一種重組腺病毒及其應用
1.本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種重組腺病毒及其應用。
背景技術：
2.豬腸道冠狀病毒(包括α冠狀病毒屬傳染性胃腸炎病毒(tgev)、豬流行性腹瀉病毒(pedv)和2017年新出現的豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(sads-cov)和豬德爾塔冠狀病毒(pdcov))是引起仔豬腹瀉的主要病原，這些豬腸道冠狀病毒體內主要感染小腸，可引起新生仔豬急性腹瀉，迅速脫水，表現相似的臨床癥狀和病理變化。其中pedv導致的腹瀉占60％以上的新生仔豬腹瀉，危害最大，導致高達100％的發病率和死亡率，給現有的養豬業造成重大經濟損失。但由于pedv主要感染腸道，腸道局部黏膜免疫在抗pedv感染中起著關鍵作用。盡管市場有針對pedv的商品化疫苗，但由于商品疫苗誘導黏膜免疫效果較差，且目前的疫苗主要是通過接種母豬由母乳提供仔豬被動保護，因此對仔豬的免疫保護效果并不理想，pedv引起的新生仔豬腹瀉依然時常發生，給現有養豬業帶來巨大損失。因此，迫切需要研發一種對pedv緊急的制劑。
3.pedv在體內主要感染豬腸道上皮細胞，腸道黏膜免疫對于機體抵抗pedv感染至關重要。il-10家族細胞因子ifn-l和il-22選擇性作用于黏膜上皮細胞，如呼吸道、腸道等。其在黏膜上皮屏障抗感染過程中發揮著重要作用。
技術實現要素：
4.為了解決現有技術存在的問題，本發明提供一種重組腺病毒及其應用。
5.第一方面，本發明提供重組腺病毒，包括：豬干擾素λ3和豬白介素22的基因序列。
6.進一步地，所述豬干擾素λ3包括如seq id no.1所示的氨基酸序列；所述豬白介素22包括如seq id no.2所示的氨基酸序列。
7.進一步地，所述豬干擾素λ3由如seq id no.3所示的核苷酸序列編碼得到；所述豬白介素22由seq id no.4所示的核苷酸序列編碼得到。
8.進一步地，所述重組腺病毒包括：
9.順序排列的豬干擾素λ3、furin蛋白酶切割位點、f2a元件和豬白介素22。
10.優選地，在豬干擾素λ3和豬白介素22的n還包括信號前導序列。
11.進一步優選地，所述信號前導序列包括如seq id no.5所示的核苷酸序列。
12.進一步地，所述重組腺病毒包括如seq id no.5所示的核苷酸序列。
13.本發明進一步提供所述重組腺病毒的制備方法，包括：
14.構建含有豬干擾素λ3和豬白介素22的基因序列的重組腺病毒質粒；
15.使用所述重組腺病毒質粒轉染hek293細胞，培養后獲得重組腺病毒。
16.本發明進一步提供包括所述重組腺病毒和試劑盒。
17.本發明進一步提供所述重組腺病毒在抑制豬腸道冠狀病毒中的應用。
18.本發明進一步提供所述重組腺病毒在制備抑制豬腸道冠狀病毒的藥物中的應用。
19.本發明進一步提供所述重組腺病毒在制備豬急性腹瀉的藥物中的應用。
20.本發明具備如下有益效果：
21.本發明通過在豬三型干擾素lambda 3(ifn-λ3)和豬白介素22(il-22)的n端分別插入一個信號前導序列，并在豬ifn-λ3和il-22之間插入furin蛋白酶切割位點和f2a元件，利用人5型缺陷性腺病毒進行分泌表達。結果發現這樣的重組腺病毒能夠同時分泌表達豬ifn-λ3和il-22，并具有極佳的體外和體內抑制pedv病毒效果。
