一種與玉米穗上葉片數緊密連鎖的InDel引物組及其應用
一種與玉米穗上葉片數緊密連鎖的indel引物組及其應用
技術領域
1.本發明屬于分子標記輔助玉米育種技術領域，具體涉及到一種與玉米穗上葉片數緊密連鎖的indel引物組及其應用。
背景技術：
2.葉片是玉米主要的光合器官，葉片數目、形態及空間分布對玉米株型及產量具有重要影響。根據葉片與最上部雌穗著生位置的相對關系，可將玉米葉片分為穗上葉片和穗下葉片。穗上葉片的光合產物是籽粒灌漿所需物質的主要來源，當去除穗上葉片后籽粒干物質積累減少84％-94％。普通玉米的穗上葉片只有5-6張，而多葉型玉米穗上葉可達7-25張，但二者的穂下葉片數相差不大。與普通型玉米相比，多葉型玉米的葉面積指數顯著增加，葉片保持良好受光姿態，高效捕獲光能，合成更多的光合產物，在同等種植密度下產量潛力高于相同熟期的普通玉米。適當增加玉米穗上葉片數不僅可有效高光能利用率，增大干物質積累的庫，促進干物質積累；還可以有效降低雌穗高度與葉夾角，優化玉米株型結構，提高抗倒伏能力和耐密性。
3.玉米穗上葉片數是典型的數量性狀，受多位點的共同調控。近年來，國內外多個研究小組利用不同的遺傳體，在不同的環境條件下，檢測到大量玉米穗上葉片數相關位點(du,x.m.,linghu,j.j.,shang,h.j.,reid,l.m.,zhu,x.y.,wang,j.h.,and wang,g.y.(2015).fine mapping of leafy,a dominant mutant conferring extra leaves above the ear in maize.euphytica 206,49-56.li,d.,wang,x.f.,zhang,x.b.,chen,q.y.,xu,g.h.,xu,d.y.,wang,c.l.,liang,y.m.,wu,l.s.,huang,c.,et al.(2016).the genetic architecture of leaf number and its genetic relationship to floweringtime in maize.new phytol 210,256-268.pan,q.c.,xu,y.c.,li,k.,peng,y.,zhan,w.,li,w.q.,li,l.,and yan,j.b.(2017).the genetic basis of plant architecture in 10maize recombinant inbred line populations.plant physiol175,858-873.salvi,s.(2011).genetic dissection of maize phenology using an intraspecific introgression library.bmc plant biology 11,4.yang,n.,lu,y.l.,yang,x.h.,huang,j.,zhou,y.,ali,f.,wen,w.w.,liu,j.,li,j.s.,and yan,j.b.(2014).genome wide association studies using a new nonparametric model reveal the genetic architecture of 17agronomic traits in an enlarged maize association panel.plos genet 10.李賢唐,丁俊強,王瑞霞,吳建宇(2011)，玉米株型相關性狀的tl定位與分析，江蘇農業科學，39,21-25。)。然而，玉米穗上葉片數的研究大多局限于初定位的水平，置信區間較大，內含幾十甚至上百個候選基因，qtl的精細定位和基因克隆工作相對滯后，難以在實際的分子設計育種中應用。
技術實現要素：
4.本部分的目的在于概述本發明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施
例。在本部分以及本技術的說明書摘要和發明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發明的范圍。
5.鑒于上述和/或現有技術中存在的問題，提出了本發明。
6.因此，本發明的目的是，克服現有技術中的不足，提供一種與玉米穗上葉片數緊密連鎖的indel引物組。
7.為解決上述技術問題，本發明提供了如下技術方案：兩組與玉米穗上葉片數相關的indel引物組，其特征在于：所述分子標記位于玉米的三號染體上，命名為hf1和hf6。
8.本發明的再一個目的是，克服現有技術中的不足，提供一種用于檢測玉米穗上葉片數的hf1和hf6標記的引物。
9.本發明的再一個目的是，克服現有技術中的不足，提供一種hf1和hf6分子標記的篩選方法。
