免疫組庫正常性評估方法及其應用與流程
免疫組庫正常性評估方法及其應用
1.本技術是國際申請日為2016年9月29日、國際申請號為pct/us2016/054469于2018年3月22日進入中圍國家階段、申請號201680055322.3、發明名稱“免疫組庫正常性評估方法及其應用”的申請的分案申請。
2.相關申請的交叉引用
3.本技術要求標題為“免疫組庫正常性測定方法及其應用(immunorepertoire normality assessment method and its use)”并在2015年9月29日提交的美國臨時專利申請號62/234,424的優先權，其通過引用并入本文。
發明領域
4.本公開內容涉及用于進行診斷測試的方法。更具體地，本公開內容涉及用于相對于標準指數評估免疫組庫多樣性的診斷測試。
5.發明背景
6.診斷測試可以用于檢測患者中是否存在正常狀態，并且這些測試的結果可以用于篩選患者并且籠統得輔助診斷。例如，正常白細胞計數為4,500至10,000個細胞/毫升。升高的白血病計數不確定特定的疾病，但是其可以指示需要醫學評價的潛在問題。女性和男性的紅細胞計數的正常范圍通常是不同的，對于男性，5-6百萬/毫升的計數是正常的，對于女性，3.6-5.6百萬是正常的。通過其在150,000至400,000的范圍內，血小板計數是正常的。例如，存在炎癥時，紅細胞可能下降，白細胞計數可能上升，并且血小板計數也可能升高。
7.類似地，心臟病、患有心臟病的傾向性、某些癌癥的征兆和多種遺傳病可能具有多種診斷測試的一種或或多種異常結果作為其早期征兆。此類診斷測試包括，例如，下述的測量：白蛋白，堿性磷酸酶，丙氨酸轉氨酶(alt)，天冬氨酸氨基轉移酶(ast)，血尿素氮(bun)，血清鈣，血清氯化物，二氧化碳，肌酸酐，直接膽紅素，γ-谷氨酰胺轉肽酶(gamma-gt)，葡萄糖，乳酸脫氫酶(ldh)，血清無機磷，鉀，血清鈉，總膽紅素，總膽固醇，總蛋白和尿酸。
8.另外，血糖水平也可以用作與疾病相關的早期指征，其在庫欣綜合征(cushing syndrome)、甲狀腺功能亢進癥(hyperthyroidism)、胰腺癌、胰腺炎、前驅糖尿病(pre-diabetes)和糖尿病中是不同的。
9.如上文所述，診斷測試目前是可用的，并且以常規基礎進行以檢測個體中異常狀態的存在或不存在。然而，這些測試不涉及患者中免疫組庫的多樣性。檢測個體中相對于標準物是否存在多樣性的免疫組庫的能力可以輔助對所述個體的健康的評估。
10.發明概述
11.本公開內容涉及用于確定患者中免疫組庫多樣性的方法。所述方法包括：定量患者樣品中免疫系統細胞或亞中第三互補性決定區(“cdr3”)的表達；并且鑒定所述或亞內由所述cdr3表示的pcdr3的百分數，其中正常的免疫組庫多樣性特征在于存在pcdr3的最小百分數，而異常的免疫組庫多樣性狀態特征在于不存在pcdr3的最小百分數。
12.在某些實施方案中，所述方法中pcdr3的最小百分數是選自約25％至約75％的百分數。在另一些實施方案中，pcdr3的最小百分數是約25％。在另一些實施方案中，pcdr3由
約1000種最常共有的cdr3構成。在另一些實施方案中，pcdr3由多于1000種最常共有的cdr3構成。在另一些實施方案中，pcdr3由少于1000種最常共有的cdr3構成。在另一些實施方案中，pcdr3由個體集合中至少25％的個體所共有的cdr3構成。
13.在某些實施方案中，pcdr3由個體集合中至少50％的個體所共有的cdr3構成。在某些實施方案中，所述集合包含至少100個個體。在另一些實施方案中，所述集合包含約1000個個體。
