固體形式的周期蛋白依賴性激酶9抑制劑及其用途的制作方法
固體形式的周期蛋白依賴性激酶9抑制劑及其用途
1.相關申請
2.本技術要求2021年6月9日提交的中國專利申請202110644313.0號的優先權，通過引用的方式將該申請的全部內容整體并入本文，用于所有目的。
技術領域
3.本技術涉及一種固體形式的作為周期蛋白依賴性激酶9(cdk9)抑制劑的化合物，及其在制備cdk9相關病癥藥物中的應用。
背景技術：
4.細胞周期蛋白依賴性激酶(cdks)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調節細胞周期和轉錄中起關鍵作用。截至目前，已知約有20余種人類cdk亞型以及約30種細胞周期伴侶蛋白，這些cdks可以被細胞周期蛋白所激活，發揮著不同的生物學功能，cdk按照功能可分為兩種，一種控制細胞周期，一種調節細胞轉錄。例如，cdk1、2、3、4和6直接干預細胞周期；cdk5不調節細胞周期，但在有絲分裂后神經元復雜遷移中起到關鍵作用；cdk7間接充當這些cdk的激活劑；cdk9僅在細胞轉錄中起作用，而不參與細胞周期的調節。
5.cdk9是轉錄cdks亞家族的重要成員，該家族是一組激酶，其功能是控制真核rna聚合酶ii(pol ii)合成和加工mrna的主要步驟。cdk9存在于所有的哺乳動物細胞內。體內cdk9的激活取決于其與對應的細胞周期蛋白(cyclin t/k)的結合，形成異源二聚體，即正性轉錄延長因子b(p-tefb)。當負性轉錄延長因子(nelfs)參與細胞轉錄的負性調節時，轉錄被抑制，p-tefb被招募到負性轉錄延長因子抑制轉錄延長的體系中，催化rna聚合酶ii的碳末端結構域(ctd)磷酸化，同時催化nelfs的spt5亞基和nelf的rd亞基磷酸化，致使負性轉錄延長因子從轉錄復合物上脫離，從而使轉錄得以繼續。
6.腫瘤通常是由于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(cdki)表達缺失或者細胞周期蛋白的過量表達使細胞不受調控而過度增殖所導致的。鑒于上述調控機制，使用cdk9抑制劑，將能夠阻止p-tefb對rna聚合酶ii的碳末端結構域磷酸化，進一步阻礙nefl的離去，加強負抑制作用，引起轉錄停止，使得細胞內mrna及半衰期短的蛋白的水平快速下降，從而可以引起腫瘤細胞的凋亡。cdk9已成為開發有效癌癥的潛在蛋白靶標，近來已有制藥公司對cdk9抑制劑用于癌癥的開展了研究，例如，阿斯利康的azd4573和拜爾公司的bay-1251152，均處于臨床i期試驗階段。
7.盡管目前已公開了一些cdk9抑制劑小分子(例如，wo2009047359、wo2014076091等)，但尚未有藥物獲批上市，仍有必要開發兼具良好藥效、良好安全性、及良好成藥潛力的新化合物，使臨床上更多患者受益。
技術實現要素：
8.一方面，本技術提供了固體形式的式(a)所示化合物，
[0009][0010]
另一方面，本技術提供了結晶形式的式(a)所示化合物。
[0011]
本技術的一些方案中，上述結晶形式，其特征在于，所述結晶形式為無溶劑且無水結晶形式或水合物結晶形式，優選為無溶劑且無水結晶形式。
[0012]
另一方面，本技術提供了式(a)所示化合物的晶型i，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：13.3
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
。
[0013]
本技術的一些方案中，上述晶型i，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：13.3
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
，23.0
±
0.2
°
。
[0014]
本技術的一些方案中，上述晶型i，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：13.3
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
，21.5
±
0.2
°
，23.0
±
0.2
°
。
[0015]
本技術的一些方案中，上述晶型i，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：13.3
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
，23.0
±
0.2
°
，26.1
±
0.2
°
。
[0016]
本技術的一些方案中，上述晶型i，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：13.3
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
，20.7
±
0.2
°
，21.5
±
0.2
°
，23.0
±
0.2
°
，26.1
±
0.2
°
。
[0017]
本技術的一些方案中，上述晶型i，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：13.3
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
，20.7
±
0.2
°
，21.5
±
0.2
°
，23.0
±
0.2
°
，26.1
±
0.2
°
，26.6
±
0.2
°
。
[0018]
本技術的一些方案中，上述晶型i，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：9.3
±
0.2
°
，13.3
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
，20.7
±
0.2
°
，21.5
±
0.2
°
，23.0
±
0.2
°
，26.1
±
0.2
°
，26.6
±
0.2
°
。
[0019]
本技術的一些方案中，上述晶型i，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：9.3
±
0.2
°
，12.4
±
0.2
°
，13.3
±
0.2
°
，18.6
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
，20.7
±
0.2
°
，21.5
±
0.2
°
，23.0
±
0.2
°
，26.1
±
0.2
°
，26.6
±
0.2
°
。
[0020]
本技術的一些方案中，上述晶型i，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：9.3
±
0.2
°
，12.4
±
0.2
°
，13.3
±
0.2
°
，18.6
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
，20.4
±
0.2
°
，20.7
±
0.2
°
，21.5
±
0.2
°
，22.0
±
0.2
°
，23.0
±
0.2
°
，26.1
±
0.2
°
，26.6
±
0.2
°
。
[0021]
本技術的一些方案中，上述晶型i，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：9.3
±
0.2
°
，12.4
±
0.2
°
，13.1
±
0.2
°
，13.3
±
0.2
°
，15.4
±
0.2
°
，18.6
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，19.5
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
，20.4
±
0.2
°
，20.7
±
0.2
°
，21.5
±
0.2
°
，22.0
±
0.2
°
，23.0
±
0.2
°
，26.1
±
0.2
°
，26.6
±
0.2
°
。
[0022]
本技術的一些方案中，上述晶型i，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在以下2θ角處具有特征衍射峰(
±
0.2
°
)：
[0023]
峰位置(2θ)
°
相對強度％峰位置(2θ)
°
相對強度％峰位置(2θ)
°
相對強度％9.316.219.410022.027.612.414.519.569.723.061.013.139.720.171.326.161.213.367.320.448.126.639.715.416.820.746.2
??
18.625.621.543.2
??
