程度的施用方案指導。
[0148]
對于預防應用，在任何癥狀之前(例如在感染之前)提供免疫原性組合物。免疫原性組合物的預防性施用用于預防或改善任何隨后的感染。因此，在一些實施方案中，待的對象是具有感染(例如，hiv感染)或處于發生感染(例如，hiv感染)的風險中的對象，例如由于暴露于或可能暴露于病毒(例如，hiv感染)。在施用有效量的所公開的組合物之后，可以監測對象的感染(例如，hiv-1感染)、與感染(例如，hiv-1感染)相關的癥狀、或二者。
[0149]
對于應用，在疾病或感染的癥狀發作時或之后(例如在出現感染(例如，hiv-1感染)的癥狀之后或在診斷感染之后)提供免疫原性組合物。因此，免疫原性組合物可以在預期暴露于hiv病毒之前提供以減弱預期的感染和/或相關的疾病癥狀的嚴重性、持續時間或程度；在暴露于或懷疑暴露于病毒之后提供；或在實際感染開始之后提供。
[0150]
本發明的藥物組合物可以與本領域中已知的用于或預防相關病原體的感染(例如，hiv感染)的其他藥劑組合。再次，以hiv-1感染為例，這些已知的藥劑包括，例如抗體或其他抗病毒藥劑，例如核苷逆轉錄酶抑制劑，例如阿巴卡韋、azt、去羥肌苷(didanosine)、恩曲他濱、拉米夫定、司他夫定、替諾福韋、扎西他濱、齊多夫定等，非核苷逆轉錄酶抑制劑，例如地拉韋定(delavirdine)、依非韋侖(efavirenz)、奈韋拉平，蛋白酶抑制劑，例如安普那韋(amprenavir)、阿扎那韋(atazanavir)、茚地那韋(indinavir)、洛匹那韋(lopinavir)、奈非那韋、安普那韋(osamprenavir)、利托那韋、沙奎那韋、替拉那韋(tipranavir)等，以及融合蛋白抑制劑，例如恩夫韋地等。藥物組合物和已知的抗hiv劑的施用可以同時或先后進行。
[0151]
本發明的包含如本發明所述的新結構組分的納米粒疫苗組合物(例如，用鎖定結構域穩定的hiv-1疫苗)或藥物組合物可以作為藥盒(kit)的組分提供。任選地，這樣的藥盒包含另外的組分，包括包裝、說明書和多種其他試劑，例如緩沖液、底物、抗體或配體(例如對照抗體或配體)以及檢測試劑。藥盒中還可以提供任選的說明書。
[0152]
實施例
[0153]
提供以下實施例以對本發明進行舉例說明，但不限制本發明。
[0154]
實施例1：具有多種ld的bg505 gp140納米粒的產量和純度
[0155]
針對具有在表面上展示的hiv-1bg505 ufo三聚體的60聚體e2p和i3-01納米粒驗證了不同鎖定結構域(ld)的效用。圖6中示意性地描述了構建體設計。將含ld的納米粒在100ml expicho細胞中瞬時表達，隨后使用2g12或pgt145抗體柱純化。然后在superose 6 10/300gl柱上通過尺寸排阻譜法(sec)對納米粒樣品的產量和純度進行表征。sec譜表
fisher)過濾。可以使用pgt145抗體親和柱從培養物上清液中提取納米粒。質粒dna種可以由我們的實驗室制備，并提供給承包商以在承包商的gmp生產設施中進行大規模生產。
[0163]
實施例5：具有鎖定機制的納米粒疫苗的品質控制
[0164]
可以通過以下評估cho/expicho產生的納米粒蛋白的品質：(1)針對產量和純度的superose 6 10/300gl柱和藍天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(bn-page)；(2)針對熱穩定性的用microcal vp-capillary量熱儀(malvem)的差示掃描量熱法(dsc)；(3)針對抗原性的使用octet red96、定量生物傳感器以及一組bnab和非nab的生物層干涉測量術(bli)；以及(4)針對納米粒組裝和結構完整性的負染電子顯微術(em)。qc過程已在我們的實驗室中針對選擇的納米粒構建體進行了驗證(參見下文)。值得注意的是，在蛋白質表達、生產和純化之后，可以在任何gmp設施中容易地在現場執行qc步驟(1)至(2)。
[0165]
在100ml expicho細胞中瞬時表達并使用pgt145抗體親和柱從細胞上清液中純化后，在superose 6 10/300gl柱上通過尺寸排阻譜法(sec)分析納米粒(圖3a)。在sec譜中觀察到在8ml處的單個尖峰，指示這兩種構建體的高純度。此外，基于e2p和i3-01的構建體的uv
280
值分別達到～450和～350，指示這兩種構建體的高產量，估計為15至20mg/l。特別值得注意的是，對于i3-01和e2p，鎖定機制不僅可以改善穩定性，還可以改善純納米粒的產量，將其提高2至3倍。還通過bn-page分析了sec前納米粒樣品，其在凝膠上未顯示出對應于低分子量物質的條帶，所有樣品由于納米粒的大尺寸和高分子量而均被捕獲在泳道頂部的孔中(圖3b)。因此，bn-page證實了在sec分析中觀察到的高純度。
[0166]
然后通過dsc評估純化的納米粒以測量熱穩定性，對于基于e2p和i3-01的構建體，其產生的熔融溫度(t
m
)分別為69.52℃和68.26℃，指示與t
m
＝68.24℃的bg505 ufo三聚體相比更高的熱穩定性程度(圖3c)。因此，利用鎖定機制，t
m
獨立于納米粒平臺，并且僅由展示的抗原(在這種情況下為ufo gp140三聚體)的熱穩定性決定。還發現了兩種選擇的納米粒構建體對化學物質具有抗性，并且在-80℃至4℃的寬溫度范圍內穩定。例如，當通過負染em對冷凍然后解凍的樣品或在4℃下保存數周的樣品進行分析時，未觀察到由于溫度變化引起的崩解。
[0167]
如下所述進一步表征了gmp產生的納米粒的結構和抗原性。
[0168]
實施例6：抗原性和免疫原性的評價
[0169]
除了簡單、穩健的制造過程以及卓越的生物化學和生物物理特性外，進一步的體外和體內評價表明，這些具有鎖定機制的ufo gp140納米粒可提供迄今為止最有希望的hiv-1疫苗候選物。
[0170]
體外評價-抗原和結構分析(或qc步驟3和4)：使用bli和一組5種bnab(圖4a)和4種非nab(圖4b)評估兩種選擇的納米粒的抗體結合。包含ufo三聚體作為對照。總體而言，這兩種納米粒均顯示出與識別v2頂點(apex)、n332超位點(supersite)和cd4bs的bnab的顯著增強的結合(3至4倍)，但通過35o22與gp120-gp41界面的結合降低，這很可能是由于阻塞了進入納米粒表面上的該位點。還值得注意的是，納米粒展示沒有提高與cd4bs、cd4i位點和免疫顯性gp41表位的非nab結合，而v3頂端(tip)除外，其顯示出適度提高的19b結合。