14.本公開內容還涉及用于確定患者中的免疫組庫多樣性的方法。所述方法包括：在包含靶標特異性巢式引物的反應混合物中，從來自人或動物受試者的白細胞擴增多核苷酸，以產生一組第一擴增子，至少一部分靶標特異性的巢式引物包含在擴增過程中作為模板用于在第一擴增子中摻入用于至少一個共用引物的結合位點的另外的核苷酸；將一部分包含第一擴增子的第一反應混合物轉移到包含至少一種共用引物的第二反應混合物中；使用所述至少一種共用引物，擴增所述第一擴增子，以產生一組第二擴增子；對所述第二擴增子測序，以鑒定白細胞亞中的cdr3序列；使用所鑒定的cdr3序列來定量由所述樣品所表示的pcdr3百分數，從而提供正常性指數；并且鑒定所述正常性指數是正常的還是異常的，其中正常狀態特征在于存在最小的pcdr3百分數，而異常狀態特征在于不存在最小的pcdr3百分數。
15.在某些實施方案中，所述第二方法測量白細胞，其中所述包含約100,000個隨機選擇的細胞。在某些實施方案中，所述方法重復約10至100次，每次使用隨機選擇的細胞，以確定由患者表達的pcdr3的平均百分數。在某些實施方案中，pcdr3的最小百分數是約25-約75的百分數數字。在某些實施方案中，pcdr3由至少1000種最常共有的cdr3構成。在某些實施方案中，pcdr3包括本文所述的seq id no：1至seq id no：4014。例如，患者的正常性指數可以基于由seq id no：1至seq id no：4014所示的pcdr3序列的百分數(其以患者樣品的預先確定的讀數表示)來確定。在某些實施方案中，pcdr3由個體集合中至少50％的個體所共有的cdr3構成。
16.參比個體集合可以是不同規模的。在某些實施方案中，參比集合包括至少100個個體。在某些實施方案中，所述集合包含約1000個個體。在某些實施方案中，所述集合由健康對照個體構成，而在另一些實施方案中，所述集合由患有一種或多種具體的疾病狀態的個體構成。可以進一步控制參比集合以解釋給定患者的某些變量。在某些實施方案中，個體的集合與患者大致在年齡上匹配。在另一些實施方案中，個體集合與患者是性別匹配的。
17.在本公開內容的不同方面中，以本文所述的方法分析的免疫系統細胞可以包括，例如，所有的t細胞[pant]，t細胞的功能性亞組，如cd8+t細胞[細胞毒性的t(ta)]，cd4+t細胞和它們的亞組[th1，th2，th17，調節性t(reg)和濾泡性t(tfh)]，或t細胞的發育亞組，如幼稚的(naive)t(tn)，激活的t(ta)，記憶性t(tm)，所有的b細胞(panb)和它們的亞組，諸如幼稚的b(br)，激活的b(ba)，記憶性b(bm)，漿細胞和漿母細胞b細胞。所述細胞可以從外周血或本領域已知的其他來源獲得。
[0018]
本領域技術人員應該清楚，通過示例的方式僅描述了優選的實施方案，并且存在在本公開內容范圍之內的多種改進。本公開內容的這些和其他方面將在下文更詳細地討論。
[0019]
附圖簡述
[0020]
圖1顯示疊加在單幅圖中的四個圖，表示(從上到下)總讀數的數目、獨特的cdr3的數目、pcdr3的數目和正常性指數。
[0021]
詳述
[0022]
本方面人已經開發了一種通過比較患者樣品中的cdr3序列與指標個體組中最常共有的cdr3序列(即，pcdr3)而確定患者免疫組庫的多樣性的方法。患者樣品中這一pcdr3的百分數稱為“正常性指數”，并且可以作為所述患者中免疫組庫多樣性的診斷指征。本公開內容還包括用于確定所述高度共有的pcdr3的亞組的方法。在本公開內容的一個方面中，如果患者的正常性指數滿足或超過最小百分數，則認為患者的免疫組庫是正常的，而如果患者的正常性指數低于所述最小百分數，則認為患者的免疫組庫是異常的。用在本文中時，“患者”可以是指人或動物。
[0023]
