一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法
1.本發(fā)明涉及家禽卵泡體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法。
背景技術(shù)：
2.蛋雞的卵泡發(fā)育過程中大部分的卵泡發(fā)生了閉鎖，只有少數(shù)卵泡能通過卵泡選擇進一步發(fā)育成熟，而小黃卵泡階段是從白卵泡庫選擇卵泡進一步發(fā)育和積累卵黃物質(zhì)的關(guān)鍵階段。不同于哺乳動物，家禽卵泡發(fā)育過程中多種類固醇激素的合成和分泌需要卵泡的顆粒細胞和膜細胞共同參與，家禽的卵泡發(fā)育是一個連續(xù)且復雜的過程，除了卵泡的顆粒細胞和膜細胞外，卵泡的發(fā)育還受到與其相關(guān)的微環(huán)境生長因子，類固醇激素等多方面的作用，他們對卵泡的發(fā)育具有重要的作用。
3.目前的卵泡細胞研究主要限制在無法準確復制體內(nèi)的表型和遺傳學特征，常規(guī)家禽卵泡原代顆粒細胞和膜細胞的體外培養(yǎng)方法不足以反映家禽體內(nèi)卵泡發(fā)育的真實變化。
4.相對常規(guī)的細胞培養(yǎng)，雞的卵泡離體培養(yǎng)模型成本更低，用時短具有更高的效率，試圖模擬出雞體內(nèi)卵泡在不同狀態(tài)下的變化，盡可能的保留組織的完整性反映出雞卵泡發(fā)育過程的真實過程。
5.因此，建立高效的小黃卵泡體外卵泡培養(yǎng)模型，對研究家禽卵泡發(fā)育及微環(huán)境因子對其調(diào)控的機制具有重要的意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
6.有鑒于此，本發(fā)明提供了一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法。工藝流程參見圖1，相比于常規(guī)的顆粒細胞或者膜細胞培養(yǎng)，保留了細胞間的相互作用，能夠更大成度上復刻體內(nèi)環(huán)境中卵泡的真實情況，并且克服了傳統(tǒng)卵泡原代細胞培養(yǎng)周期長難存活容易污染的缺點，填補了家禽小黃卵泡體外培養(yǎng)的空白，建立了快速高效的體外家禽卵泡培養(yǎng)模型。
7.為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
8.一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法，包括以下步驟：
9.1)將篩選后的小黃卵泡轉(zhuǎn)移到pet細胞培養(yǎng)小室上層，并加入預熱好的生長培養(yǎng)基，得培養(yǎng)物；
10.2)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到38.5℃，5％co2的環(huán)境下培養(yǎng)。
11.有益效果在于：培養(yǎng)溫度提高更接近雞體內(nèi)的溫度40.8～41.5℃。
12.優(yōu)選的：步驟1)篩選的標準：結(jié)構(gòu)完整表面無血污，直徑6～8mm；pet細胞培養(yǎng)小室：24孔0.45μm，每個孔放1枚小黃卵泡；預熱：37℃水浴鍋進行預熱40min，生長培養(yǎng)基的加入量：每孔1ml。
13.有益效果在于：相對于哺乳動物，家禽卵巢中有連續(xù)大小不等的各時期卵泡且不需要同期發(fā)情，取材方便是研究卵泡發(fā)育的理想模型；
14.pet細胞培養(yǎng)小室作為通透性的支架進行卵泡培養(yǎng)。
15.進一步的，卵泡位于培養(yǎng)小室上層濾膜上，孔徑與卵泡直徑接近，可以模擬體內(nèi)與卵巢相連接的結(jié)締組織在體外給予卵泡支撐作用，能夠概括卵泡發(fā)育過程中的復雜性和動態(tài)性；
16.青霉素-鏈霉素溶液、its液體培養(yǎng)基補充劑、胎牛血清fbs均為體積占比。
17.優(yōu)選的：pet細胞小室各孔間隙加入濕度平衡液，濕度平衡液：20μl滅菌的pbs。
18.優(yōu)選的：生長培養(yǎng)基：含有1％青霉素-鏈霉素溶液，1％its液體培養(yǎng)基補充劑，5％胎牛血清fbs和1000nm活性vd3的dmem培養(yǎng)基。
19.有益效果在于：dmem培養(yǎng)基添加1％雙抗，降低采樣轉(zhuǎn)運過程中污染的可能；
20.活性vd3具有促進卵泡細胞增殖和雌激素孕激素合成的作用，彌補體外培養(yǎng)系統(tǒng)較體內(nèi)發(fā)育卵泡的不足，促進卵泡的增殖和存活。
21.優(yōu)選的：步驟2)培養(yǎng)的時間：72h。