[0171]
還通過負染em在結構上分析了兩種選擇的納米粒，其顯示出良好形成的均質納米粒，具有從表面突出的天然樣ufo gp140三聚體的致密層(圖4c)。值得注意的是，在大多數情況下，納米粒殼內的鎖定結構域(ld)在這種低分辨率下不可見。然而，偶爾可以識別從
納米粒表面向內突出的結構，這對應于ld蛋白。
[0172]
在小動物模型中的體內評價：我們在小鼠和兔中評價了ufo三聚體和納米粒的子集。在小鼠中，所有三聚體(除支架gp140.681構建體外)均未能引起自體2級nab。鐵蛋白納米粒和i3-01納米粒設計的早期版本(稱為“ufo-padre-i3-01”)在第8周誘導了自體2級nab，對于i3-01觀察到更強的應答(圖5a)。使用純化的igg進行tzm-bl hiv中和測定，以消除小鼠血清中的非特異性抗病毒活性。值得注意的是，這是第一次在wt小鼠中觀察到env誘導的2級nab應答，而在先前的研究中，bg505sosip三聚體在免疫接種16周后未能在wt小鼠中引起任何自體2級nab應答。還在兔中評價了ufo三聚體和鐵蛋白納米粒的免疫原性，并縱向測量了抗體應答。結果表明，鐵蛋白納米粒在第8周誘導了自體2級nab，而bg505 ufo三聚體還需要2個月才能誘導這種2級nab應答(圖5b)。在最近的研究中，zhu實驗室用最終的納米粒構建體之一ufo-e2p-ld4-padre免疫了wt小鼠。在測試的8只小鼠中，一只表現出比其他強得多的2級nab應答，而所有動物在11周時均表現出2級nab應答，在1mg/ml igg濃度下具有50％至95％中和(數據未示出)。因此，即使尚未對具有鎖定機制的最終納米粒疫苗構建體進行體內評估，體內數據也清楚地證明了我們的ufo gp140納米粒的疫苗潛力。我們預期這兩種納米粒構建體將誘導對那些2級分離物的更廣泛和強效的中和抗體應答。
[0173]
實施例7：用于利用i類融合的其他病毒-絲狀病毒的疫苗
[0174]
我們開發了用于絲狀病毒的納米粒疫苗。絲狀病毒例如埃博拉病毒(ebov)和馬爾堡病毒可導致人和非人靈長類動物(nhp)中的致死性出血熱。盡管絲狀病毒已造成過去人疾病的暴發，但埃博拉病毒是造成2013至2016年期間歷史上最大的暴發的唯一原因，其蔓延到九個非洲國家，具有28,600例病例和11,325例死亡。當前，剛果民主共和國(drc)正在發生埃博拉爆發，宣稱已奪去了超過六百條生命。絲狀病毒糖蛋白(gp)通過啟動附著和膜融合來介導細胞進入，并且是疫苗設計中的主要靶標。gp可以被分離自人幸存者和免疫動物的中和抗體識別(參見saphire et al.，cell 174(4)：938-952，2018)。
[0175]
在我們的研究中，我們使用埃博拉病毒的扎伊爾毒株的氨基酸序列(genbank：np_066246)設計了多種gp融合構建體，其包含gp的胞外域(第33至632位氨基酸)，但缺失了非結構化黏蛋白樣結構域(mld，第313至463位氨基酸)，因此稱為gpδmuc。由于gp的gpδmuc形式已被廣泛用于結構研究中(參見lee et al.，nature 454(7201)：177-182，2008)，其為線狀病毒疫苗設計提供了合理的基礎。我們已經在鐵蛋白、e2p和i3-01納米粒平臺上展示了野生型(wt)gpδmuc和gpδmuc的通用ufo(ufog)形式(圖8a)。在expicho細胞中瞬時表達后，使用mab100抗體柱(對于鐵蛋白和e2p)或mab114抗體柱(對于i3-01)從上清液中提取融合蛋白，然后在superose 6 10/300柱上純化。總體上，我們觀察到了呈遞gpδmuc-ufog的納米粒與呈遞wt gpδmuc的那些相比更高的產量和純度，如通過sec譜指示的(圖8b)。對于鐵蛋白，與wt gpδmuc-鐵蛋白相比，gpδmuc-ufog-鐵蛋白顯示出更明顯的納米粒峰。對于e2p，wt gpδmuc-e2p顯示出納米粒和未組裝蛋白質的峰，而gpδmuc-ufog-e2p主要顯示出納米粒的高峰。對于i3-01，這兩種融合構建體均顯示在納米粒組裝方面具有困難，在sec譜中具有在15至16ml處的未組裝的融合蛋白的高峰。盡管如此，負染的em仍顯示出良好形成的呈遞wt gpδmuc三聚體和gpδmuc-ufog三聚體的鐵蛋白、e2p和i3-01納米粒(圖8c)。
[0176]
以前，我們已經系統篩選了hiv-1ufo三聚體呈遞e2p和i3-01納米粒的鎖定結構域。在這項研究中，我們系統地篩選了埃博拉gpδmuc-ufog三聚體呈遞e2p和i3-01納米粒
的鎖定結構域。可以在示意圖(圖8d，左)中說明鎖定機制。為了使具有鎖定結構域的60聚體納米粒的結構可視化，我們構建了e2p納米粒的原子模型，并將鎖定結構域(ld4)和t細胞表位(padre)以逐步方式引入模型中(圖8d，右)。在我們的研究中，在expicho細胞中瞬時表達七個gpδmuc-ufog-e2p-ldn構建體(n＝1至7)和五個gpδmuc-ufog-10gs-i3-01-ldn構建體(n＝4/5/7/8/9)。使用mab100抗體柱(針對鐵蛋白和e2p)或mab114抗體柱(針對i3-01)從上清液中提取gpδmuc融合蛋白，然后在superose 6 10/300柱上純化。在所有基于e2p的構建體中，ld4和ld7顯示出最高的產量和純度，而在所有基于i3-01的構建體中，ld7和ld8給出了最佳結果(圖8e)。這在很大程度上與我們先前對hiv-1ufo gp140納米粒的發現一致，其中ld4和ld7顯示分別與e2p和i3-01最相容。因此，與展示的免疫原無關，與ld4組合的e2p和與ld7組合的i3-01可用作疫苗開發的兩種通用納米粒平臺。
[0177]
與我們先前對hiv-1gp140納米粒的觀察結果一致的另一個發現是，在鎖定結構域的c末端添加t細胞表位顯著改善了所得納米粒(在這種情況下為gpδmuc-ufog納米粒)的產量和純度(圖8f)。這可以通過在中空納米粒的中心疏水性t細胞表位簇的形成來解釋(圖8d，右)。bn-page通過在凝膠上顯示高分子量條帶進一步證實了納米粒的組裝(圖8g)。然而，所有gpδmuc-i3-01融合構建體均顯示出未組裝的二聚體和單體物質。最后，在elisa中將三種wt gpδmuc納米粒和三種gpδmuc-ufog納米粒的抗原譜與其各自的gpδmuc三聚體進行了比較(圖8h)。總體而言，gpδmuc納米粒顯示出比gpδmuc三聚體強得多的與中和抗體的結合。