個體表達的cdr3表現出巨大的多樣性，具有多至10^15種可能的獨特的cdr3。由此，本公開內容使用cdr3作為免疫系統多樣性的基礎。本發明人已經基于7500萬份cdr3取樣確定大約81％隨機選擇的cdr3是給定的個體所特有的，并且在多個個體之間不共有。然而，本公開內容提供一種用于確定高度共有的cdr3的集合的方法，由此得到共有cdr3的標準指數，通過該標準指數可以比較個體免疫組庫的多樣性。
[0024]
用于本文時，“異常”意指在患者中不存在測量的pcdr3序列的最小百分數。由此，異常表示與用于產生pcdr3的參比個體組的差異。異常的免疫組庫可以，但是不必須，表示患者中疾病的存在與否。
[0025]
用于本文時，“免疫組庫”意指實際在一個或多個個體的淋巴細胞中檢測到的一組不同的cdr3序列。
[0026]
本公開的方法可以使用下述步驟進行，以鑒定患者中正常的免疫狀態或異常的免疫狀態，所述方法包括下述步驟：(a)在包含靶標特異性巢式引物的反應混合物中，從來自患者的白細胞擴增多核苷酸，以產生一組第一擴增子，至少一部分靶標特異性的巢式引物包含在擴增過程中作為模板用于在第一擴增子中摻入用于至少一個共用引物的結合位點的另外的核苷酸；(b)將一部分包含第一擴增子的第一反應混合物轉移到包含至少一種共用引物的第二反應混合物中；(c)使用所述至少一種共用引物，擴增所述第一擴增子，以產生一組第二擴增子；(d)對所述第二擴增子測序，以鑒定白細胞亞中的cdr3序列；和(e)使用所鑒定的cdr3序列來定量由所述樣品所表示的pcdr3百分數，從而提供正常性指數；和(f)鑒定所述正常性指數是正常的還是異常的，其中正常狀態特征在于存在最小的pcdr3百分數，而異常狀態特征在于不存在最小的pcdr3百分數。如圖1所示，患者的正常性指數、pcdr3和獨特的cdr3是相關的。
[0027]
在某些實施方案中，測序包括每份樣品采集約100,000個讀數。在某些實施方案中，使用隨機選擇，讀數進行多次，例如，約10至100次，從而獲得樣品中存在的pcdr3序列的平均百分數。得到的數目除以參比集合中的pcdr3數目，以得到一個稱為“正常性指數”的百分數，其是在0％與100％之間的數目。例如，如果患者樣品包含1000個pcdr3序列中的400個，那么該患者的正常性指數是0.40或40％。在另一些實施方案中，采集至少10,000個讀數。在另一些實施方案中，采集多于100,000個讀數。在另一些實施方案中，讀數進行少于10次。在另一些實施方案中，讀數進行多于100次。
[0028]
在某些實施方案中，指數集合由約1000個個體構成。在另一些實施方案中，指數集
合包含100-1000個個體。在另一些實施方案中，指數集合包含少于100個個體。在另一些實施方案中，指數集合包含多于1000個個體。相對于患者，個體可以是年齡匹配的、性別匹配的、健康的、疾病匹配的和/或當關于變量進行對照時本領域通常已知的其他標準。在某些實施方案中，指數集合由健康對照組成。在另一些實施方案中，指數集合由健康對照和具有一個或多個疾病狀態的個體的混合組成。在另一些實施方案中，指數集合由具有一個或多個特定疾病狀態的個體構成。
[0029]
在某些實施方案中，通過比較來自指數集合的每份樣品并鑒定由所述參比集合中檢測的至少50％的個體共有的那些cdr3來確定指數集合共有的cdr3序列(即，pcdr3)。在某些實施方案中，pcdr3包括大約前1000個共有的cdr3序列。在另一些實施方案中，pcdr3包括至少100個cdr3序列。在另一些實施方案中，pcdr3包括多于1000個cdr3序列。
[0030]
在某些實施方案中，用于確定免疫組庫的正常或異常狀態的最小pcdr3百分數為約25％。在另一些實施方案中，最小pcdr3百分數為25％-75％。
[0031]