[0024]
本技術的一些方案中，上述晶型i，使用cu-kα輻射，其具有基本上如圖1所示的x-射線粉末衍射圖譜。
[0025]
本技術的一些方案中，上述晶型i，其差示掃描量熱曲線在204.33
±
5℃處有吸熱峰。
[0026]
本技術的一些方案中，上述晶型i，其具有基本上如圖2所示的dsc圖譜。
[0027]
本技術的一些方案中，上述晶型i，其熱重分析曲線在室溫至180℃
±
5℃之間有0.565％
±
0.2％的失重。
[0028]
本技術的一些方案中，上述晶型i，其具有基本上如圖2所示的tga圖譜。
[0029]
另一方面，本技術提供了式(a)所示化合物的晶型v，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：11.3
±
0.2
°
，18.3
±
0.2
°
，22.8
±
0.2
°
。
[0030]
本技術的一些方案中，上述晶型v，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：11.3
±
0.2
°
，16.2
±
0.2
°
，18.3
±
0.2
°
，21.0
±
0.2
°
，22.8
±
0.2
°
。
[0031]
本技術的一些方案中，上述晶型v，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：11.3
±
0.2
°
，16.2
±
0.2
°
，18.3
±
0.2
°
，21.0
±
0.2
°
，22.8
±
0.2
°
，23.5
±
0.2
°
。
[0032]
本技術的一些方案中，上述晶型v，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：9.4
±
0.2
°
，11.3
±
0.2
°
，16.2
±
0.2
°
，18.3
±
0.2
°
，19.7
±
0.2
°
，21.0
±
0.2
°
，22.8
±
0.2
°
，23.5
±
0.2
°
。
[0033]
本技術的一些方案中，上述晶型v，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：6.5
±
0.2
°
，9.4
±
0.2
°
，11.3
±
0.2
°
，16.2
±
0.2
°
，16.7
±
0.2
°
，18.3
±
0.2
°
，19.7
±
0.2
°
，21.0
±
0.2
°
，22.8
±
0.2
°
，23.5
±
0.2
°
。
[0034]
本技術的一些方案中，上述晶型v，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在以下2θ角處具有特征衍射峰：6.5
±
0.2
°
，9.4
±
0.2
°
，11.3
±
0.2
°
，16.2
±
0.2
°
，16.7
±
0.2
°
，17.0
±
0.2
°
，18.3
±
0.2
°
，19.7
±
0.2
°
，20.7
±
0.2
°
，21.0
±
0.2
°
，22.8
±
0.2
°
，23.5
±
0.2
°
。
[0035]
本技術的一些方案中，上述晶型v，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在以下2θ角處具有特征衍射峰：6.5
±
0.2
°
，9.4
±
0.2
°
，11.3
±
0.2
°
，13.1
±
0.2
°
，16.2
±
0.2
°
，16.7
±
0.2
°
，17.0
±
0.2
°
，18.3
±
0.2
°
，19.7
±
0.2
°
，20.7
±
0.2
°
，21.0
±
0.2
°
，22.8
±
0.2
°
，23.5
±
0.2
°
，24.4
±
0.2
°
。
[0036]
本技術的一些方案中，上述晶型v，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在以下2θ角處具有特征衍射峰(
±
0.2
°
)：
[0037]
峰位置(2θ)
°
相對強度％峰位置(2θ)
°
相對強度％峰位置(2θ)
°
相對強度％6.57.916.717.821.034.3
9.414.617.011.322.8100.011.383.518.330.323.544.113.15.219.79.424.45.616.232.220.78.0
??
[0038]
本技術的一些方案中，上述晶型v，使用cu-kα輻射，其具有基本上如圖3所示的x-射線粉末衍射圖譜。
[0039]
本技術的一些方案中，上述晶型v，其差示掃描量熱曲線在185.87
±
5℃處有吸熱峰。
[0040]
本技術的一些方案中，上述晶型v，其具有基本上如圖4所示的dsc圖譜。
[0041]
本技術的一些方案中，上述晶型v，其熱重分析曲線在室溫至170
±
5℃之間有0.926％
±
0.2％的失重。
[0042]
本技術的一些方案中，上述晶型v，其具有基本上如圖4所示的tga圖譜。
[0043]
另一方面，本技術提供了式(a)所示化合物的晶型xiii，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：15.8
±
0.2
°
，19.1
±
0.2
°
，20.8
±
0.2
°
。
[0044]
本技術的一些方案中，上述晶型xiii，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：14.3
±
0.2
°
，15.8
±
0.2
°
，17.8
±
0.2
°
，19.1
±
0.2
°
，20.8
±
0.2
°
。
[0045]
本技術的一些方案中，上述晶型xiii，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：9.5
±
0.2
°
，14.3
±
0.2
°
，15.8
±
0.2
°
，17.8
±
0.2
°
，19.1
±
0.2
°
，20.8
±
0.2
°
，24.4
±
0.2
°
。
[0046]
本技術的一些方案中，上述晶型xiii，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：9.5
±
0.2
°
，14.3
±
0.2
°
，15.8
±
0.2
°
，17.8
±
0.2
°
，18.2
±
0.2
°
，19.1
±
0.2
°
，20.8
±
0.2
°
，24.4
±
0.2
°
，26.3
±
0.2
°
。
[0047]
本技術的一些方案中，上述晶型xiii，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：9.5
±
0.2
°
，14.3
±
0.2
°
，15.8
±
0.2
°
，16.6
±
0.2
°
，17.8
±
0.2
°
，18.2
±
0.2
°
，19.1
±
0.2
°
，20.8
±
0.2
°
，24.4
±
0.2
°
，26.3
±
0.2
°
，26.9
±
0.2
°
。
[0048]
本技術的一些方案中，上述晶型xiii，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在以下2θ角處具有特征衍射峰(
±
0.2
°
)：
[0049][0050][0051]
本技術的一些方案中，上述晶型xiii，使用cu-kα輻射，其具有基本上如圖5所示的x-射線粉末衍射圖譜。
[0052]
本技術的一些方案中，上述晶型xiii，其差示掃描量熱曲線在194.07
±
5℃和
200.51
±
5℃處分別有兩個吸熱峰。
[0053]
本技術的一些方案中，上述晶型xiii，其具有基本上如圖6所示的dsc圖譜。