10.為解決上述技術問題，本發明提供了如下技術方案：所述篩選方法包括利用自主選育的多葉自交系y915和普通玉米自交系鄭58構建f2和f2:3體；
11.采用玉米55k snp芯片對體基因型進行檢測，結合多年多點的表型鑒定結果開展穗上葉片數的qtl定位；
12.對穩定存在的主效位點，利用定位區間兩端的分子標記篩選交換單株；
13.結合玉米重測序的結果，在初定位區間開發新的分子標記標記，并使用標記對交換單株及其自交后代進行基因型鑒定；
14.整合交換單株及其后代的表型數據和基因型數據，縮小定位區間。從本實驗室自主構建的穗上多葉材料y915的bac文庫中篩選覆蓋整個定位區間的克隆并測序；
15.根據bac測序結果及參考基因組的序列差異，在其插入缺失片段及共有片段的交界處設計組合引物fh1和fh6。
16.本發明的再一個目的是，解決現有技術中的不足，提供一種引物組在檢測玉米穗上葉片數及選育穗上多葉玉米中的應用。
17.作為本發明所述的引物組應用的優選方案，其中：所述利用fh1和fh6引物組配制pcr檢測體系對待測玉米品系dna進行pcr擴增，同時以y915作為對照，然后利用瓊脂糖凝膠電泳對樣品及對照玉米的pcr擴增產物并進行基因分型；含有與y915型等位變異的樣品的穗上葉片數顯著高于其它樣品。
18.本發明有益效果：
19.本發明提供了兩組與穗上葉片緊密連鎖的indel引物組，可在種子及幼苗階段提前通過分子標記檢測后代植株的葉片數，可大大節省育種成本，加快育種進程；兩標記可通過簡單的瓊脂糖凝膠電泳進行基因分型，表型穩定，檢測簡單，不需酶切測序或芯片等操作，對儀器設備的要求較低；本發明的標記與控制穗上葉片數的基因緊密連鎖，對后期的基因克隆和功能驗證具有重要作用。
附圖說明
20.為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它
的附圖。其中：
21.圖1為本發明實施例2中引物組hf1(a)和hf6(b)的示意圖圖。
22.圖2為本發明實施例2中利用標記hf1和hf6檢測玉米品種基因型的瓊脂糖凝膠電泳圖。
23.圖3為本發明實施例3中利用標記hf1和hf6進行分子標記輔助選擇育種的流程圖。
具體實施方式
24.為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合說明書實施例對本發明的具體實施方式做詳細的說明。
25.在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本發明，但是本發明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似推廣，因此本發明不受下面公開的具體實施例的限制。
26.其次，此處所稱的“一個實施例”或“實施例”是指可包含于本發明至少一個實現方式中的特定特征、結構或特性。在本說明書中不同地方出現的“在一個實施例中”并非均指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。
27.以下實施例涉及的穗上多葉的材料y915，普通玉米材料鄭58、g86和w373及其定位體均由揚州大學農學院玉米遺傳育種組保存。
28.實施例1
29.確定玉米穗上葉片數主效qtlqla3-2的定位區間。
30.玉米穗上多葉材料y915和鄭58(我國主要栽培品種鄭單958的母本)雜交構建的包含190份單株f2體。利用中玉金(北京)生物技術有限公司提供的玉米56k芯片平臺，對該體進行基因型檢測。經質量控制，構建了全長1608cm，包含1736個snp標記的高質量遺傳圖譜。將構建的f2：3體在揚州(2016年春播)、淮安(2016年夏播)及海南(2016年冬播)種植，調查表型數據(每一地點種植兩個重復)。在三個環境中，在3號染體3.09bin處定位到穩定的穗上多葉主效位點qln3-2，可解釋38％-59％的表型變異(cui m,jia b,liu h,kan x,zhangy,zhou r,li z,yangl,dengd,yin z(2017).genetic mapping of the leaf number above the primary ear and its relationship with plant height and flowering time in maize.frontiers in plant science,8,1437.)；從鄭58和y915構建的f2和f3體中篩選交換單株，利用其中具有極端穗上葉片數的交換單株(5葉以下和12葉以上)將qln3-2區間縮小至標記indel-o2和y250之間，物理距離約1.53mb；以穗上多葉玉米y915與穗上少葉玉米g86、w373分別雜交構建f2定位體，通過關鍵交換單株定位和后代體驗證，將穗上葉片數主效qtl-qln3-2定位區間縮小到標記y152和l30-2之間，物理距離為66.7kb。