由于人或動物免疫系統中細胞的數目和種類如此龐大，使得對多于一個小亞組的細胞進行測序幾乎是不可能的，因此之前難以以寬泛的方式評估免疫系統。本發明人開發了一種或半定量的pcr方法(arm-pcr，在美國專利申請公布號20090253183中更詳細地描述)，其提供比之前可用的方法增加的靈敏性和特異性，同時產生半定量結果。正是這種能力增加特異性和靈敏性，并且由此增加單個樣品中可檢測的靶標的數量，這使得該方法理想地用于檢測免疫組庫的克隆型的相對數目。本發明人最近發現，使用這種測序方法允許比較患者的cdr3序列與指數組通常共有的那些，這導致開發了本發明的方法。所述方法可以用于相對于個體的指數集合評價受試者免疫組庫的多樣性。例如，本發明人已經證明了疾病的存在與患病的免疫組庫多樣性相關，例如，cdr3序列的多樣性下降，這可以使用本公開的方法容易地檢測到。因此，盡管目前在臨床實踐中使用細胞計數和生化測試，但是這種方法可以用作正常相對異常免疫組庫多樣性的初始診斷指征。
[0032]
免疫組庫的克隆型(即，克隆類型)通過在免疫系統的免疫球蛋白(ig)和t細胞受體(tcr)產生的早期階段可變的(v)、多樣性(d)和連接(j)基因片段經由體細胞重組的重排來確定。v(d)j重排可以從t細胞受體α、β、γ和δ鏈以及從免疫球蛋白重鏈(igh)和輕鏈(igk，igl)擴增并檢測。例如，細胞可以通過獲得外周血、淋巴組織、癌組織、或來自其他器官和/或器官系統的組織或流體從患者獲得。獲得這些樣品(諸如血液樣品)的技術是本領域技術人員已知的。細胞計數可以從通過pcr擴增和測序檢測的序列的數目推測得到。
[0033]
cdr3區包含約30-90個核苷酸，包括重組的基因的可變的(v)、多樣性(d)和連接(j)片段的連接。其編碼受體的結合特異性，并且可用作序列標簽以鑒定獨特的v(d)j重排。
[0034]
wang等公開了可以使用pcr來獲得樣本中靶分子數目的定量或半定量測定(wang，m.等人，“quantitation of mrna by the polymerase chain reaction，”(1989)proc.nat’l.acad.sci.86：9717-9721)。本發明人之前已經描述了用于實現定量擴增的特別有效的方法。一種這樣的方法稱為arm-pcr，其記載在美國專利申請公布號20090253183a1中。
[0035]
本公開的各個方面包括從t細胞、b細胞和/或t或b細胞亞組arm-pcr擴增cdr3。所述細胞型可以使用本領域已知的技術分選并分離，所述技術包括，但不限于，facs分選和磁珠分選。因此，本文中所用的術語細胞“”包括通常稱為細胞“”或“亞”的那些。然后，
例如，使用諸如454或illumina的平臺，使用下一代測序，有效地對大量擴增的產物進行測序。
[0036]
arm-pcr方法在一次反應中提供多個多核苷酸的高度靈敏的、半定量的擴增。arm-pcr方法還可以通過自動化方法在封閉的盒系統(huntsville，alabama)中進行，這在本發明的方法是有益的，原因在于，例如，多種t和b細胞的庫是如此龐大的。在arm-pcr方法中，靶標數量在由dna聚合酶驅動的反應中增加，這是被引入到反應中的靶標特異性引物的結果。該擴增反應的另一個結果是引入用于共用引物的結合位點，其通過將一部分包含第一組擴增子的第一反應混合物轉移到包含共用引物的第二反應混合物中而用于后續的擴增。用于本文時，“至少一種共用引物”是指至少一種將與所述結合位點結合的引物，并且包括引物對，諸如正向引物和反向引物。該轉移可以通過從第一擴增反應回收一部分反應混合物并且將所述樣品引入到第二反應管或室中而進行，或者通過從結束的第一擴增中去除一部分液體，留下一部分，并且向進行第一擴增的管中加入新鮮的試劑而進行。在每種情形中，然后，將另外的緩沖液、聚合酶等與共用引物一起加入，以產生擴增的產物用于檢測。使用共用引物擴增靶分子提供半定量結果，其中在第一擴增中擴增的定量數目的靶標使用共用引物而不是靶標特異性引物而擴增——這使其可以產生顯著更高數量的靶標用于檢測并且確定患者血液樣品內包含多種重排的細胞的相對量。此外，將第二反應混合物與一部分第一反應混合物組合允許向第一反應混合物中加入更高濃度的靶標特異性引物，這在第一擴增反應中導致更高的靈敏性。正是使用諸如arm-pcr方法的方法的特異性和靈敏性以及獲得定量結果的能力的組合允許對在細胞中表達的cdr3的充分靈敏和定量的評估，從而產生具有診斷用途的正常性指數。