[0054]
本技術的一些方案中，上述晶型xiii，其熱重分析曲線在室溫至180
±
5℃之間有0.216％
±
0.2％的失重。
[0055]
本技術的一些方案中，上述晶型xiii，其具有基本上如圖6所示的tga圖譜。
[0056]
本技術的另一個目的在于提供一種結晶組合物，其包含式(a)化合物的晶型i、晶型v、晶型xiii或其中的兩種或更多種。
[0057]
本技術的一些方案中，所述晶型i占所述結晶組合物重量的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上。
[0058]
本技術的一些方案中，所述晶型v占所述結晶組合物重量的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上。
[0059]
本技術的一些方案中，所述晶型xiii占所述結晶組合物重量的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上。
[0060]
本技術的另一個目的在于提供一種藥物組合物，其包含固體形式的式(a)所示化合物、結晶形式的式(a)所示化合物或其結晶組合物。
[0061]
本技術的一些方案中，上述藥物組合物，包含式(a)所示化合物的晶型i、晶型v、或晶型xiii。
[0062]
本技術的另一個目的在于提供一種藥物組合物，其包含固體形式的式(a)所示化合物、結晶形式的式(a)所示化合物或其結晶組合物，以及藥學上可接受的載體。
[0063]
本技術的一些方案中，上述藥物組合物，包含式(a)化合物的晶型i、晶型v、或晶型xiii，以及藥學上可接受的載體。
[0064]
另一方面，本技術還提供了上述固體形式的式(a)所示化合物、結晶形式的式(a)所示化合物、式(a)所示化合物的晶型i、晶型v、晶型xiii、上述結晶組合物或上述藥物組合物在制備預防和/或cdk9介導的疾病的藥物中的用途。
[0065]
本技術的一些方案中，上述的用途，其中所述cdk9介導的疾病包括細胞增殖性疾病或炎癥性疾病。
[0066]
另一方面，本技術還提供了上述固體形式的式(a)所示化合物、結晶形式的式(a)所示化合物、式(a)所示化合物的晶型i、晶型v、晶型xiii、上述結晶組合物或上述藥物組合物在制備作為cdk9抑制劑的藥物中的用途。
[0067]
本技術的一些方案中，所述藥物用于cdk9介導的疾病。
[0068]
本技術的一些方案中，所述cdk9介導的疾病包括細胞增殖性疾病或炎癥性疾病。
[0069]
本技術的一些方案中，前述cdk9介導的疾病是指涉及cdk9基因、蛋白、其活性或表達的改變的疾病。
[0070]
本技術的一些方案中，前述細胞增殖性疾病或炎癥性疾病涉及cdk9基因、蛋白、其活性或表達的改變。
[0071]
本技術的一些方案中，前述細胞增殖性疾病為腫瘤；優選地，所述腫瘤為血液腫瘤或實體瘤；優選為復發或難治性的血液腫瘤或實體瘤；優選為惡性血液腫瘤或晚期實體瘤；進一步優選為晚期惡性血液腫瘤或晚期惡性實體瘤；進一步優選為復發或難治性的晚期惡性血液腫瘤或晚期惡性實體瘤。
[0072]
本技術的一些方案中，所述血液腫瘤為白血病、淋巴瘤或骨髓瘤；優選地，所述白血病為急性髓性白血病；優選地，所述淋巴瘤為非霍奇金淋巴瘤；優選為套細胞淋巴瘤或彌漫大b細胞淋巴瘤；優選地，所述骨髓瘤為多發性骨髓瘤。
[0073]
本技術的一些方案中，所述實體瘤選自肝癌、乳腺癌和前列腺癌；優選地，所述乳腺癌為三陰性乳腺癌。
[0074]
另一方面，本技術還提供了上述固體形式的式(a)所示化合物、結晶形式的式(a)所示化合物，在制備晶型i、晶型v、或晶型xiii中的用途。
[0075]
定義和說明
[0076]
除非另有說明，否則本文所用的下列術語和短語旨在含有下列含義。一個特定的短語或術語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。
[0077]
本技術提及的“固體形式的式(a)所示化合物”是指呈固體形態的式(a)所示化合物，包括其結晶形式和無定型形式等。
[0078]
本技術提及的“結晶形式的式(a)所示化合物”是指呈結晶形態的式(a)所示化合物，包括式(a)所示化合物的無水且無溶劑形式、水合物形式、溶劑合物形式和共晶形式；優選包括式(a)所示化合物的無水且無溶劑形式、水合物形式和溶劑合物形式；優選包括式(a)所示化合物的無水且無溶劑形式和水合物形式。
[0079]
術語“溶劑合物”或“溶劑化物”是指由溶質(在本技術中，為式(a)所示化合物)及溶劑形成的具有可變化學計量的復合物。該等用于本技術的目的的溶劑不可干擾溶質的生物活性。合適的溶劑合物包括藥學上可接受的溶劑合物，且還包括化學計量的溶劑合物和非化學計量的溶劑合物兩者。然而，具有非藥學上可接受的溶劑的溶劑合物處于本技術的范圍內，例如，其可作為中間物用于制備式(a)所示化合物或其他晶型。優選地，所用溶劑為水，此時所得的溶劑合物亦可稱為水合物。如本文所用且除非另外指示，否則術語“水合物”是指進一步包括化學計量或非化學計量的由非共價分子間力結合的水的本文提供的化合物。
[0080]
所述“無溶劑且無水結晶形式”是指樣品中不含有以分子間作用力與式(a)所示化合物結合的溶劑分子或水分子。例如，當樣品經熱重分析(tga)測量時，其含有重量比不多于3.0％，例如不多于1.5％，如不多于1％的水或溶劑。
[0081]
術語“結晶組合物”指的是一種固體形式，其包含本技術提及的晶型i、晶型v、晶型xiii或它們中的兩種或更多種。而且，除了本技術提及的晶型以外，結晶組合物還可以任選地包含其它晶型或其它無定型形式的式(a)所示化合物或其鹽，或者除了這些物質以外的雜質。本領域技術人員應當理解，結晶組合物中各成分的含量之和應當為100％。
[0082]
術語“任選”或“任選地”是指隨后描述的事件或情況可以發生或不發生，該描述包括發生所述事件或情況和不發生所述事件或情況。所述“室溫”為本領域常規意義上的室溫溫度，一般為10～30℃，優選25℃
±
5℃。
[0083]
在x-射線粉末衍射圖譜中，術語“基本上”或者“基本上如圖
……
所示”是指基本上純凈的某種晶型，其粉末x-射線衍射圖譜中至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％的峰出現在所給圖譜中。進一步的，當產品中某種晶型的含量逐漸降低時，其x-射線粉末衍射圖譜
中的一些歸屬于該晶型的衍射峰可能會由于儀器的檢測靈敏度的因素而變少。此外，對任何給定的晶型而言，峰的位置可能存在輕微誤差，這在晶體學領域中也是公知的。例如，由于分析樣品時溫度的變化、樣品移動或儀器的標定等，峰的位置可以移動，2θ值的測定誤差有時約為
±
0.2
°
。因此，在確定每種晶型結構時，應該將此誤差考慮在內，術語“基本上”或者“基本上如圖
……
所示”也意圖涵蓋衍射峰位中的這樣的差異性。
[0084]
在dsc圖譜或tga圖譜中，術語“基本上”或者“基本上如圖
……
所示”是指對于同種化合物的同種晶型，在連續的分析中，熱轉變起始溫度、吸熱峰峰值溫度、放熱峰峰值溫度、熔點、失重起點溫度或失重終點溫度等的誤差典型的在約5℃，通常約在3℃之內。當描述某個化合物具有某一給定的熱轉變起始溫度、吸熱峰峰值溫度、放熱峰峰值溫度、熔點、失重起點溫度或失重終點溫度等時，指的是該溫度
±
5℃。
[0085]
在本文中使用的術語“細胞增殖性疾病”是指其中的細胞生長速率低于或高于給定生理狀態和條件下的預期速率的病癥。
[0086]
術語“腫瘤”包含良性腫瘤、惡性腫瘤和交界性腫瘤，其中惡性腫瘤又統稱為癌癥。
[0087]
在本文使用的術語“預防”是指當用于疾病或病癥(例如癌癥)時，與未施用化合物或藥物(例如，本技術要求保護的組合產品)的受試者相比，所述化合物或藥物能降低受試者體內的醫學病癥癥狀的頻率或推遲其發病。