31.實施例2
32.與玉米穗上葉片緊密連鎖的分子標記的開發及多態性標記篩選
33.本發明通過精細定位將qln3-2的候選區間限定y152和l30-2之間，并從穗上多葉玉米自交系y915的bac文庫中，篩選到一個覆蓋整個定位區間的陽性單克隆maize-177。對陽性單克隆進行測序，結果顯示其大小約為142kb。根據maize177序列信息與參考基因組比對結果，在插入(或缺失)片段與共有片段交界處共設計5對組合標記，其中2對在親本及f1
之間存在多態性，分別為fh6和fh1，具體見圖1和2。
34.實施例3
35.利用標記hf1和hf6選育多葉玉米品系
36.為培育具有農藝性狀優良的多葉玉米新品系，本方案利用實施例1中的武香粳y915和高產常規材料鄭58進行連續雜交并進行分子標記輔助選擇(mas)，從中篩選攜帶多葉基因型的優良株系。具體流程見圖3。從雜交f2代開始，利用與穗上葉片緊密連鎖的indel標記hf1和hf6對進行pcr擴增和凝膠電泳檢測，從中選擇具有y915型純合基因型的單株連續自交，獲得300個f6株系。根據f6株系的綜合農藝性狀，從中選擇50個株系，利用分子標記hf1和hf6再次檢測，確認所選株系攜帶y915純合基因型。將選定的f6株系自交后獲種成小區進行綜合性狀鑒定，從中獲得5個性狀穩定的多葉新品系。
37.應說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其
·
均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
技術特征：
1.一種與玉米穗上葉片數緊密連鎖的indel引物組，其特征在于：所述引物組的兩組分子標記位于玉米的三號染體上，命名為hf1和hf6。2.兩組用于檢測如權利要求1所述的hf1和hf6標記的引物，其特征在于，包括hf1的引物對：正向引物5'
–
tgcgaagggatggagagc
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3'，反向引物a 5'
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ccagcagtccagctcttg
–
3',反向引物b 5'
–
tgcgtgctcacgacgtcgact
–
3'hf6的引物對：正向引物a 5'
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cagtctccacctagctgt
–
3'，正向引物b 5'
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tactgcaagcgcacctgacc
–
3'，反向引物5'
–
tcgacatcgactctagac
–
3'。3.一種如權利要求1所述的hf1和hf6分子標記的篩選方法，其特征在于，包括：利用自主選育的多葉自交系y915和普通玉米自交系鄭58構建f2和f2:3體；采用玉米55k snp芯片對體基因型進行檢測，結合多年多點的表型鑒定結果開展穗上葉片數的qtl定位；對穩定存在的主效位點，利用定位區間兩端的分子標記篩選交換單株；結合玉米重測序的結果，在初定位區間開發新的分子標記標記，并使用標記對交換單株及其自交后代進行基因型鑒定；整合交換單株及其后代的表型數據和基因型數據，縮小定位區間。從本實驗室自主構建的穗上多葉材料y915的bac文庫中篩選覆蓋整個定位區間的克隆并測序；根據bac測序結果及參考基因組的序列差異，在其插入缺失片段及共有片段的交界處設計組合引物fh1和fh6。4.如權利要求1所述的引物組在檢測玉米穗上葉片數及選育穗上多葉玉米中的應用。5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，包括：利用fh1和fh6引物組配制pcr檢測體系對待測玉米品系dna進行pcr擴增，同時以y915作為對照，然后利用瓊脂糖凝膠電泳對樣品及對照玉米的pcr擴增產物并進行基因分型；含有與y915型等位變異的樣品的穗上葉片數顯著高于其它樣品。6.如權利要求4所述的應用，其特征在于，包括：可在種子及幼苗階段提前通過分子標記檢測后代植株的葉片數。
技術總結
本發明公開了一種鑒別玉米穗上葉片數的分子標記以及利用其培育穗上多葉玉米的方法。通過選用自主選育的穗上多葉玉米與常規品種雜交，利用本發明提供的與穗上多葉緊密連鎖的分子標記進行后代葉片數的快速選擇，可顯著縮短育種年限，節省育種成本；同時該方法可拓寬多葉種質資源，對培育多葉玉米新品種提供了重要的技術支持。要的技術支持。要的技術支持。