[0178]
實施例8：用于利用i類融合的其他病毒-沙粒病毒的疫苗
[0179]
基于相同的設計策略，我們開發了用于沙粒病毒的納米粒疫苗。還已知沙粒病毒在人中造成嚴重的出血熱。哺乳動物拉沙病毒(lassa mammarenavirus，lasv)是拉沙熱的病原體和西非的主要公共衛生負擔之一。lasv糖蛋白復合物(gpc)是異二聚體的三聚體，每個異二聚體包含受體結合亞基gp1和跨膜融合介導亞基gp2。與其他i類融合蛋白(例如hiv-1gp160和埃博拉gp)相似，lasv gpc負責細胞進入，并是中和抗體應答的主要靶標之一。當前，沒有可用于預防lasv感染的疫苗。最近，已經報道了與人中和抗體復合的lasv gpc的晶體結構(參見hastie et al.，356(6341)：923-928，2017)。
[0180]
在我們的研究中，我們基于lasv毒株胞外域的氨基酸序列(genbank：np_694870)設計了gpc融合構建體。我們填充了基于中和抗體37.7h的抗體柱(參見hastie et al.，science 356(6341)：923-928，2017)以用于lasv gpc和納米粒的無標簽純化。設計了兩種融合構建體(gpc-10gs-fr和gpc-5gs-e2p-ld4-padre)來測試lasv納米粒疫苗概念，這將分別導致直徑為26.3nm和37.6nm的納米粒(圖9a)。將這兩種融合構建體在expicho細胞中瞬時表達，并使用37.7h抗體柱純化。由于37.7h在底部與lasv gpc三聚體的gp2結合，由于與納米粒表面上的gp2的受限的接近，因此其對于gpc納米粒的純化可能不是最佳的。這解釋了對于這兩種構建體均觀察到的低產量。然而，通過負染em分析了37.7h純化的蛋白質，其顯示出良好形成的納米粒與未組裝的蛋白質混合(圖9b)。由于gpc與鐵蛋白納米粒之間的長柔性接頭，因此在鐵蛋白納米粒表面上無法識別gpc刺突(圖9b，左)。相反，gpc-5gs-e2p-ld4-padre的em圖像的特寫鏡頭示出了e2p納米粒表面上gpc三聚體的層(圖9b，右)。總之，我們的研究證實了lasv gpc可以展示在具有鎖定結構域的60聚體納米粒上，盡管更有效的抗體柱可以進一步改善gpc納米粒的純度。
[0181]
實施例9：用于利用i類融合機制的其他病毒-rsv的疫苗
[0182]
我們還開發了用于呼吸道合胞病毒(rsv)的納米粒疫苗。人呼吸道合胞病毒(hrsv)感染是嬰兒、幼兒和老年人中細支氣管炎和住院的主要原因之一。融合糖蛋白(f)介導細胞進入，并且是用于疫苗設計的主要靶標。f可以被分離自感染的供體的中和抗體識別。就像hiv-1gp160、埃博拉gp和拉沙gpc一樣，hrsv f是i類跨膜表面蛋白，其具有n末端的信號肽(第1至25位氨基酸)和在c末端附近的膜錨。f首先作為無活性的前體蛋白f0合成，f0在反式高爾基復合體中通過弗林蛋白酶或弗林蛋白酶樣細胞內切蛋白酶切割而被激活后組裝成同三聚體。切割導致兩個二硫鍵連接的nh2-f2-f1-cooh形式的亞基。作為切割的結果，f1的n末端包含融合肽(第137至154位氨基酸)，其是直接插入宿主細胞膜中以觸發融合的疏水肽。f1亞基還包含兩個七肽重復(hr)區域，其在融合過程中締合并使病毒膜和細胞膜接近。已經在原子分辨率下確定了與中和抗體復合的融合前f的晶體結構(參見mclellan et al.，340(6136)：1113-1117，2013)。
[0183]
在我們的研究中，我們在鐵蛋白、e2p和i3-01納米粒上展示了融合前hrsv f，利用e2p和i3-01 60聚體測試了多種鎖定結構域和接頭。分子建模表明，hrsv f fr納米粒的尺寸為33.9nm或更大，并且hrsv f e2p(或i3-01)的直徑為至少45.2nm(圖10a)。我們使用融合前f特異性人中和抗體d25填充了抗體柱以用于hrsvf和f呈遞納米粒的無標簽純化(參見mclellan et al.，340(6136)：1113-1117，2013)。將所有hsv f融合構建體在expicho細胞中瞬時表達。使用d25抗體柱從上清液中提取f融合蛋白，并通過負染em進行分析。在f的c末端與鐵蛋白的n末端之間包含10氨基酸(g4s)2接頭的f-10gs-fr構建體形成了在鐵蛋白表面上具有可見的“拇指狀”融合前f三聚體的納米粒(圖10b)，與分子建模(圖10a)一致。然后將融合前f展示在包含鎖定結構域(ld4)和t細胞表位(padre)的e2p納米粒上。測試了在f的c末端與e2p亞基的n末端之間具有和不具有10氨基酸(g4s)2接頭的兩種構建體。沒有長接頭，融合前f三聚體在e2p納米粒表面上呈顆粒狀突起(圖10c，左)，而具有長接頭，則可以在e2p納米粒表面上識別一系列“拇指狀”融合前f三聚體(圖13c，右)。最后，將融合前f展示在包含鎖定結構域(ld7)和padre的i3-01納米粒上。產生了具有插入在f與e2p之間(外部)和與ld7的c末端連接(內部)的t細胞表位(padre)的兩種構建體，以檢查在鎖定結構域存在下t細胞表位的位置對納米粒組裝的作用。對于前者(f-5gs-padre-i3-01-ld7)，我們觀察到了良好形成的納米粒，但無法識別納米粒表面上的融合前f刺突(圖11d，左)。對于后者(f-10gs-i3-01-ld7-padre)，盡管存在未組裝的f三聚體，我們仍觀察到裝飾有“拇指狀”融合前f三聚體的層的良好形成的納米粒(圖11d，右)。
[0184]
總之，我們的結果表明，hrsv f可以展示在具有鎖定結構域的e2p和i3-01納米膜上，并提供了使用不同長度的接頭并將t細胞表位置于不同位置的實例。
[0185]
實施例10：用于利用i類融合機制的其他病毒-cov的疫苗
[0186]