[0088]
在本文中使用的術語“”是指減輕、緩解或改善疾病或病癥的癥狀，改善潛在的代謝引起的癥狀，抑制疾病或癥狀，例如阻止疾病或病癥的發展、緩解疾病或病癥、引起疾病或病癥的消退、緩解疾病或病癥引起的病況、或阻止疾病或病癥的癥狀。
[0089]
本技術的藥物組合物可以采用本領域的常規方法制備得到。
[0090]
在本技術的上下文中，術語“藥學上可接受的載體”或“賦形劑”或“藥學上可接受的輔料”或“藥用可接受的輔料”是指對有機體無明顯刺激作用，而且不會損害該活性化合物的生物活性及性能的那些輔料。術語“藥用可接受的輔料”包括：溶劑、拋射劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、著劑、黏合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑、潤濕劑、滲透壓調節劑、穩定劑、助流劑、矯味劑、防腐劑、助懸劑、包衣材料、芳香劑、抗黏著劑、抗氧劑、螯合劑、滲透促進劑、ph值調節劑、緩沖劑、增塑劑、表面活性劑、發泡劑、消泡劑、增稠劑、包合劑、保濕劑、吸收劑、稀釋劑、絮凝劑與反絮凝劑、助濾劑、釋放阻滯劑等。本領域技術人員可根據實際需要選擇具體的藥用可接受的輔料。有關輔料的知識是本領域技術人員眾所周知的，例如可以參考《藥劑學》(崔福德主編，第5版，人民衛生出版社，2003)。
[0091]
詞語“包括(comprise)”或“包含(comprise)”及其英文變體例如comprises或comprising應理解為開放的、非排他性的意義，即“包括但不限于”。
[0092]
在本技術的范圍中，任一特征的各種選項可以與其它特征的各種選項相互組合，從而構成許多不同的實施方案。本技術意欲包括由所有技術特征的各種選項所組成的所有可能的實施方案，只要這樣的新的技術方案是在技術上可行的即可。
[0093]
技術效果
[0094]
本技術提供的式(a)所示化合物的固體形式、式(a)所示化合物的結晶形式及具體晶型，它們具有以下一種或多種的有益效果：
[0095]
本技術提及的式(a)所示化合物的結晶形式及具體晶型具有良好的結晶度，易于純化、過濾和分離；
[0096]
易于成藥，具有良好的穩定性(例如，固體穩定性、溶液穩定性)，特別是晶型i、晶型v和晶型xiii；
[0097]
無明顯引濕性，具有良好的藥用前景；
[0098]
體外激酶活性試驗和細胞試驗結果顯示：本技術化合物(a)對cdk9具有良好的體外激酶抑制活性，對其它cdk亞型具有良好的選擇性，對多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用；
[0099]
體外herg抑制活性試驗表明，式(a)所示化合物具有較低的心臟毒性風險；
[0100]
體內抗腫瘤試驗及安全性試驗結果表明，與對照化合物相比，式(a)所示化合物具有更好的體內抗腫瘤效果，毒性更小，成藥可能性更高，為抑制cdk9靶點藥物提供了更好的選擇。
附圖說明
[0101]
圖1：實施例1的晶型i的x-射線粉末衍射圖譜。
[0102]
圖2：實施例1的晶型i的dsc-tga圖譜。
[0103]
圖3：實施例2的晶型v的x-射線粉末衍射圖譜。
[0104]
圖4：實施例2的晶型v的dsc-tga圖譜。
[0105]
圖5：實施例3的晶型xiii的x-射線粉末衍射圖譜。
[0106]
圖6：實施例3的晶型xiii的dsc-tga圖譜。
具體實施方式
[0107]
1、x-射線粉末衍射(x-ray powder diffractometer，xrpd)
[0108]
儀器型號：bruker d8 advance x射線粉末衍射儀(bruker，ger)
[0109]
測試方法：大約2～10mg樣品用于xrpd檢測
[0110]
詳細的xrpd參數如下：
[0111]
x射線發生器：cu-kα
[0112]
光管電壓：40kv，光管電流：40ma
[0113]
掃描范圍：3
°?
45
°
(2θ)
[0114]
掃描步長：0.02
°
[0115]
曝光時間：0.12秒
[0116]
樣品盤：零背景樣品盤
[0117]
采集軟件：diffrac.measurement center(bruker，ger)
[0118]
分析軟件：diffrac.eva(bruker，ger)。
[0119]
2、差示掃描量熱分析(differential scanning calorimeter，dsc)
[0120]
儀器型號：ta discovery 2500差示掃描量熱儀(ta，us)
[0121]
測試方法：取樣品置于dsc樣品盤中，樣品盤加蓋并扎孔，將樣品在25℃平衡后以10℃/min的升溫速率加熱至最終溫度。
[0122]
樣品量：1～2mg
[0123]
氣流種類：氮氣
[0124]
流速：50ml/min
[0125]
加熱起始溫度：25℃
[0126]
終止溫度：250℃。
[0127]
3、熱重分析(thermal gravimetric analyzer，tga)
[0128]
儀器型號：ta discovery 55熱重分析儀(ta，us)
[0129]
測試方法：將樣品置于已平衡的開口鋁制樣品盤中，樣品質量在tga加熱爐內自動稱量后，將樣品以10℃/min的速率加熱至最終溫度。
[0130]
樣品量：2～5mg
[0131]
氣流種類：氮氣
[0132]
流速：60ml/min
[0133]
加熱起始溫度：室溫
[0134]
終止溫度：300℃。
[0135]
4、動態水分吸脫附分析(dvs)
[0136]
儀器型號：dvs intrinsic動態水蒸氣吸附儀(sms，uk)
[0137]
測試方法：將足量的樣品(15mg)加入到儀器中模擬動態水蒸氣吸附，并且記錄25℃時，0％-90％范圍內不同濕度(每個梯度的濕度變化量為10％，濕度變化：50％—95％—0％—50％)平衡時重量的變化。梯度終點采用dm/dt方式進行判斷，以dm/dt小于0.002％并維持10分鐘為梯度終點。
[0138]
對樣品吸濕性大小進行分類：
[0139]
(1)潮解：吸收足量水分形成液體
[0140]
(2)極具吸濕性：吸濕增重不小于15％
[0141]
(3)有吸濕性：吸濕增重小于15％但不小于2％
[0142]
(4)略有吸濕性：吸濕增重小于2％但不小于0.2％
[0143]
(5)無吸濕性：吸濕增重小于0.2％。
[0144]
5、高效液相譜(hplc)
[0145]
儀器型號：waters acquity arc高效液相譜儀(waters，us)
[0146]
譜柱：waters cortecs c18，4.6mm
×
150mm，2.7μm
[0147]
測試條件：波長250nm；柱溫30℃
[0148]
流動相：a：0.1％乙酸水溶液；b：0.05％tfa乙腈溶液
[0149]
進樣體積：5μl。
[0150]
6、核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy，nmrs)
[0151]
儀器型號：bruker avance iii 400(bruker，ger)
[0152]
內容及測試溶劑：1h-nmr，測試溶劑為dmso-d6。
[0153]
7、不同ph溶液的晶型穩定性測試
[0154]
ph緩沖液的配制過程如下表所示。將待測晶型樣品分別加入到2.0ml的ph 2-7不同緩沖液介質中配制成懸濁液，在25℃恒溫震蕩24h后，離心分離懸濁液；取剩余上清液測試其ph值，對剩余固體進行xrpd測試。
[0155][0156]
儀器：tg16.5臺式高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)
[0157]
條件：10000rpm，離心4分鐘。
[0158]
8、水和生物介質中的晶型穩定性測試
[0159]