22.優(yōu)選的：步驟2)每24小時更換一次生長培養(yǎng)基，更換時，收集替換下的生長培養(yǎng)基用于雌激素和孕激素含量的測定。
23.優(yōu)選的：步驟2)每間隔12小時觀察卵泡生長情況和培養(yǎng)基消耗情況，并進行十字晃動，十字晃動：頻率為20～30次每分鐘，搖晃10次。
24.有益效果在于：保證組織充分接觸氣體，模擬體內(nèi)的動態(tài)環(huán)境。
25.本發(fā)明還提供了上述任一的方法在和顆粒細胞或者膜細胞共培養(yǎng)中的應用。
26.進一步的：在下層鋪細胞實現(xiàn)和顆粒細胞或者膜細胞的共培養(yǎng)，更好的模擬出卵泡發(fā)育過程中細胞的作用和功能。
27.本發(fā)明還提供了上述任一的方法培養(yǎng)的雞小黃卵泡。
28.經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明公開提供了一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法，取得的技術(shù)效果：
29.1)在無菌條件下采用純機械法分離小黃卵泡，最大程度上保留了卵泡的完整性，減少了對卵泡結(jié)構(gòu)完整性和發(fā)育潛力的影響。
30.2)采用24孔0.4μm的pet細胞小室進行體外卵泡培養(yǎng)，進一步模擬體內(nèi)環(huán)境在體外給予卵泡支撐功能。
31.3)卵泡在38.5℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)更接近于雞體內(nèi)的溫度，模擬真實情況。
32.4)在dmem培養(yǎng)基中添加活性vd3，調(diào)控體外培養(yǎng)系統(tǒng)類固醇的代謝，促進卵泡的增殖和存活。
附圖說明
33.為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。
34.圖1附圖為本發(fā)明提供的體外培養(yǎng)小黃卵泡流程示意圖。
35.圖2附圖為本發(fā)明提供的直徑6～8毫米的小黃卵泡圖。
36.圖3附圖為本發(fā)明提供的小黃卵泡在pet細胞培養(yǎng)小室中培養(yǎng)圖。
37.圖4附圖為本發(fā)明提供的he染檢測卵泡的形態(tài)圖。
38.圖5附圖為本發(fā)明提供的brdu檢測有無活性vd3卵泡增殖圖。
39.圖6附圖為本發(fā)明提供的有無活性vd3培養(yǎng)液中雌激素含量變化趨勢圖。
40.圖7附圖為本發(fā)明提供的有無活性vd3培養(yǎng)基中孕激素含量變化趨勢圖。
具體實施方式
41.下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
42.本發(fā)明實施例公開了一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法。
43.實施例中，未提及的實驗材料均為常規(guī)市售材料，未提及的實驗方法為常規(guī)實驗方法，例如，青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)；gibco，批號：15140-122
44.dmem培養(yǎng)基；gibco，批號：c11995500bt
45.its液體培養(yǎng)基補充劑(100x)；sigma批號：i3146
46.胎牛血清fbs(fetalbovineserum)；gibco，批號10099-133
47.pet細胞培養(yǎng)小室；labselect；批號：14341
48.活性vd3(粉末)(calcitriol)；mce；批號：hy-10002
49.5-溴脫氧尿嘧啶核苷：brdu；mce，批號：hy-15910
50.通用型組織固定液：博爾夫生物；批號b0038
51.肌肉固定液：博爾夫生物；批號：b0007
52.(無菌)pbs：nacl16g，na2hpo412h2o5.8g，kcl0.2g，kh2po40.48g；調(diào)整ph為7.2并定容至2l，無菌過濾后進行高壓滅菌，滅菌后的pbs加入1％青霉素-鏈霉素溶液(試驗使用的pbs皆添加1％雙抗)；
53.解剖培養(yǎng)基：在無菌條件下將dmem培養(yǎng)基分裝到50ml離心管中，加入1％青霉素-鏈霉素溶液(在4℃冰箱保存用于分離后小黃卵泡的轉(zhuǎn)運，取樣后將裝有培養(yǎng)基和卵泡的離心管置于冰盒中帶到細胞房)；
54.活性vd3工作液體：將保存在-80
°
冰箱的10mg活性vd3粉末，在避光條件下加入無水乙醇配成10mm的活性vd3母液，根據(jù)需要將母液稀釋(0～1000nm)作為工作液備用，母液置于-20
°