我們還開發了用于冠狀病毒(cov)的納米粒疫苗。cov是具有正鏈rna基因組的包膜病毒。2002年，亞洲的嚴重急性呼吸道綜合征(sars)的爆發導致發現了一種新型冠狀病毒，其后來被命名為sars-cov。在爆發期間，sars-cov感染了超過8000人，致死率為約10％。2012年，鑒定了一種新的冠狀病毒物種中東呼吸綜合征冠狀病毒(mers-cov)，其此后在27個國家中感染超過2000人，致死率為約35％。對于這兩種冠狀病毒，病毒基因組均編碼刺突(s)、包膜(e)、膜(m)和核衣殼(n)結構蛋白，其中s蛋白負責通過s1亞基中的受體結合結構
域(rbd)與宿主受體結合，以及隨后的膜融合和病毒進入。rbd包含核芯亞結構域和受體結合基序(rbm)。雖然這兩種冠狀病毒之間的核芯亞結構域高度相似，但其rbm顯示出不同的受體特異性：sars-cov識別血管緊張素轉化酶2(ace2)，而mers-cov結合二肽基肽酶4(dpp4)。對于這兩種冠狀病毒，s蛋白都負責感染，并且因此是疫苗設計的主要靶標之一。
[0187]
在我們的研究中，我們在鐵蛋白、e2p和13-01納米粒上展示了mers-cov s三聚體(參見pallesen et al.，pnas，114：e7348-e7357and pdb id：5w9k)，e2p和i3-01構建體中引入了鎖定結構域。s構建體來源于特定的mers-cov毒株(genbank：jx869059)。分子建模表明，mers s fr納米粒的尺寸為34.0nm或更大，并且mers se2p(或i3-01)納米粒的直徑為至少45.2nm(圖11a)。我們使用rbd定向中和抗體mca1開發了抗體柱，以用于mers-cov s和s納米粒的無標簽純化。在expicho細胞中瞬時表達后，使用mca1抗體柱從上清液中提取s融合蛋白，并通過負染em直接進行分析。在s的c末端與鐵蛋白亞基的n末端之間包含10-aa gs接頭(seq id no：24)的mers s-10gs-fr形成了具有在表面上可見的大s刺突的納米粒(圖11b，左)。mers s-10gs-e2p-ld4-padre(圖11b，中)和s-10gs-i3-01-ld7-padre(圖11b，右)形成了具有展示在表面上的二十個s刺突的較大納米粒。然而，em圖像還示出了未組裝的s融合蛋白。
[0188]
為了改善納米粒上s蛋白的穩定性，我們在s與納米粒亞基之間插入了“t4纖維蛋白的c末端三聚化基序”或foldon。在通過s-foldon-10gs-fr(圖11c，左)和s-foldon-10gs-i3-01-ld4-padre(圖11c，右)形成的納米粒上，可以在em圖像中清楚地識別s刺突，證實可以將其他結構組分引入到具有鎖定結構域的納米粒中。
[0189]
實施例11：用于利用ii類融合機制的病毒-hcv的疫苗
[0190]
我們在hcv e2核芯納米粒疫苗的開發中進一步應用了相同的疫苗設計策略。丙型肝炎病毒(hcv)是黃病毒科(flaviviridae)肝炎病毒(hepacivirus)屬的小包膜單鏈正義rna病毒。感染世界人口的1％至2％，hcv是主要的健康負擔之一，導致每年約500,000例死亡和每年估計1.5至2百萬例新感染。hcv具有高的遺傳多樣性，并且可分為7種主要基因型和86種亞型。hcv可以經歷迅速突變，從而在感染的個體內引起病毒準種以逃避宿主免疫系統。然而，在20％至30％的急性感染患者中的自發病毒清除表明，可以利用通過疫苗接種誘導的有效免疫應答來預防hcv感染。e1和e2包膜糖蛋白在hcv包膜上形成異二聚體，其介導病毒進入宿主肝細胞。作為受體結合蛋白，e2與宿主細胞受體cd81和sr-b1直接相互作用，并且是用于中和抗體的主要靶標之一，所述中和抗體主要通過阻斷cd81相互作用來中和hcv。開發了在高度可變區1(hvr1)以及可變區2和3(vr2/3)處具有截短的e2構建體(稱為e2核芯)以促進結構分析。與廣泛中和抗體ar3c(參見kong et al.，science 342(6162)：1090-1094，2013)復合的來源于分離株h77(基因型1a)的e2核芯以及與中和抗體2a12(khan et a1.，nature，509(7500)：381-384，2014)結合的來源于分離株j6(基因型2a)的截短的e2的晶體結構提供了對hcv包膜糖蛋白的免疫識別的首次見解。然而，目前尚無可用于預防hcv感染的許可疫苗。
[0191]
在我們的研究中，我們設計了e2核芯納米粒作為hcv疫苗。我們假設每個在表面上展示24至60個e2核芯的納米粒均可引起對保守e2表位的有效中和抗體應答，并且因此可展現為有希望的hcv疫苗候選物(圖12a)。為了驗證該假設，我們測試了三種納米粒平臺24聚體鐵蛋白(fr)以及60聚體e2p和i3-01，其導致24.5至37.5nm的e2核芯納米粒(圖12b)。在我
們的研究中使用的e2核芯構建體來源于兩個分離株h77(基因型1a)和hk6a(基因型6a)的e2的氨基酸序列。在我們的設計中，e2核芯的c末端通過10-gs接頭(seq id no：24)與納米粒亞基的n末端遺傳融合。將e2核芯融合構建體在expicho或293f細胞中瞬時表達，并通過ar3c抗體柱隨后使用superose 6 10/300gl柱的sec進行純化(圖12c)。對于h77分離株來源的構建體，sec譜顯示所有e2核芯納米粒的高產量和高純度，對于24和60聚體觀察到不同的模式。盡管e2-核芯-10gs-fr產生了對應于聚集體的在8至9ml處的峰，但e2-核芯-10gs-e2p和i3-01構建體二者示出了跟隨在納米粒峰之后的15至20ml處的峰(圖12c)。對于hk6a分離株來源的構建體，顆粒產量和純度的降低伴隨著較低分子量物質的增加。通過bn-page和負染em對sec純化的e2核芯融合蛋白進行了分析，其分別顯示出高分子量條帶和均質納米粒(圖12d和12e)。我們觀察到對e2核芯納米粒的增強的抗體結合，如通過最廣泛中和抗體的ec
50
的高至100倍的改變所表明的(圖12f)。為了進一步研究多價展示對抗原性的作用，我們使用octet和一小組抗體對h77和hk6a來源的e2核芯納米粒針對其各自的e2核芯進行了測試(圖12g)。對于h77和hk6a來源的納米粒二者觀察到了峰抗體結合信號與抗原價之間的相關性：60聚體>24聚體>單體。
[0192]