生物介質的配制過程如下表所示。不同晶型的樣品分別加入到4.0ml的水和生物介質(fassif、fessif、fassgf，fassif/fessif/fassgf粉末廠家biorelevant，粉末貨號fff01，批號fff-1219-a)中配制成懸濁液，在37℃恒溫震蕩24h，對24h時間點的上清液測試ph值，對剩余固體進行xrpd測試。
[0160][0161]
備注：fassif：模擬人類餐前饑餓狀態下小腸內的腸液；fessif：模擬人類餐后飽食狀態下小腸內的腸液；fassgf：模擬人類饑餓狀態下空胃時的胃液。
[0162]
本技術的中間體化合物和/或化合物可以通過本領域技術人員所知曉的多種合成方法來制備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本領域技術人員所知曉的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限于本技術的實施例。當本文出現商品名時，旨在指代其對應的商品或其活性成分。
[0163]
本技術具體實施方式的化學反應是在合適的溶劑中完成的，所述的溶劑須適合于本技術的化學變化及其所需的試劑和物料。為了獲得本技術的化合物，有時需要本領域技術人員在已有實施方式的基礎上對合成步驟或者反應流程進行修改或選擇。
[0164]
本技術所使用的所有溶劑是市售的，無需進一步純化即可使用。
[0165]
為了更好的理解本技術的內容，下面結合具體實施例來做進一步的說明，但具體的實施方式并不是對本技術的內容所做的限制。下列制備例、實施例、對比例、測試例或試驗例中未注明具體條件的試驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0166]
制備例1：式(a)化合物的制備
[0167][0168]
中間體1a的合成：
[0169]
將5-氟-4-碘吡啶-2-胺(1.00g，4.20mmol)溶解于乙二醇二甲醚(20ml)和水(4ml)中，接著加入4-氟-2-甲氧基苯硼酸(0.71g,4.20mmol)、[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(0.31g，0.42mmol)和碳酸鉀(1.70g，12.60mmol)，用氮氣置換三次，使整個體系處于氮氣的氛圍下。體系在100℃下回流攪拌，反應4小時，tlc監測原料無剩余。減壓濃縮，經柱層析分離純化(二氯甲烷:甲醇＝50:1-10:1，v/v)，得到1a(0.80g，產率81％)。
[0170]
中間體1b的合成：
[0171]
將1a(0.80g，3.40mmol)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(30ml)中，接著加入(1s,3r)-3-[(叔丁氧羰基)氨基]環己烷甲酸(0.83g，3.40mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.56g，4.10mmol)和n,n-二異丙基乙胺(0.88g，6.80mmol)。整個體系在室溫下攪拌過夜，tlc監測原料無剩余。向反應液中加入水(100ml)，乙酸乙酯萃取(50ml
×
3)，合并有機相，飽和氯化鈉洗滌(50ml
×
2)，無水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑，經柱層析分離純化(二氯甲烷:甲醇＝50:1-20:1，v/v)，得到1b(0.90g，產率58％)。
[0172]
中間體1c的合成：
[0173]
將1b(0.90g，1.95mmol)溶解于二氯甲烷(30ml)中，接著冰水浴下加入三氟乙酸(2ml)。整個體系在室溫下攪拌過夜，tlc檢測直至原料無剩余。向反應液中加入水(100ml)，再用飽和碳酸氫鈉水溶液調節ph＝9-10，用二氯甲烷萃取(50ml
×
3)，合并有機相，飽和氯化鈉洗滌(50ml
×
2)，無水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑，經柱層析分離純化(二氯甲烷:甲醇＝50:1-8:1，v/v)后，得到1c(0.61g，產率87％)。
[0174]
終產物a的合成：
[0175]
將1c(50mg，0.138mmol)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(5ml)中，接著加入羥乙酸(16mg，0.21mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽(80mg，0.21mmol)和n，n-二異丙基乙胺(69μl，0.42mmol)。整個體系在室溫下攪拌，反應10小時，tlc監測直至原料無剩余。向反應液中加入水(50ml)，乙酸乙酯萃取(50ml
×
3)。合并有機相，飽和氯化鈉洗滌(50ml
×
2)，無水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑，柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇＝40:1-20:1，v/v)，得到終產物a(30mg，產率52％)。ms m/z(esi):420.2[m+h]
+
。
[0176]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ10.56(s,1h),8.31(s,1h),8.06(d,j＝5.4hz,1h),7.56(d,j＝9.0hz,1h),7.34-7.31(m,1h),7.09-7.07(m,1h),6.91-6.88(m,1h),5.38-5.36(m,1h),3.77-3.75(m,5h),3.66-3.63(m,1h),2.61-2.57(m,1h),1.83-1.68(m,4h),1.34-1.26(m,4h).實施例1：式(a)化合物晶型i的制備
[0177]
室溫下，稱取約200mg制備例1樣品加入到適宜容積的玻璃瓶中，加入乙酸乙酯(5ml)，室溫攪拌3天，離心分離得固體，所得固體50℃真空干燥。取樣品進行x-射線粉末衍射，顯示為結晶狀固體(晶型i，無水晶型)，且結晶度良好，譜圖見圖1，其xrpd衍射峰數據見表1。取樣品進行dsc-tga測試，dsc圖顯示在204.33℃處有一個吸熱峰，tga圖顯示樣品在室溫至180℃之間有0.565％的失重，見圖2。
[0178]
表1：實施例1晶型i的xrpd衍射峰數據表
[0179][0180][0181]
注：選擇相對峰強度》8.0％的峰列于表中。
[0182]
實施例2：式(a)化合物晶型v的制備
[0183]
室溫，于適宜容器中，稱取約200mg制備例1樣品溶于二氧六環(4ml)中，攪拌至溶清，將溶清后的溶液加入到水(40ml)中，繼續攪拌1h，離心分離得固體，50℃真空干燥。取樣品進行x-射線粉末衍射，顯示為結晶狀固體(晶型v，無水晶型)，且結晶度良好，譜圖見圖3，其xrpd衍射峰數據見表2。取樣品進行dsc-tga測試，dsc圖顯示在185.87℃處有一個吸熱峰，tga圖顯示樣品在室溫至170℃之間有0.926％的失重，見圖4。
[0184]
表2：實施例2晶型v的xrpd衍射峰數據表
[0185]
峰位置(2θ)
°
相對強度％峰位置(2θ)
°
相對強度％峰位置(2θ)
°
相對強度％6.5127.917.01511.321.02434.39.37114.618.27030.322.823100.011.33783.518.6157.223.54144.113.1155.218.9205.124.4365.616.23532.219.7409.429.4557.416.71117.820.6578.0
??