保存一個月，-80
°
冰箱保存6個月；
55.生長培養(yǎng)基：取5ml無菌的fbs，加入1ml青霉素-鏈霉素溶液和1ml的its培養(yǎng)基補充劑，再加入93mldmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基和10μl活性vd3母液，配制成1000nm活性vd3的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基要現(xiàn)配現(xiàn)用；
56.小黃卵泡來源，取離體小黃卵泡或采用下列方法制備：
57.1)選擇產(chǎn)蛋周期規(guī)律的海蘭褐蛋雞(35～45周齡)頸靜脈放血致死，迅速剖開腹腔取下整個完整的卵巢，無菌條件下用預冷的pbs漂洗表面血污(盡量取出卵泡表面的血液和油脂)，根據(jù)卵泡直徑大小摘取6～8mm小黃卵泡置于50ml無菌的離心管中，用解剖培養(yǎng)基(含有1％雙抗的dmem培養(yǎng)基)暫時保存。
58.2)將卵泡放到冰盒中帶到細胞房，轉(zhuǎn)移到滅菌超過30分鐘的超凈臺上進行操作。在培養(yǎng)皿中用預冷的無菌pbs將小黃卵泡漂洗3～5次，對肉眼可見的血污可以用無菌的尖
頭細胞鑷子夾住卵泡與卵巢基質(zhì)連接的一端，用另一把鑷子輕輕刮掉卵泡表面的血污，漂洗期間輕輕十字晃動培養(yǎng)皿盡可能的漂洗干凈卵泡表面血污，最后用眼科剪剪掉卵泡上多余的結(jié)締組織，全程動作輕柔保持卵泡的結(jié)構(gòu)完整性。
59.蘇木精-伊紅(h-e)染：
60.1)石蠟切片的制備：培養(yǎng)結(jié)束后取小黃卵泡置于通用型組織固定液中固定24h，再更換成肌肉固定液固定24h。隨后按常規(guī)方法進行洗滌脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(選取卵泡最大面)和烤片。
61.2)蘇木精-伊紅(h-e)染：按常規(guī)方法對切片進行脫蠟、浸水、染核、分、藍化、質(zhì)染、脫水、透明和封片。
62.實施例1
63.一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法
64.1)將配制好的生長培養(yǎng)基置于37℃水浴鍋進行提前預熱，挑選結(jié)構(gòu)完整表面無血污的小黃卵泡從培養(yǎng)皿中分離出來(參見圖2)，轉(zhuǎn)移到24孔0.45μm的pet細胞培養(yǎng)小室上層(pet細胞小室各孔間隙加入濕度平衡液，濕度平衡液：20μl滅菌的pbs)，每個孔放1枚小黃卵泡，并加入1ml預熱(37℃水浴鍋進行預熱40min)的生長培養(yǎng)基(含有1％青霉素-鏈霉素溶液，1％its培養(yǎng)基補充液，5％胎牛血清fbs和1000nm活性vd3的dmem培養(yǎng)基)(圖3a、b)。將所有培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)移到38.5℃，5％co2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，每24小時更換一次生長培養(yǎng)基(更換時，收集替換下的生長培養(yǎng)基用于雌激素和孕激素含量的測定)，間隔12小時觀察卵泡生長情況和培養(yǎng)基消耗情況，并進行晃動(十字晃動：頻率為20～30次每分鐘，搖晃10次)來模擬體內(nèi)的動態(tài)環(huán)境。
65.2)每次換液(生長培養(yǎng)基)時用無菌的1.5mlep管收集卵泡培養(yǎng)基用于雌激素和孕激素含量的測定，并在培養(yǎng)的第48小時向生長培養(yǎng)基中加入20μg/ml的brdu來檢測小黃卵泡在體外培養(yǎng)環(huán)境中的增殖情況。
66.操作要求(重點)
67.1)全程需要無菌操作。
68.2)卵泡分離和轉(zhuǎn)移控制在40～60分鐘內(nèi)(4～6只母雞卵巢)。
69.3)卵泡每次拿出培養(yǎng)箱不超過10分鐘。
70.4)每間隔24小時更換一次培養(yǎng)基，間隔12小時進行一次晃動。
71.5)培養(yǎng)箱溫度38.5℃，5％co2條件進行培養(yǎng)。
72.技術(shù)效果：
73.小黃卵泡的存活和生長
74.挑選出形態(tài)正常結(jié)構(gòu)完整且潔凈直徑在6～8毫米之間的卵泡，進行體外培養(yǎng)72小時。體外培養(yǎng)過程中小黃卵泡能維持正常的形態(tài)(圖4)，通過brdu檢測了小黃卵泡的體外增殖，相同條件下添加1000nm活性vd3工作液體促進了體外卵泡的增殖(圖5)，成功的實現(xiàn)了小黃卵泡在體外培養(yǎng)環(huán)境中的存活和生長。24、48和72小時檢測培養(yǎng)液中卵泡合成的主要功能產(chǎn)物雌激素與孕激素的濃度變化，相同條件下添加1000nm活性vd3的培養(yǎng)基能顯著提高雌激素和孕激素的含量，并隨著時間的增加表現(xiàn)出明顯的促進作用(圖6和圖7)。