最后，我們檢查了e2核芯納米粒中鎖定結構域的使用。為此，我們測試了來源于hcv h77分離株的構建體e2-核芯-10gs-e2p-ld4-padre和e2-核芯-10gs-i3-01-ld7-padre。負染em顯示這兩種構建體的干凈、均質的納米粒(圖12h)。值得注意的是，e2-核芯-10gs-e2p-ld4-padre由于通過ld4和padre形成的致密內殼而在em圖像中顯示出實心表面，而沒有ld4和padre的其對應物則顯示為空心。盡管如此，我們的結果證實了hcv e2核芯可以在具有鎖定結構域的納米粒上展示。
[0193]
實施例12：用于利用ii類融合機制的病毒-zikv的疫苗
[0194]
我們還將本文所述的疫苗設計策略應用于寨卡病毒(zikv)diii納米粒疫苗的開發。zikv是黃病毒科的正鏈rna病毒，黃病毒科還包括登革熱病毒(denv)、西尼羅病毒(wnv)、日本腦炎病毒(jev)和黃熱病病毒(yfv)。zikv基因組編碼三種結構蛋白(衣殼、prm和包膜)和七種非結構蛋白(ns1、ns2a/b、ns3、ns4a/b和ns5)。2015年和2016年的zikv爆發引起了全世界公共衛生危機。主要通過伊蚊(aedes)種的蚊子傳播，zikv可引起成年人的格林-巴利綜合征(guillain-barr
é?
syndrome，gbs)和新生兒的小頭畸形。已報道了多種基于包膜(e)的疫苗候選物來在小鼠和nhp中預防zikv感染。然而，zikv感染的抗體依賴性增強(ade)和由于已有的抗黃病毒免疫的發病機制引起了對當前疫苗策略的安全性擔憂。沒有其他更安全更有效的疫苗可用于預防zikv感染。
[0195]
zikv e蛋白由三個結構域di、dii和diii組成。在這三個結構域中，細長的手指狀dii負責e二聚化，并且包含通過病毒和宿主細胞膜的融合觸發ph依賴性進入的保守融合環(fl)。diii形成有助于病毒附著的c末端免疫球蛋白(ig)樣結構域。從具有或不具有預先暴露于denv的zikv感染的供體已鑒定出了許多中和和非中和抗體。通常，diii定向抗體傾向于是zikv特異性的，并且比di/ii定向抗體更強效地中和。后者通常與denv交叉反應，較差地中和，并且在一些情況下明顯增強體內病毒感染。
[0196]
在我們的研究中，我們設計了基于24聚體鐵蛋白(fr)和60聚體e2p和i3-01的diii納米粒作為潛在的zikv疫苗候選物。diii融合構建體基于來源于非洲毒株mr766(genbank：mk105975)和亞洲毒株beh818995(genbank：ku365777)的e蛋白的diii的氨基酸序列。我們
還使用diii定向中和抗體zk2b10(參見yu et al.，jci insight 2(12)：93042，2017)開發了抗體柱，以用于diii納米粒的無標簽純化。將所有diii-fr融合構建體在expicho細胞中瞬時表達，并通過zk2b10抗體柱純化。分子建模表明，在表面上具有diii層的60聚體i3-01將得到～35nm的納米粒(圖13a，左)。在sec譜中，我們觀察到了對應于良好形成的diii-鐵蛋白納米粒的高峰(圖13a，右)。通過bn-page分析了在superose 610/300gl柱上以14ml洗脫的sec級分，其顯示出fr納米粒特征性的高分子量條帶(圖13b)。負染em顯示出良好形成的diii納米粒(圖13c，左)。然而，由于diii的小尺寸和使用了柔性10gs接頭，因此我們無法識別納米粒表面上的diii。根據相同的方案，我們產生了i3-01和e2p融合蛋白，并且通過負染em評估了其納米粒組裝(圖13c，中間和右)。雖然可以在em圖像中容易地看到diii-10gs-i3-01納米粒，但e2p顯示難以進行納米粒組裝，導致低產量。
[0197]
最后，我們檢查了鎖定機制是否可以進一步改善diii在i3-01納米粒上的展示。實際上，負染em顯示出在expicho細胞中以高產量和高純度產生的均質diii-10gs-i3-01-ld7-padre納米粒(圖13d)。總之，我們已經成功地在多種納米粒平臺上展示了zikv diii，并且對于包含鎖定結構域ld7和t細胞表位padre的i3-01納米粒構建體觀察到了最佳特性。
[0198]
實施例13：用于非病毒靶標的疫苗開發-瘧疾疫苗
[0199]
我們已經將我們的疫苗研究進一步擴展到胞內病原體，例如惡性瘧原蟲(瘧疾)和結核分枝桿菌(tb)，以及人蛋白質，例如前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(pcsk9)。我們的主要假設是，納米粒展示將增強對胞內病原體的免疫應答，并破壞對人蛋白質的免疫耐受性。將抗體和t細胞應答作為關鍵的免疫學讀數進行了測量。
[0200]
瘧疾疫苗。惡性瘧原蟲是單細胞原生生物寄生蟲，其在人中引起瘧疾，一種威脅生命的疾病。惡性瘧原蟲可以通過被感染的雌性按蚊(anopheles)的叮咬傳播給人。2017年，惡性瘧原蟲在87個國家中感染了估計2.19億人，約435,000例瘧疾相關的死亡。盡管可以瘧疾，但目前尚無用于預防惡性瘧原蟲感染的許可疫苗。在我們的研究中，我們基于對這種寄生蟲的生命周期重要的三種抗原pfs25、環子孢子蛋白(csp)和網織紅細胞結合蛋白同源物5(pfrh5)開發了瘧疾納米粒疫苗。
[0201]
第一種抗原pfs25是在寄生蟲的合子和動合子形式的表面上表達的25kda的性階段抗原。抗pfs25抗體可阻止蚊媒的中腸中惡性瘧原蟲卵囊的發育。目前，pfs25是最成熟的傳播阻斷疫苗(tbv)候選物，并已在人體臨床試驗中進行了測試。通過由用佐劑montanide isa 51中可溶性pfs25的人疫苗接種誘導的抗pfs25抗體在標準膜飼喂測定(smfa)中具有作用，并阻止惡性瘧原蟲的實驗室和野外分離株二者的發育。已經確定了與從人源化小鼠中分離的單克隆抗體復合的pfs25的結構(參見scally et al.，nat commun，8∶1568，2017)，為合理疫苗設計提供了基礎(圖14a)。
[0202]
我們已經測試了兩種抗-pfs25抗體fab1260和fab1269(圖14b)從細胞上清液中純化pfs25的能力。基于elisa數據，選擇fab1260填充抗體柱以用于pfs25納米粒的無標簽純化。我們還設計了“頸部”區域，以促進具有平坦的l形結構的pfs25在納米粒表面上的多價展示(圖14c)。更具體地，將來源于病毒蛋白的三螺旋束在具有或不具有接頭的情況下插入pfs25與納米粒亞基之間(圖14c)。結合多種納米粒平臺測試了來源于亨德拉病毒結構域(pdb id：4heo)和麻疹病毒結構域(pdb id：1oks)的兩種螺旋束，稱為“neck1”和“neck2”。將所有融合構建體在expicho細胞中表達，隨后使用fab1260抗體柱純化。將fab1260純化的