[0186]
注：選擇相對峰強度》5.0％的峰列于表中。
[0187]
實施例3：式(a)化合物晶型xiii的制備
[0188]
室溫，于適宜容器中，稱取約80mg制備例1樣品溶于二甲基甲酰胺(0.2ml)中，攪拌至溶清，將溶清后的溶液加入到甲苯(3ml)中，繼續攪拌至析出固體，離心分離得固體，室溫真空干燥。
[0189]
稱取少量所得固體樣品平鋪于載玻片上，用熱臺加熱至180℃并恒溫5分鐘，自然
降溫冷卻至室溫得固體。取樣品進行x-射線粉末衍射，顯示為結晶狀固體(晶型xiii，無水晶型)，且結晶度良好，譜圖見圖5，其xrpd衍射峰數據見表3。取樣品進行dsc-tga測試，dsc圖顯示樣品在194.07℃和200.51℃處分別有兩個吸熱峰，tga圖顯示樣品在室溫至180℃之間有0.216％的失重，見圖6。
[0190]
表3：實施例3晶型xiii的xrpd衍射峰數據表
[0191][0192][0193]
注：選擇相對峰強度》5.0％的峰列于表中。
[0194]
對比例1-2
[0195]
稱取一定量的式(a)所示化合物樣品，加入0.4ml二元混合溶劑，在室溫攪拌7天或50℃攪拌1天后，未能得到固體。
[0196]
表4：對比例1-2的實驗條件及結果
[0197][0198]
測試例1：式(a)化合物不同晶型的吸濕性研究
[0199]
取式(a)化合物的晶型i(實施例1)和晶型v(實施例2)置于dvs樣品室內進行測試。取dvs后的樣品進行x-射線粉末衍射。
[0200]
實驗結果：
[0201]
表5：不同晶型的dvs測試結果
[0202]
實施例及初始晶型
△
w(rh＝95％)
△
w(rh＝0％)dvs后晶型實施例1/晶型i+0.13％0％晶型不變實施例2/晶型v+0.06％-0.08％晶型不變
[0203]
數據表明：晶型i和晶型v無引濕性。
[0204]
測試例2：式(a)化合物不同晶型的固體穩定性實驗
[0205]
將適量的式(a)化合物晶型i(實施例1)和晶型v(實施例2)樣品置于稱量瓶中，在高溫(60℃)、高濕(25℃/92.5％rh)、光照(25℃/4500lux)和加速(40℃/75％rh)條件下分別敞口放置7天和15天，取樣品分別進行x-射線粉末衍射，考察式(a)化合物晶型i(實施例1)和晶型v(實施例2)在不同條件下的穩定性。
[0206]
表6：不同晶型的固體穩定性實驗結果
[0207][0208]
數據表明：實施例1的晶型i和實施例2的晶型v在高溫、高濕、光照和加速條件下均能保持晶型穩定，亦能保持化學穩定。
[0209]
測試例3：式(a)化合物不同晶型在不同ph溶液中的穩定性實驗
[0210]
考察式(a)化合物晶型i(實施例1)和晶型v(實施例2)在ph 2-7的緩沖介質中的穩定性。
[0211]
表7：不同晶型在不同ph溶液中的穩定性實驗結果
[0212][0213]
數據表明：實施例1的晶型i和實施例2的晶型v在不同ph的溶液中均能保持晶型穩定。測試例4：式(a)化合物不同晶型在生物溶媒介質中的穩定性實驗
[0214]
考察式(a)化合物晶型i(實施例1)和晶型v(實施例2)在純水及三種生物溶媒介質(fassif、fessif和fassgf)中的晶型穩定性。
[0215]
表8：不同晶型在生物溶媒介質中的穩定性實驗結果
[0216][0217]
數據表明：實施例1的晶型i和實施例2的晶型v在水及不同生物溶媒介質中均能保持晶型穩定。
[0218]
試驗例1：本技術的化合物對cdk9、cdk1、cdk2、cdk4、cdk5、cdk6和cdk7的抑制效果試驗
[0219]
1.實驗目的
[0220]
檢測化合物在cdk1/2/4/5/6/7/9激酶上的抑制效果，并擬出有效的ic
50
值。
[0221]
2.cdks檢測家族
[0222]
cdk1/cdk2/cdk4/cdk5/cdk6/cdk7/cdk9
[0223]
表9：體外測試中激酶、底物和atp的相關信息
[0224][0225][0226]
3.檢測流程
[0227]
3.1化合物稀釋
[0228]
將式(a)化合物用dmso稀釋11個濃度，3倍稀釋，其中參考化合物星形孢菌素(staurosporine)最高濃度為1μm，待測化合物最高濃度為10μm。
[0229]
3.2酶反應
[0230]
利用聲波技術(echo)將溶于dmso中的化合物(50nl)轉移到酶反應板中。取5μl cdk酶稀釋液加入到酶反應板中，離心后室溫孵育10分鐘。取5μl底物預混液加入板中，每孔中底物和atp終濃度見表1。離心后30℃反應120分鐘。
[0231]
3.3終止反應和信號檢測
[0232]
每孔加入10μl終止液，離心后在室溫下孵育120分鐘后，再在4℃下孵育過夜。在envision儀器上使用htrf程序讀取信號值，并進行數據分析，ic
50
(在50％最大效應時的抑制濃度)值以nm表示。結果見表10。
[0233]
表10：式(a)所示化合物對cdk1、2、4、5、6、7和9的抑制效果
[0234]
化合物cdk1cdk2cdk4cdk5cdk6cdk7cdk9化合物a93.21563.61784.82283.522795.364443.596.92
[0235]
以上測試，說明式(a)所示化合物對cdk9抑制具有選擇性和有效抑制作用。
[0236]
試驗例2：式(a)所示化合物對不同腫瘤細胞株增殖的體外抑制作用
[0237]
1.試驗目的
[0238]
考察式(a)所示化合物對多種腫瘤細胞株增殖的體外抑制作用。
[0239]
2.試驗原理
[0240]
mtt商品名噻唑藍，是一種能接受氫原子的染料的四唑鹽。活細胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的mtt還原為難溶的藍紫結晶物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細胞中的藍紫復合物，用酶聯免疫檢測儀在490-550nm波長處測定其光吸收值，可間接反映細胞數量。在一定細胞數范圍內，mtt結晶物形成的量與細胞數成正比。將待測藥物依次稀釋成不同濃度，加入到96孔板中，藥物作用一定時間后，測定其od值，od值的大小能反映活細胞的數量，用spss19.0計算其ic
50
值。
[0241]
3.試驗儀器
[0242]
371型co2培養箱：thermo公司
[0243]
ix70-142型倒置熒光顯微鏡：olympus
[0244]
hfsafe-1500型生物安全柜：上海力申科學儀器有限公司
[0245]
varloskan flash酶標儀：thermo公司
[0246]
精密電子天平：梅特勒al204型
[0247]
td6離心機：長沙湘銳離心機有限公司
[0248]
4.試驗材料：
[0249]
4.1細胞及培養基
[0250]