22.令人驚訝的是，在臨床生產實踐中該重組腺病毒對于早期pedv感染的新生仔豬效果顯著，能夠顯著降低新生仔豬的死亡率和改善仔豬的狀態，促進康復。這對于臨床應用具有不可估量的價值。
23.本發明所提供的重組腺病毒，具有良好的安全性以及體內和體外抗病毒效果，pedv感染效果顯著優于目前市場上的藥物或制劑，因而具有廣闊的臨床應用前景。
附圖說明
24.圖1為本發明實施例1提供的重組腺病毒pad5-ifn-λ3-il-22質粒的構建示意圖。
25.圖2為本發明實施例1提供的重組腺病毒pad5-ifn-λ3-il-22體外分泌表達的豬il-22的elisa結果。
26.圖3為本發明實施例1提供的重組腺病毒pad5-ifn-λ3-il-22體外抑制pedv感染的間接免疫熒光結果。
具體實施方式
27.以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
28.實施例1
29.1、重組質粒pshuttle-ifn-λ3-il-22的構建
30.質粒構建示意圖如圖1所示，先直接合成5’端帶有kpni酶切位點和3’端帶有xhoi酶切位點的核苷酸序列(包括豬成熟ifn-λ3和il-22)，其中豬成熟ifn-λ3和il-22的核苷酸序列經過密碼子優化，并在豬ifn-λ3和il-22之間插入furin蛋白酶切割位點和f2a元件。由北京六合華大基因科技有限公司制成穿刺菌種，涂板，提取質粒。利用kpn i/xho i雙酶切該質粒獲得的ifn-λ3-il-22基因片段(核苷酸序列如seq id no.6所示，編碼得到的氨基酸序列如seq id no.7所示)克隆到pshuttle-cmv穿梭載體中，構建重組穿梭載體pshuttle ifn-λ3-il-22，通過kpn i和xho i雙酶切和測序鑒定。
31.2、重組質粒pad-ifn-λ3-il-22的構建
32.其中，bj5183感受態細胞的制備方法可參見中國專利申請cn201810651914.2)。將1μg線性化的pshuttle-ifn-λ3-il-22重組穿梭質粒與0.1μg adeasytm質粒加入到bj5183感受態中進行電轉化，經同源重組構建重組腺病毒質粒pad5-ifn-λ3-il-22，并通過pac i單酶切鑒定。
33.3、重組腺病毒pad5-ifn-λ3-il-22的產生
34.待6孔板中的hek293細胞培養至80％-90％密度時進行下述的質粒轉染：將4μg pad5-ifn-λ3-il-22用pac i酶切線性化后，分別與lip3000試劑混合后轉染hek293細胞。轉染8h后將培養液換成含有3％fbs的培養液。于37℃、5％co2培養10d～12d直至出現細胞病
變(cpe)后，反復凍融離心收獲上清，獲得重組pad5-ifn-λ3-il-22腺病毒。
35.用hek293懸浮細胞進行擴增病毒。并利用商品試劑盒如adeno-x
tm
rapid titer kit，按照說明書測定重組病毒pad5-ifn-λ3-il-22的滴度。
36.4、重組腺病毒體外分泌表達豬ifn-λ3和il-22的鑒定
37.將pad5-ifn-λ3-il-22以moi＝5感染hek293細胞，48h收獲細胞培養上清。通過豬白介素-22elisa試劑盒檢測細胞培養上清中分泌表達的il-22。其結果見圖2.