融合蛋白通過負染em進行表征，其示出了針對僅含neck1的構建體的納米粒(圖14d)。具體地，pfs25-neck1-10gs-fr納米粒顯示出最高的產量和純度，如通過em指示的(圖14d，左)。pfs25-neckl-e2p-ld4-padre構建體顯示產生了良好形成的納米粒和聚集體的混合物(圖14d，中間)。pfs25-neck1-10gs-i3-01-ld7-padre構建體以與鐵蛋白構建體類似的高純度但是略低的產量產生了納米粒(圖14d，右)。該結果與以下事實一致：圍繞每個3次對稱軸的i3-01的n末端具有5nm的大間距，其適合于展示大的不規則形狀的蛋白質，例如pfs25。總之，pfs25可以展示在具有鎖定結構域和t細胞表位的60聚體納米粒上。
[0203]
第二種抗原環子孢子蛋白(csp)是瘧原蟲寄生蟲子孢子階段的分泌蛋白，對子孢子功能和肝細胞的入侵至關重要。csp是rts，s疫苗(mosquirix
tm
)中使用的抗原，該疫苗目前正處于人臨床試驗中。作為臨床上最先進的疫苗候選物，rts，s/as01(rts，s)已顯示在兒童中提供針對瘧疾的部分保護。csp包含含有信號肽序列和結合硫酸肝素蛋白聚糖并具有保守的蛋白水解切割位點的區域i的n末端區域；包含四氨基酸基序nanp或nvdp的許多重復的中央區域；以及包含區域ii[血小板反應蛋白(tsp)樣結構域]和典型糖基磷脂酰肌醇(gpi)錨定添加序列的c末端區域(圖15a，頂部)。rts，s疫苗包含來自csp的189個氨基酸(第199至387位氨基酸)，包括最后18個nanp重復序列和不包含gpi錨定添加序列的c末端，與乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)連接(圖15a，底部)。
[0204]
在我們的研究中，我們采取了逐步策略來設計具有鎖定結構域的csp納米粒疫苗(圖15b)，即，我們在納米粒上展示了csp蛋白的最小b細胞表位(步驟1)、全長b細胞表位(步驟2)、全長b細胞表位加上c末端t細胞表位(步驟3)和rts，s抗原(步驟4)。為了能夠進行無標簽純化，我們使用fab1450填充了抗體柱，對于其已確定了具有nanp(seq id no：27)重復的復雜結構(圖15a，左下)。將所有csp融合構建體在25ml expicho細胞中瞬時表達，隨后進行fab1450純化和負染em分析。在步驟1中，我們在兩種納米粒上展示了最小b細胞表位，5個nanp重復(nanp5)。我們對于所有測試的構建體均觀察到了極高的產量。負染em顯示高純度nanp5-5gs-fr和nanp5-10gs-fr納米粒，而沒有任何其他蛋白質物質(圖15c，左和中)。我們還表達了nanp5-5gs-padre-i3-01-ld7構建體，其以高產量和高純度形成了均質納米粒(圖15c，右)。因此，我們的結果證實了fab1450抗體柱的效用以及具有和不具有鎖定結構域的nanp5納米粒組裝。在步驟2中，我們在三種納米粒平臺上展示了rts，s疫苗抗原nanp19中的全長b細胞表位以用于負染em分析(圖15d)。盡管nanp重復的數目顯著增加，但是所有構建體均形成具有高產量和高純度的均質納米粒。因此，我們的結果證實了具有和不具有鎖定結構域的nanp19納米粒組裝。
[0205]
在步驟3中，我們設計和表征了六種融合構建體，其全部包含全長b細胞表位nanp19和c末端t細胞表位αtsr結構域以及其之間的5gs接頭(seq id no：17)。負染em證實nanp19-5gs-αtsr可以成功展示在具有和不具有鎖定結構域的所有三種納米粒平臺上(圖15e)。由于nanp19-5gs-αtsr包含了rts，s抗原中所有在結構和功能上確定的組分，并且僅在接頭上有所不同，因此兩種抗原應具有相同的特征。
[0206]
我們進一步利用sec評估了在25ml expicho細胞中產生的這些nanp19-5gs-αtsr納米粒的產量和純度(圖15f)。與em數據一致，nanp19-5gs-αtsr納米粒顯示出高純度，如通過sec譜中的單峰指示的。在產量方面，我們觀察到了納米粒特異性模式：fr>e2p>i3-01。總之，我們基于csp的結構和抗原組分的多種組合開發了一系列瘧疾疫苗候選物，其全部可以
展示在具有鎖定結構域的60聚體納米粒上。
[0207]
第三抗原惡性瘧原蟲網織紅細胞結合蛋白同源物5(pfrh5)是紅細胞入侵所需的裂殖子黏附素。通過與紅細胞表面蛋白basigin(也稱為cd147和emmprin)的相互作用，pfrh5是唯一證明對所有測試毒株的紅細胞入侵都是必需的成員(參見wong et al.，nature 565：118-121，2019)。已經確定了pfrh5的晶體結構(參見wright et al.，nature 515：427-430，2014)。我們還基于抗體9ad4和qa1開發了抗體柱，以用于pfrh5和pfrh5納米粒的無標簽純化。我們設計了融合構建體以在具有和不具有鎖定結構域的納米粒上展示pfrh5。
[0208]
實施例14：用于非病毒靶標的疫苗開發-結核病疫苗
[0209]
結核病(tb)是由結核分枝桿菌細菌引起的潛在的嚴重傳染病，其主要感染肺。感染了全世界人口的25％，tb在2017年造成高至1000萬例疾病病例，導致130萬例死亡。盡管卡介苗(bacille calmette-gu
é
rin，bcg)疫苗已在tb很普遍的國家廣泛使用，但其并未提供針對tb的全面保護。已經開發了許多針對結核分枝桿菌的新型結核病疫苗候選物，其目前處于人臨床試驗中(參見khoshnood et al.int.j.biol.macromol.120：180-188，2018)。
[0210]