[0037]
由于識別抗原的克隆擴增導致更大的識別所述抗原的細胞，潛在地包括產生抗體的b細胞或攜帶受體的t細胞。這可能引起依據本文公開的方法采集的讀數偏向抗原特異性擴增方面，由此減少檢測的pcdr3序列的百分數。因此，相對低的正常性指數，例如，低于最小百分數的一個正常性指數，可能指示在已經診斷患有特定疾病的個體中或在最近用特定的抗原疫苗接種的個體中普遍存在的特定細胞的擴增。
[0038]
用于擴增和測序免疫系統細胞的可變區的引物可商購得到，并且已經在出版物中記載，諸如記載在本發明人公開的專利申請w02009137255和us201000021896a1。
[0039]
存在一些可商業獲得的高通量測序技術，諸如hoffman-laroche公司的測序系統。在測序方法中，例如，a和b銜接子在pcr過程中連接在pcr產物上或在pcr反應后連接在其上。所述銜接子用于擴增和測序步驟。當聯合arm-pcr技術進行時，a和b銜接子可以用作擴增反應中的共用引物(其有時稱為“公用引物”或“超級引物”)。在a和b銜接子物理連接到樣品文庫(如pcr擴增子)上后，使用本領域技術人員已知的技術制備單鏈dna文庫。將所述單鏈dna文庫固定在特別設計的dna捕獲珠子上。每個珠子攜帶獨特的單鏈dna文庫片段。將珠子結合的文庫用在油包水混合物中的擴增試劑乳化，產生微型反應器，每個微型反應器僅包含一個具有一個獨特的樣品-文庫片段的珠子。每個獨特的樣品文庫片段在其自身的微型反應器內擴增，排除了競爭或污染序列。整個片段集合的擴增平行進行。對于每個片段，這導致每個珠子有數百萬拷貝數。隨后，中斷乳液pcr，而擴增的片段保持與其特定的珠子結合。將克隆擴增的片段富集并且上樣到裝置上進行測序。孔的直徑僅允許每個孔一個珠子。將加入測序酶后，測序儀器的流控亞系
統在成千上百個分別包含單個珠子的孔之間以固定的次序流過個體核苷酸。加入與模板鏈互補的一個(或多個)核苷酸導致通過該儀器內的ccd照相機記錄的化學發光信號。使用gs flx系統，裝置產生的信號強度和位置信息的組合允許軟件確定大于1,000,000個個體讀數的序列，每個多至約450個堿基對。
[0040]
使用定量和/或半定量方法已經獲得了序列，然后可以計算正常性指數，例如，通過確定由患者樣品預先確定的讀數數量所表示的pcdr3百分數來計算。每個患者的正常性指數可以與預先確定的閾值進行比較，以確定所述患者的正常性指數是否落入正常范圍內，并且因此是正常的，或者低于該閾值，并且因此是異常的。
[0041]
本公開內容的方法為醫師提供另外的診斷目的的臨床測試，以確定患者的免疫組庫是否是異常的。此外，本公開內容的方法，特別是如果用在自動化系統中，諸如本發明人在美圍專利申請公布號201000291668a1中所述的自動化系統中，可以用于分析來自多名患者的樣品，通過使用一個或多個微陣列實現對所擴增的靶序列的檢測。
實施例
[0042]
患者樣品
[0043]
采集在肝素鈉中全血樣品(40ml)或外周血單核細胞細胞(pbmc)是從1100個個體獲得的，代表健康個體和患有疾病的個體的混合體。將這1100個個體隨機分成11個不同的組，每組100份樣品。
[0044]
rna提取和庫擴增
[0045]