38.5、重組腺病毒體外分泌表達豬ifn-λ3和il-22的對pedv抑制活性的檢測
39.重組pad5-ifn-λ3-il-22轉染hek293細胞48小時后的培養上清分別做5，25，125，和625倍的稀釋，取100μl稀釋上清預處理vero細胞24小時后，然后用100μl pedv cv777株(4000tcid
50
/ml，含3μl/ml 0.25％胰酶，1％sp)感染，37℃孵育1h后加入到96孔板中生長良好的vero細胞中，37℃孵育2h后，加入3％fbs的dmem繼續培養。36h后，分別收取細胞，通過間接免疫熒光檢測pedv感染。結果如圖3所示：重組pad5-ifn-λ3-il-22轉染hek293細胞48小時后的培養上清顯著抑制pedv感染，并劑量依賴性反應。證明重組pad5-ifn-λ3-il-22能夠表達ifn-λ3并具有抗病毒功能。
40.6、pad5-ifn-λ3-il-22臨床保護實驗
41.選用初產母豬所產的新生3-11日齡仔豬出現pedv腹瀉14圈，共163頭仔豬，分為2組，未處理組1圈仔豬8頭，其余13圈共155頭仔豬為干擾素組。在仔豬出現臨床癥狀時分別肌肉注射生理鹽水或pad5-ifn-λ3-il-22制品，注射劑量均按每頭仔豬體重1
×
10
10
ifu，各組同條件下飼養，觀察仔豬臨床癥狀，記錄死亡的仔豬數量，計算成活率。并在仔豬斷奶后測量存活仔豬的斷奶末重。結果如表1所示。
42.表1重組腺病毒pad5-ifn-λ3-il-22生產實踐中的pedv腹瀉的結果
[0043][0044]
豬流行腹瀉病毒(pedv)感染新生仔豬后，往往造成高達100％的發病率和死亡率。如表1中所示，未經過pad5-ifn-λ3-il-22處理的對照仔豬發生流行性腹瀉，導致近90％的死亡。而且即使存活的仔豬由于pedv感染導致腸道損傷，成為僵豬，表現為仔豬斷奶末重低。當仔豬出現腹瀉癥狀，一次性肌肉注重組腺病毒pad5-ifn-λ3-il-22 1
×
10
10
ifu后，新生仔豬成活率達到89.03％，比對照組提高了7倍，而且仔豬斷奶末重達到5公斤以上，和正常豬沒有顯著差異。這些結果證明該制劑在臨床生產中能夠對pedv引起的新生仔豬病毒性腹瀉具有較好的效果。
[0045]
此外，除了pedv，ifn-λ對其它常見病毒性腹瀉病原包括豬傳染性胃腸炎病毒(tgev)、豬德爾塔病毒(pdcov)和輪狀病毒都具有抑制作用，因此該制劑具有對常見仔豬病毒性腹瀉都具有作用。
[0046]
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之做一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
技術特征：
1.一種重組腺病毒，其特征在于，包括：豬干擾素λ3和豬白介素22的基因序列。2.根據權利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于，所述豬干擾素λ3包括如seq id no.1所示的氨基酸序列；和/或，所述豬白介素22包括如seq id no.2所示的氨基酸序列。3.根據權利要求2所述的重組腺病毒，其特征在于，所述豬干擾素λ3由如seq id no.3所示的核苷酸序列編碼得到；和/或，所述豬白介素22由seq id no.4所示的核苷酸序列編碼得到。4.根據權利要求1-3任一項所述的重組腺病毒，其特征在于，包括：順序排列的豬干擾素λ3、furin蛋白酶切割位點、f2a元件和豬白介素22；優選地，在豬干擾素λ3和豬白介素22的n還包括信號前導序列；進一步優選地，所述信號前導序列包括如seq id no.5所示的核苷酸序列。5.根據權利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于，所述重組腺病毒包括如seq id no.6所示的核苷酸序列。6.權利要求1-5任一項所述重組腺病毒的制備方法，其特征在于，包括：構建含有豬干擾素λ3和豬白介素22的基因序列的重組腺病毒質粒；使用所述重組腺病毒質粒轉染hek293細胞，培養后獲得重組腺病毒。7.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1-5任一項所述重組腺病毒。8.權利要求1-5任一項所述重組腺病毒在抑制豬腸道冠狀病毒中的應用。9.權利要求1-5任一項所述重組腺病毒在制備抑制豬流行性腹瀉病毒的藥物中的應用。10.權利要求1-5任一項所述重組腺病毒在制備豬急性腹瀉的藥物中的應用。
技術總結
本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種重組腺病毒及其應用。本發明將豬干擾素λ3和豬白介素重組至腺病毒的基因序列中并進行分泌表達，得到一種能夠在豬體內和腸道組織中高效短暫表達IF-λ3和IL-22的重組腺病毒。本發明提供的重組腺病毒具有良好的安全性以及體內和體外抗豬流行性腹瀉病毒的效果，對感染PED仔豬的治愈率達到89％以上，在抗豬腸道冠狀病毒感染的領域有重要意義。狀病毒感染的領域有重要意義。狀病毒感染的領域有重要意義。