在我們的研究中，我們在納米粒上展示了兩種tb抗原。第一種抗原ag85復合物通過催化霉菌酸轉移到細胞壁阿拉伯半乳聚糖并通過合成海藻糖二霉菌酸酯(索狀因子)來維持細胞壁的完整性。ag85是高度免疫原性的，并且可以誘導強效的t細胞和抗體應答。最新的疫苗試驗報告了bcg疫苗接種后嬰兒中針對ag85a的升高的抗體滴度，并且更重要的是，ag85a特異性igg與降低的tb風險相關。我們已經在hek293 f細胞中分別表達了ag85a、ag85b和ag85c，并且觀察到ag85a和ag85b的良好折疊單體，但觀察到ag85c的三聚體蛋白。我們設計了融合構建體，以在具有和不具有鎖定結構域的納米粒上展示ag85a、ag85b和ag85c。由于尚未報道針對ag85的抗體，因此我們利用噬菌體展示技術鑒定了ag85結合抗體，以用于ag85a、ag85b和ag85c納米粒的無標簽純化。
[0211]
第二種抗原mtb72是由mtb32和mtb39構成的融合蛋白。mtb72已與gsk佐劑as01組合使用，并在臨床試驗中顯示出54.0％的效力(參見meeren et al.，n.engl.j.med.，379：1621-1634，2018)。我們已經在hek293f細胞中將mtb32和mtb39表達為單獨的抗原，并觀察到相對較低的產量。我們設計了在具有和不具有鎖定結構域的納米粒上展示的具有mtb32和mtb39的融合構建體。我們已經進行了噬菌體文庫篩選，以選擇用于填充抗體柱的抗體。由于這些tb抗原是類似于hcv e2和zikv diii的單體(ag85a、ag85b和mtb32)或類似于hiv-1env和埃博拉gp的三聚體(ag85c和mtb39)，因此所得的tb納米粒表現出大致相似的特性。
[0212]
實施例15：針對非病毒靶標的疫苗開發-pcsk9疫苗
[0213]
兩種類型的脂蛋白攜帶膽固醇進出細胞：低密度脂蛋白(或ldl)和高密度脂蛋白(或hdl)。由于ldl導致動脈中的脂肪堆積，因此ldl膽固醇被認為是“壞”膽固醇。血液中ldl膽固醇水平升高與心血管疾病的風險增加相關，心血管疾病是西方國家過早死亡的常見原因之一。前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶kexin 9型(pcsk9)通過控制ldl受體(ldl-r)的降解來調節血清ldl膽固醇(ldl-c)。pcsk9是一種74kda的絲氨酸蛋白酶，其包含三個結構域：n末端前結構域、枯草桿菌蛋白酶樣催化結構域和c末端富含半胱氨酸/組氨酸的結構域(ctd)(圖16a)。pcsk9經歷了自催化切割，但14kda的前結構域仍非共價地附著于催化結構域，并使蛋白酶失活。已經發現功能喪失的pcsk9突變與較低的ldl膽固醇濃度和降低的心
臟病風險相關。由于這些功能喪失突變不會引起有害的副作用，因此疫苗誘導的抗體對pcsk9的抑制是用于降低ldl膽固醇濃度的有吸引力的策略。解析了與多種配體復合的全長和截短的pcsk9的晶體結構，為疫苗設計提供了合理的基礎(圖16a)。
[0214]
在我們的研究中，我們在具有或不具有鎖定結構域的所有三種納米粒平臺上展示了pcsk9。由于pcsk9的大尺寸和不規則形狀，我們采用了與pfs25納米粒中所使用的相似的“頸部”設計(圖16b)。簡單地說，將病毒來源的三螺旋束(亨德拉病毒結構域)在pcsk9與納米粒亞基之間插入構建體中。我們已使用由輝瑞公司開發的強效抗pcsk9抗體j16填充了抗體柱(參見liang et a1.，j pharm exp ther，340(2)：228-236，2012)，以用于pcsk9和pcsk9納米粒的無標簽純化。在expicho細胞中瞬時表達后，通過j16抗體柱從上清液中提取融合蛋白，并通過負染em進行分析。我們首先測試了沒有頸部設計的兩種融合構建體(圖16c)。盡管pcsk9-10gs-fr形成均質的納米粒(圖16c，左)，但pcsk9-5gs-padre-i3-01-ld7未能組裝，可能是由于pcsk9的大尺寸和不規則形狀(圖16c，右)。然后，我們表達了包含neck1的納米粒構建體(圖16d)。盡管兩種鐵蛋白構建體均形成納米粒，但是在neck1與鐵蛋白之間具有較長接頭的pcsk9-10gs-neckl-10gs-fr以更高的產量和純度產生了納米粒(圖16d，圖1和2)。盡管在兩個em圖像中均觀察到未組裝的融合蛋白，但是具有展示在外部并且與鎖定結構域(ld7)的c末端融合的padre的兩種i3-01構建體形成了形態稍有不同的納米粒(圖16d，圖3和圖4)。
[0215]
總之，pcsk9可以在具有頸部結構域、鎖定結構域和t細胞表位padre的60聚體i3-01以及24聚體鐵蛋白上展示，提供比pcsk9作為納米粒更有效的疫苗候選物能夠打破自我耐受并誘導更高滴度的抗體應答。
[0216]
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[0217]
因此，已經參考上述代表性實施方案對本發明進行了廣泛的公開和說明。應當理解，在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，可以對本發明進行多種修改。
[0218]
還應注意，本文引用的所有出版物、序列登錄號、專利和專利申請均通過引用整體地并出于所有目的明確地并入于此，如同各自單獨地被如此指出。在與本公開內容中的定義相抵觸的程度上，排除了通過引用并入的文本中包含的定義。
技術特征：
1.疫苗組合物，其包含展示在自組裝納米粒的表面上的多肽免疫原，其中鎖定結構域嵌入在所述納米粒內部并且與所述自組裝納米粒的亞基連接，并且其中所述鎖定結構域是蛋白質亞基，其能夠在溶液中與和附近納米粒亞基連接的另一鎖定結構域通過界面處的非共價相互作用自然形成二聚體。2.權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述鎖定結構域是與另一相同蛋白質結構域形成同二聚體的蛋白質結構域。3.權利要求2所述的疫苗組合物，其中所述鎖定結構域的亞基包含如seq id no：1至9中任一個中所示的氨基酸序列、其保守修飾的變體或實質上相同的序列。4.權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述鎖定結構域與所述納米粒的亞基共價連接。5.權利要求4所述的疫苗組合物，其中所述鎖定結構域的n末端通過接頭序列與所述納米粒亞基的c末端融合。6.權利要求1所述的疫苗組合物，其還包含泛反應性t細胞表位。7.權利要求6所述的疫苗組合物，其中所述t細胞表位的n末端與所述鎖定結構域的c末端融合。8.權利要求1所述的疫苗組合物，其還包含插入在所述免疫原與所述納米粒亞基之間的頸部區域，其中所述頸部區域包含3-螺旋蛋白結構域，其將所述免疫原升高以進一步遠離所述納米粒的表面。