rna提取使用rneasy迷你試劑盒(rneasy mini kit，qiagen)按照供應商流程進行。對于每個靶標，使用在www.irepertoire.com可用的引物軟件設計一組巢式序列特異性的引物(正向-外，fo；正向-內，fi；反向-外，ro；和反向-內，ri)。將一對共有序列標簽連接到所有內部引物(fi和ri)上。一旦在前幾個擴增周期中這些標簽被摻入到pcr產物中，使用一對公用引物進行擴增的指數相。在第一輪擴增中，僅使用序列特異性的巢式引物。然后通過外切核酸酶消化去除巢式引物，并且通過加入公用引物和新鮮酶與dntp的混合物，使用第一輪pcr產物作為模板進行第二輪擴增。由pcr引物向來自相同樣品的擴增子中引入每種獨特的條形碼(barcode)。
[0046]
測序
[0047]
將來自不同樣品的條形碼標記的擴增子產物匯合在一起，并且上樣到2％瓊脂糖凝膠上。在電泳后，從對應由瓊脂糖凝膠上切下的250-500bp片段的dna條帶純化dna片段。使用鈦試劑盒(seqwright，inc.)用454gsflx系統對dna測序。
[0048]
測序數據分析
[0049]
按照條形碼標簽分選每種樣品的序列。在序列分離后，以與wang等人報道的方法(wang c，等人.high throughput sequencing reveals a complex pattem of dynamic interrelationships among human t cell subsets.proc natl acad sci usa 107(4)：1518-1523)相似的方式進行序列分析。簡言之，將由imgt服務器(http：//www.imgt.org)下載的種系v和j參比序列用程序irmap繪制到序列讀數上。通過繪圖信息，將參比序列中限定cdr3區的邊界映照到測序讀數上。提取測序讀數中所包括的cdr3區，并且翻譯成氨基酸序列。
[0050]
確定pcdr3
[0051]
將從11組的每個組得到的序列進行比較，以確定哪些cdr3序列在每組至少50％的樣品中檢測到。將得到的cdr3序列分選，以選擇前4014個最常共有的cdr3序列作為pcdr3，用于計算患者樣品的正常性指數的目的。為包括在pcdr3中所選的cdr3序列-seq id no：1到seq id no：4014-顯示在表i中。
[0052]
表i
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[0099]
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[0101]
[0102][0103]
本技術提及多篇出版物。這些出版物的公開內容以它們的整體特此通過引用并入本技術中以更充分地描述本技術所述屬領域的狀態。關于在所述參考文獻所依賴的句子中討論的、在它們中所含的內容，公開的參考文獻也個別地和具體地通過引用并入本文。
[0104]
本文描述的方法及其各種實施方案是示例性的。本文描述的方法的各種其它實施方案是可能的。
技術特征：
1.一種用于使用免疫組庫多樣性評估個體患者的免疫組庫的正常或異常狀態的方法，所述方法包括下述步驟：(a)使用針對由參比個體組共有和鑒定的pcdr3序列的引物，檢測在所述共有的pcdr3序列組內的個體的cdr3在所述患者的免疫組庫中的存在；和(b)鑒定來自所述患者的免疫組庫內存在的所述共有組的pcdr3序列的百分數，以評估所述患者的免疫組庫的狀態，其中，相對于所述共有的組，存在共有pcdr3序列的最小百分數表示正常的免疫組庫，和不存在共有pcdr3序列的最小百分數表示異常的免疫組庫。2.權利要求1的方法，其中細胞選自由下述組成的組：所有t細胞[pant]，cd8+ t細胞[細胞毒性的t(ta)]，cd4+ t細胞和它們的亞組[th1，th2，th17，調節性t(treg)，濾泡性t(tfh)]，t細胞的發育亞組，如幼稚的t(tn)，激活的t(ta)，記憶性t(tm)，所有的b細胞(panb)，幼稚的b(br)，激活的b(ba)，記憶性b(bm)，漿細胞和漿母細胞b細胞。