[0251]
注：培養基廠家：gibco。
[0252]
4.2試驗材料
[0253]
名稱規格生產廠家胎牛血清500ml/瓶cellmopbs2l/袋solarbiodmso500ml/瓶光復mtt5g/瓶amresco0.25％胰蛋白酶(trypsin)-edta500ml/瓶gibcomem neaa100ml/瓶gibco丙酮酸鈉100ml/瓶gibco嘌呤霉素1mlgibco
[0254]
4.3試劑配制
[0255]
5mg/ml mtt工作液：稱取mtt 0.5g溶于100ml pbs中，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，置于4℃冰箱(兩周內使用)或-20℃長期保存。
[0256]
5.試驗方法
[0257]
5.1鋪板
[0258]
懸浮細胞：離心重懸后計數。用完全培養基配成一定密度的細胞懸液后，吹打均勻接種于96孔板，每孔100μl，之后于co2培養箱中培養，貼壁24h后用于檢測。
[0259]
5.2藥物配制
[0260]
稱取適量式(a)所示化合物加入計算量dmso溶解，分裝，-20℃保存；配制濃度10mm。
[0261]
5.3加藥
[0262]
將式(a)所示化合物的10mm濃度儲備液稀釋成不同濃度(8個濃度)化合物的dmso溶液(3倍稀釋，20
×
終濃度)，分別取各濃度化合物的dmso溶液(10μl)，使用細胞培養基(90μl)進行稀釋，配成工作液(2
×
終濃度)，取各濃度化合物的工作液(100μl)加于接種有細胞的96孔板中(1
×
終濃度，最高終濃度為1000nm)，每個藥物濃度設3個復孔，并設相應的空白孔(只有培養基)及正常孔(藥物濃度為0)，于co2培養箱中繼續培養。
[0263]
6.檢測
[0264]
取出96孔板，顯微鏡觀察細胞長滿程度。采用mtt方法檢測。
[0265]
mtt法：每孔加入mtt 20μl，于培養箱中培養約4h后，棄去孔內液體，每孔加入150μl dmso，置于震蕩儀中震蕩5-10min，用酶標儀在波長550nm處檢測。
[0266]
采用下列公式計算細胞生長的抑制率：抑制率(％)＝(正常孔od值－給藥孔od值)/(正常孔od值－空白孔od值)
×
100％
[0267]
7.數據分析
[0268]
用spss19.0統計軟件，計算藥物的ic
50
值。
[0269]
式(a)所示化合物細胞增殖抑制結果見表11。
[0270]
表11：式(a)所示化合物的細胞增殖抑制試驗數據
[0271]
細胞種類ic
50
(nm)mv 4-1134
hep3b-luc71smmc7721-luc119plc/prf/5292du14585.5mda-mb-23164.4rpmi-882696.8mm.1s22.3su-dhl-411.2jeko-121.6
[0272]
實驗結論：據表中數據，式(a)所示化合物對各種腫瘤細胞株均具有較強的抑制作用。
[0273]
試驗例3：體外herg抑制活性考察
[0274]
1.試驗目的：
[0275]
快速激活的人延遲整流外向鉀電流(ikr)主要由herg離子通道介導，參與人類心肌細胞復極化。藥物阻斷這一電流是導致臨床上出現qt間期延長綜合征，甚至急性心律紊亂乃至猝死的主要原因。利用全細胞膜片鉗技術，在穩定表達herg通道的cho-k1細胞株上檢測式(a)所示化合物對herg通道的阻斷作用并且測定該化合物的半數抑制濃度ic
50
，以其作為綜合性心臟安全性評估的一部分，對其在心臟毒性的安全性體外篩選中進行初步的評價。
[0276]
2.試驗方法：
[0277]
此試驗包括以下幾個方面：
[0278]
利用手動膜片鉗技術在穩定表達herg通道的cho-k1細胞株上記錄herg電流；
[0279]
根據herg尾電流計算每個濃度的抑制率；
[0280]
每個化合物測試5個濃度，推算ic
50
值；
[0281]
每個濃度測試3個細胞；
[0282]
一個陽性對照藥物。
[0283]
采用全細胞膜片鉗技術記錄herg電流。取細胞懸液加于細胞槽中，置于正置顯微鏡載物臺上。待細胞貼壁后，用細胞外液灌流，流速為1
–
2ml/min。玻璃微電極由微電極拉制儀兩步拉制，其入水電阻值為2-5mω。建立全細胞記錄后，保持鉗制電位為-80mv。給予電壓刺激時去極化至+60mv，然后復極化至-50mv引出herg尾電流。所有記錄均在電流穩定后進行。胞外灌流給藥從低濃度開始，每個濃度5-10min至電流穩定，再給下一個濃度。測試化合物的半數抑制濃度(ic
50
)由logistic方程最佳擬合得出。
[0284]
阿米替林(amitriptyline)是使用最為廣泛的阻斷herg電流工具藥物之一，故在本次研究中作為陽性對照藥物。
[0285]
3.結果見表12：
[0286]
表12：在cho-k1穩定細胞株上所記錄到的式(a)所示化合物對herg電流的ic
50
數值
[0287][0288]
在上述試驗中，陽性對照藥物阿米替林對herg電流抑制的ic
50
結果與試驗方的歷史結果相一致，同時也與文獻報道的結果相符合，表明本試驗的結果可信。上述試驗結果表明，所測式(a)所示化合物在最高測試濃度也無法達到對herg電流的半數抑制，因此無法測出ic
50
，說明在本試驗的檢測濃度范圍內式(a)所示化合物對herg通道沒有明顯的抑制作用，可一定程度反映式(a)所示化合物具有較低或無心臟毒性，對藥物安全性評估具有積極意義。
[0289]
試驗例4：藥物體內抑瘤活性考察-式(a)所示化合物在人急性髓細胞性白血病mv 4-11細胞皮下異種移植腫瘤模型中的體內藥效學
[0290]
細胞培養：含10％胎牛血清(fbs)的imdm培養基，37℃，5％co2。
[0291]
nodscid鼠，雌性，6-8周，體重約18-22克，每只小鼠在右后背皮下接種0.1ml(1
×
108個)mv 4-11細胞。當腫瘤體積平均值達到150立方毫米時，開始給藥，給藥劑量及方式見下表所示。腫瘤體積每周測量2次，體積以立方毫米計量，當溶劑組平均腫瘤體積生長至800立方毫米以上時，結束給藥，比較受試化合物組與溶劑組之間平均腫瘤體積的差異。化合物的抑瘤療效用tgi(％)評價。tgi(％)，反映腫瘤生長抑制率。
[0292]
溶劑：dmso：hp-β-cd(0.5g/ml)：水比例為2％：20％：78％(v/v/v)。
[0293]
tgi(％)的計算：tgi(％)＝[1-(某處理組給藥結束時平均腫瘤體積-該處理組開始時平均腫瘤體積)/(溶劑對照組給藥結束時平均腫瘤體積-溶劑對照組開始時平均腫瘤體積)]
×
100％。
[0294]
結果見表13。
[0295]
表13：體內抑瘤試驗數據
[0296]
組別動物只數給藥方式給藥劑量給藥天數tgi(％)溶劑組5qd,p.o.
??
16
??