75.此外，本發(fā)明多次重復實驗，試驗的結(jié)果是成功的，實現(xiàn)了發(fā)明的目的。
76.本說明書中各個實施例采用遞進的方式描述，每個實施例重點說明的都是與其他
實施例的不同之處，各個實施例之間相同相似部分互相參見即可。
77.對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。
技術(shù)特征：
1.一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)將篩選后的小黃卵泡轉(zhuǎn)移到pet細胞培養(yǎng)小室上層，并加入預熱的生長培養(yǎng)基，得培養(yǎng)物；2)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到38.5℃，5％co2的環(huán)境下培養(yǎng)。2.如權(quán)利要求1所述的一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法，其特征在于，步驟1)所述篩選的標準：結(jié)構(gòu)完整表面無血污，直徑6～8mm；所述pet細胞培養(yǎng)小室：24孔0.45μm，每個孔放1枚小黃卵泡；所述預熱：37℃水浴鍋進行預熱40min，所述生長培養(yǎng)基的加入量：每孔1ml。3.如權(quán)利要求2所述的一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法，其特征在于，所述pet細胞小室各孔間隙加入濕度平衡液，所述濕度平衡液：20μl滅菌的pbs。4.如權(quán)利要求3所述的一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法，其特征在于，所述生長培養(yǎng)基：含有1％青霉素-鏈霉素溶液，1％its液體培養(yǎng)基補充劑，5％胎牛血清fbs和1000nm活性vd3的dmem培養(yǎng)基。5.如權(quán)利要求4所述的一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法，其特征在于，步驟2)所述培養(yǎng)的時間：72h。6.如權(quán)利要求5所述的一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法，其特征在于，步驟2)每24小時更換一次生長培養(yǎng)基，更換時，收集替換下的生長培養(yǎng)基用于雌激素和孕激素含量的測定。7.如權(quán)利要求6所述的一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法，其特征在于，步驟2)每間隔12小時觀察卵泡生長情況和培養(yǎng)基消耗情況，并進行十字晃動，所述十字晃動：頻率為20～30次每分鐘，搖晃10次。8.權(quán)利要求1～7任一所述的方法在和顆粒細胞或者膜細胞共培養(yǎng)中的應用。9.權(quán)利要求1～7任一所述的方法培養(yǎng)的雞小黃卵泡。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種體外培養(yǎng)雞小黃卵泡的方法。涉及家禽卵泡體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。包括將篩選后的小黃卵泡轉(zhuǎn)移到PET細胞培養(yǎng)小室上層，并加入預熱好的生長培養(yǎng)基，得培養(yǎng)物；將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到38.5℃，5％CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。本發(fā)明采用PET細胞小室進行體外卵泡培養(yǎng)，進一步模擬體內(nèi)環(huán)境在體外給予卵泡支撐功能；卵泡在38.5℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)更接近于雞體內(nèi)的溫度，模擬真實情況；在DMEM培養(yǎng)基中添加活性VD3，調(diào)控體外培養(yǎng)系統(tǒng)類固醇的代謝，促進卵泡的增殖和存活。泡的增殖和存活。泡的增殖和存活。