3.權利要求1的方法，其中所述pcdr3的最小百分數是選自約25％至約75％的百分數數字。4.權利要求1的方法，其中所述pcdr3的最小百分數是約25％。5.權利要求1的方法，其中所述pcdr3由約1000個最常共有的cdr3構成。6.權利要求1的方法，其中所述pcdr3由多于1000個最常共有的cdr3構成。7.權利要求1的方法，其中所述pcdr3由少于1000個最常共有的cdr3構成。8.權利要求1的方法，其中所述pcdr3由個體集合中至少25％的個體共有的cdr3構成。9.權利要求1的方法，其中所述pcdr3由個體集合中至少50％的個體共有的cdr3構成。10.權利要求9的方法，其中所述集合包含至少100個個體。11.權利要求9的方法，其中所述集合包含約1000個個體。12.用于確定患者中免疫組庫多樣性的方法，所述方法包括：(a)在包含靶標特異性巢式引物的反應混合物中，從來自人或動物受試者的白細胞擴增多核苷酸，以產生一組第一擴增子，至少一部分靶標特異性的巢式引物包含在擴增過程中作為模板用于在第一擴增子中摻入至少一個共用引物的結合位點的另外的核苷酸；(b)將一部分包含第一擴增子的第一反應混合物轉移到包含至少一種共用引物的第二反應混合物中；(c)使用所述至少一種共用引物，擴增所述第一擴增子，以產生一組第二擴增子；(d)對所述第二擴增子測序，以鑒定白細胞亞中的cdr3序列；(e)使用所鑒定的cdr3序列來定量由所述樣品所表示的pcdr3百分數，從而提供正常性指數；和(f)鑒定所述正常性指數是正常的還是異常的，其中正常狀態特征在于存在最小的pcdr3百分數，和異常狀態特征在于不存在最小的pcdr3百分數。13.權利要求12的方法，其中所述細胞選自由下述組成的組：所有的t細胞[pant]，cd8+ t細胞[細胞毒性的t(ta)]，cd4+ t細胞和它們的亞組[th1，th2，th17，調節性t(treg)，濾泡性t(tfh)]，t細胞的發育亞組，如幼稚的t(tn)，激活的t(ta)，記憶性t(tm)，所有的b細胞(panb)，幼稚的b(br)，激活的b(ba)，記憶性b(bm)，漿細胞和漿母細胞b細胞。14.權利要求12的方法，其中所述白細胞為約100,000個隨機選擇的細胞。15.權利要求12的方法，其中所述方法重復約10至100次，每次使用隨機選擇的細胞，從
而確定由所述患者表達的pcdr3的平均百分數。16.權利要求12的方法，其中所述pcdr3的最小百分數是約25至約75的百分數數字。17.權利要求12的方法，其中所述pcdr3的最小百分數為約25％。18.權利要求12的方法，其中所述pcdr3由至少1000個最常共有的cdr3構成。19.權利要求12的方法，其中所述pcdr3包括seq id no：1至seq id no：4014。20.權利要求12的方法，其中所述pcdr3由個體集合中至少50％的個體共有的cdr3構成。21.權利要求20的方法，其中所述集合包含至少100個個體。22.權利要求20的方法，其中所述集合包含約1000個個體。23.權利要求20的方法，其中所述集合由健康對照個體構成。24.權利要求20的方法，其中所述集合由具有一種或多種具體的疾病狀態的個體構成。25.權利要求20的方法，其中所述個體集合是與所述患者大致年齡匹配的。26.權利要求20的方法，其中所述個體集合是與所述患者性別匹配的。
技術總結
本公開內容一般涉及用于比較患者的免疫組庫多樣性與一組個體共有的免疫組庫從而鑒定所述患者的免疫組庫多樣性相對于所述一組個體共有的免疫組庫是正常還是異常的方法。個體共有的免疫組庫是正常還是異常的方法。