化合物a5qd,p.o.5mg/kg1662.9
[0297]
試驗結論：
[0298]
式(a)所示化合物在人急性髓細胞性白血病mv 4-11細胞皮下異種移植腫瘤模型中展示出良好的體內藥效，具有顯著的抑瘤作用。
[0299]
試驗例5：藥物體內抑瘤活性考察-式(a)所示化合物在人早幼粒急性白血病hl-60細胞皮下異種移植腫瘤模型中的體內藥效。
[0300]
細胞培養：含20％胎牛血清(fbs)的imdm培養基，37℃，5％co2；
[0301]
nu/nu小鼠，雌性，6-8周，體重約18-22克，每只小鼠在右前肢腋部皮下接種hl-60細胞懸液0.1ml(約含細胞1
×
107個)。當腫瘤體積平均值達到150立方毫米時，開始給藥，給藥劑量及給藥方式見下表所示。腫瘤體積每周測量2-3次，體積以立方毫米計量，當溶劑組平均腫瘤體積生長至800立方毫米以上時，結束給藥，比較受試化合物組與溶劑組之間平均腫瘤體積的差異。化合物的抑瘤療效用tgi(％)評價。tgi(％)，反映腫瘤生長抑制率。
[0302]
溶劑：dmso：hp-β-cd(0.5g/ml)：水比例為2％：20％：78％(v/v/v)。
[0303]
tgi(％)的計算：tgi(％)＝[1-(某處理組給藥結束時平均腫瘤體積-該處理組開始時平均腫瘤體積)/(溶劑對照組給藥結束時平均腫瘤體積-溶劑對照組開始時平均腫瘤體積)]
×
100％。
[0304]
結果見表14。
[0305]
表14：體內抑瘤試驗數據
[0306]
組別動物只數給藥方式給藥劑量給藥天數tgi(％)溶劑組5qd,p.o.
??9??
化合物a5qd,p.o.5mg/kg958.0
[0307]
試驗結論：
[0308]
式(a)所示化合物在人早幼粒急性白血病hl-60細胞皮下異種移植腫瘤模型中展示出良好的體內藥效。開始給藥9天后，式(a)所示化合物具有顯著的抑瘤作用。
[0309]
試驗例6：藥物對小鼠的毒性考察
[0310]
試驗用動物：icr小鼠(5周)，雌雄各半
[0311]
溶劑：溶劑：dmso：hp-β-cd(0.5g/ml)：水比例為2％：20％：78％(v/v/v)。
[0312]
試驗方法：將icr小鼠按照體重均衡分組，共7組，每組雌雄各5只。給藥方式為灌胃，每天一次，連續給藥7天，給藥劑量及結果見下表。
[0313]
試驗結果：
[0314][0315]
試驗結論：隨著劑量遞增，對照藥物bay1251152呈現出劑量依賴的毒性，動物死亡數量增多；本技術的化合物a在與對照藥物同等劑量下，均未出現試驗動物死亡事件，可見，本技術的化合物a在雌性和雄性動物中的耐受性明顯優于對照藥物bay1251152。
[0316]
盡管已出于清楚理解的目的通過說明及實例相當詳細地描述前述申請，但根據本技術的教導，顯而易見的是一般本領域技術人員可在不背離隨附權利要求的精神或范圍的情況下對其進行某些變化及修改。
技術特征：
1.固體形式的式(a)所示化合物，2.結晶形式的式(a)所示化合物。3.根據權利要求2所述的結晶形式的式(a)所示化合物，其特征在于，所述結晶形式為無溶劑且無水結晶形式或水合物結晶形式，優選為無溶劑且無水結晶形式。4.式(a)所示化合物的晶型i，其特征在于，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：13.3
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
；或者，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：13.3
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
，23.0
±
0.2
°
；或者，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：13.3
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
，21.5
±
0.2
°
，23.0
±
0.2
°
；或者，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：13.3
±
0.2
°
，19.4
±
0.2
°
，20.1
±
0.2
°
，23.0
±
0.2
°
，26.1
±
0.2
°
；或者，其具有基本上如圖1所示的x-射線粉末衍射圖譜。5.根據權利要求4所述的晶型i，其差示掃描量熱曲線在204.33
±
5℃處有吸熱峰；或者，其具有基本上如圖2所示的dsc圖譜。6.根據權利要求4所述的晶型i，其熱重分析曲線在室溫至180℃
±
5℃之間有0.565％
±
0.2％的失重；或者，其具有基本上如圖2所示的tga圖譜。7.式(a)所示化合物的晶型v，其特征在于，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：11.3
±
0.2
°
，18.3
±
0.2
°
，22.8
±
0.2
°
；或者，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：11.3
±
0.2
°
，16.2
±
0.2
°
，18.3
±
0.2
°
，21.0
±
0.2
°
，22.8
±
0.2
°
；或者，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：11.3
±
0.2
°
，16.2
±
0.2
°
，18.3
±
0.2
°
，21.0
±
0.2
°
，22.8
±
0.2
°
，23.5
±
0.2
°
；或者，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：9.4
±
0.2
°
，11.3
±
0.2
°
，16.2
±
0.2
°
，18.3
±
0.2
°
，19.7
±
0.2
°
，21.0
±
0.2
°
，22.8
±
0.2
°
，23.5
±
0.2
°
；或者，其具有基本上如圖3所示的x-射線粉末衍射圖譜。8.根據權利要求7所述的晶型v，其特征在于，其差示掃描量熱曲線在185.87
±
5℃處有吸熱峰；或者，其具有基本上如圖4所示的dsc圖譜。9.根據權利要求7所述的晶型v，其特征在于，其熱重分析曲線在室溫至170
±
5℃之間有0.926％
±
0.2％的失重；或者，其具有基本上如圖8所示的tga圖譜。
10.式(a)所示化合物的晶型xiii，其特征在于，使用cu-kα輻射，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：15.8
±
0.2
°
，19.1
±
0.2
°
，20.8
±
0.2
°
；或者，其x-射線粉末衍射圖譜在下列2θ角處具有特征衍射峰：14.3
±
0.2
°
，15.8
±
0.2
°
，17.8
±
0.2
°
，19.1
±
0.2
°
，20.8
±
0.2
°
；或者，其具有基本上如圖5示的x-射線粉末衍射圖譜。11.一種結晶組合物，其包含權利要求4-6中任一項所述的晶型i、權利要求7-9中任一項所述的晶型v、權利要求10所述的晶型xiii或其中的兩種或更多種。12.一種藥物組合物，其包含權利要求1所述的固體形式的式(a)化合物、或權利要求2或3所述的結晶形式的式(a)化合物、或如權利要求11所述的結晶組合物。13.根據權利要求1所述的固體形式的式(a)所示化合物、權利要求2或3所述的結晶形式的式(a)所示化合物、權利要求4～10任一項所述式(a)所示化合物的晶型、權利要求11所述的結晶組合物、或權利要求12所述的藥物組合物在制備用于cdk9介導的疾病的藥物中的用途；優選地，所述cdk9介導的疾病包括細胞增殖性疾病或炎癥性疾病。
技術總結
本申請提供了一種固體形式的，特別是結晶形式的式(A)所示化合物、具體晶型及其用途。式(A)所示化合物具有優良的周期蛋白依賴性激酶9體外抑制活性、優良的腫瘤細胞體外抑制活性、優良的體內抗腫瘤活性及更好的安全性，且本申請所得的式(A)所示化合物的結晶形式具有結晶度好、引濕性低、穩定性好的特點，具有良好的成藥潛力。藥潛力。藥潛力。