9.權利要求1所述的疫苗組合物，其還包含插入在所述免疫原與所述納米粒亞基之間的蛋白質結構域，其中所述蛋白質結構域使免疫原多肽穩定。10.權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述納米粒是具有旋轉對稱性的球形納米粒。11.權利要求11所述的疫苗組合物，其中所述旋轉對稱性具有3次對稱軸和/或5次對稱軸。12.權利要求11所述的疫苗組合物，其中所述納米粒具有二十面體結構。13.權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述多肽免疫原是病毒免疫原。14.權利要求13所述的疫苗組合物，其中所述多肽免疫原是來自利用i類融合機制的病毒的病毒免疫原。15.權利要求14所述的疫苗組合物，其中所述病毒選自hiv-1病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、沙粒病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)和冠狀病毒。16.權利要求13所述的疫苗組合物，其中所述多肽免疫原是來自利用ii類融合機制的病毒的病毒免疫原。17.權利要求16所述的疫苗組合物，其中所述病毒是hcv或寨卡病毒。18.權利要求13所述的疫苗組合物，其中所述多肽免疫原是非病毒免疫原。19.權利要求18所述的疫苗組合物，其中所述多肽免疫原是來自惡性瘧原蟲(plasmodium falciparum)的抗原、來自結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，tb)的抗原、或人蛋白質前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(pcsk9)。20.權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述多肽免疫原是hiv-1env來源的三聚體蛋白。21.權利要求20所述的疫苗組合物，其中所述鎖定結構域的n末端通過包含ggggs(seq id no：17)的一個或更多個串聯拷貝的接頭序列與所述納米粒亞基的c末端融合。
22.權利要求20所述的疫苗組合物，其還包含泛反應性t細胞表位。23.權利要求22所述的疫苗組合物，其中所述t細胞表位的n末端與所述鎖定結構域的c末端融合。24.權利要求22所述的疫苗組合物，其中所述t細胞表位包含序列akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。25.權利要求20所述的疫苗組合物，其中所述hiv-1三聚體蛋白的亞基的c末端與所述納米粒的亞基的n末端共價連接。26.權利要求20所述的疫苗組合物，其中所述hiv-1三聚體蛋白亞基通過接頭序列與所述納米粒亞基融合。27.權利要求26所述的疫苗組合物，其中所述接頭序列包含序列(gasb)n，其中a為1至5的整數，b為1至2的整數，并且n為1至5的整數。28.權利要求20所述的疫苗組合物，其中所述自組裝納米粒包含三聚體序列。29.權利要求20所述的疫苗組合物，其中所述自組裝納米粒的亞基包含如以下中所示的多肽：seq id no：21(e2p)、seq id no：22(i3-01)、seq id no：25(i3-01變體)或seq id no：26(鐵蛋白)、其保守修飾的變體或實質上相同的序列。30.權利要求20所述的疫苗組合物，其中所述hiv-1env來源的三聚體蛋白來源于gp140。31.權利要求20所述的疫苗組合物，其中所述hiv-1env來源的三聚體蛋白是未切割的融合前優化(ufo)gp140三聚體。32.權利要求31所述的疫苗組合物，其中所述ufo gp140三聚體是包含來自hiv-1毒株bg505的經修飾gp41
ecto
結構域的嵌合三聚體。33.權利要求31所述的疫苗組合物，其中所述ufo gp140三聚體的亞基包含seq id no：23中所示的序列、其保守修飾的變體或實質上相同的序列。34.權利要求31所述的疫苗組合物，其具有從n末端到c末端包含以下的亞基序列：如seq id no：23中所示的hiv-1env來源的ufo gp140三聚體亞基、如seq id no：21(e2p)中所示的自組裝納米粒亞基、如seq id no：1(ld4)中所示的鎖定結構域，以及t細胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。35.權利要求34所述的疫苗組合物，其還包含在所述gp140三聚體亞基與所述納米粒亞基之間的第一接頭序列(ggggs)2(seq id no：24)，和/或在所述納米粒亞基與所述鎖定結構域之間的第二接頭序列ggggs(seq id no：17)。36.權利要求31所述的疫苗組合物，其具有從n末端到c末端包含以下的亞基序列：如seq id no：23中所示的hiv-1env來源的ufo gp140三聚體、如seq id no：22或25(i3-01)中所示的自組裝納米粒亞基、seq id no：2(ld7)中所示的鎖定結構域，以及t細胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。37.權利要求36所述的疫苗組合物，其還包含在所述gp140三聚體亞基與所述納米粒亞基之間的第一接頭序列(ggggs)2(seq id no：24)，和/或在所述納米粒亞基與所述鎖定結構域之間的第二接頭序列ggggs(seq id no：17)。38.藥物組合物，其包含權利要求1所述的疫苗組合物以及可藥用載體。39.多核苷酸，其編碼包含n末端免疫原多肽、自組裝納米粒亞基和鎖定結構域亞基的
融合蛋白；其中所述鎖定結構域是蛋白質亞基，其能夠在溶液中與和附近納米粒亞基連接的另一鎖定結構域通過界面處的非共價相互作用自然形成二聚體。40.在對象中或預防hiv-1感染的方法，其包括向所述對象施用包含有效量的權利要求20所述的hiv-1疫苗組合物的藥物組合物，從而在所述對象中或預防hiv-1感染。
技術總結
本發明提供了用鎖定結構域穩定的新的納米粒展示疫苗組合物。在所述疫苗組合物的制備中可以使用多種免疫原，包括病毒免疫原例如HIV
