用于預(yù)防或纖維化疾病的重組融合蛋白的制作方法
1.本發(fā)明涉及一種可用于預(yù)防或發(fā)生在肝臟、胰腺、肺等中的纖維化疾病的白蛋白與視黃醇結(jié)合蛋白的融合蛋白。
背景技術(shù)：
2.組織纖維化(fibrosis)導(dǎo)致組織功能衰竭的致命后果。例如，肝纖維化導(dǎo)致肝功能衰竭，然后發(fā)展為肝硬化和肝癌，在慢性胰腺炎和胰腺癌中都觀察到纖維化組織。目前，尚無針對纖維化疾病的劑，組織移植是最有希望的方法。組織纖維化的分子機制尚未闡明，對纖維化疾病劑的研發(fā)是必要的。
3.最近，發(fā)現(xiàn)組織纖維化是由構(gòu)成組織的細胞之一的星狀細胞(stellate cells)的活化過程(活化(activation)及轉(zhuǎn)分化(transdifferentiation))引起的。活化的星狀細胞過度表達和積累細胞外基質(zhì)如膠原蛋白，并分化為肌成纖維細胞(myofibroblast)。這些活化的星狀細胞在組織纖維化的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。
4.星狀細胞(stellate cell)不僅分布在肝臟中，還分布在胰腺、肺、腎和腸等中，并在調(diào)節(jié)整個身體的類視黃醇穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮核心作用。從食物中獲得的維生素a(視黃醇)與血流中的視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein，rbp)結(jié)合并循環(huán)，通過作為rbp受體的stra6移動到星狀細胞，并以視黃酯的形式儲存在細胞質(zhì)脂肪滴中。另一方面，已知白蛋白抑制其在星狀細胞中的活化，并且已經(jīng)活化的星狀細胞中白蛋白的表達轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨暗臓顟B(tài)。
5.在先前的研究中，本發(fā)明人通過結(jié)合rbp與白蛋白制備了一種靶向星狀細胞的融合蛋白，并確認(rèn)了纖維化的預(yù)防及效果，該rbp可以通過stra6進入星狀細胞，以抑制星狀細胞的活化或使其失活，這是組織纖維化的開始(kr 10-1395394)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
6.技術(shù)問題
7.本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提高現(xiàn)有rbp-白蛋白融合蛋白對星狀細胞的活化抑制或失活的效果，本發(fā)明提供一種白蛋白的一個以上氨基酸序列被取代的rbp-白蛋白融合蛋白以及以不同排列方式連接的rbp-白蛋白融合蛋白。
8.并且，本發(fā)明通過提供可表達上述融合蛋白的載體和其中導(dǎo)入了上述載體的轉(zhuǎn)化體來提供本發(fā)明的重組蛋白的大量生產(chǎn)方法。
9.并且，本發(fā)明的融合蛋白與現(xiàn)有rbp-白蛋白融合蛋白相比在星狀細胞的活化抑制或失活的方面表現(xiàn)出更優(yōu)異的效果，因此，本發(fā)明提供一種包含上述融合蛋白的用于預(yù)防或纖維化疾病的組合物。
10.然而，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題并不限于如上所述的問題，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過以下描述將清楚地理解未提及的問題或其他問題。
11.解決問題的方案
12.為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種由序列1或2的氨基酸序列組成或者包含其的融合蛋白。
13.并且，本發(fā)明提供一種由序列3至8中任一氨基酸序列組成或者包含其的融合蛋白。
14.作為本發(fā)明一實例，上述融合蛋白可用于預(yù)防或組織纖維化。
15.并且，本發(fā)明提供一種編碼上述各融合蛋白的多核苷酸，上述多核苷酸可由序列9至14中任一堿基序列組成或者包含這些。
16.并且，本發(fā)明提供一種包含用于編碼上述融合蛋白的基因的重組載體，以及包含上述重組載體的轉(zhuǎn)化體。
17.并且，本發(fā)明提供一種融合蛋白的生產(chǎn)方法，包括：步驟(1)，制備重組載體，上述重組載體包含用于編碼由序列1至8中任一氨基酸序列組成的融合蛋白的基因；步驟(2)，通過將上述重組載體導(dǎo)入宿主細胞來制備轉(zhuǎn)化體；步驟(3)，培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體；以及步驟(4)，從上述培養(yǎng)液中獲得融合蛋白。
18.作為本發(fā)明一實例，編碼上述融合蛋白的基因可包含由選自由序列9至14組成的組中的一個以上堿基序列組成的多核苷酸。
19.作為本發(fā)明另一實例，上述宿主細胞可以為哺乳動物的細胞，優(yōu)選地，可以為哺乳動物的癌細胞，更優(yōu)選地，可以為cho細胞(cho cell)。
20.并且，本發(fā)明可提供一種包含由序列1至8中任一氨基酸序列組成的融合蛋白的用于預(yù)防或纖維化疾病的藥物組合物。
21.并且，本發(fā)明可提供一種纖維化疾病的預(yù)防或方法，包括向個體給予由序列1至8中任一氨基酸序列組成的融合蛋白的步驟。
22.作為本發(fā)明一實例，上述個體可以為需要預(yù)防或纖維化疾病的人類，尤其，可以為非酒精性脂肪肝病的患者。
23.作為本發(fā)明另一實例，上述方法還可以包括在給藥上述融合蛋白之后通過進行ct成像或活檢來診斷纖維化程度的步驟。
24.作為本發(fā)明一實例，上述纖維化疾病可以為選自由肝纖維化(liver fibrosis)、慢性肝炎(chronic hepatitis)、肝硬化(cirrhosis)、肝癌(hepatic cancer)、化療相關(guān)脂肪性肝炎(chemotherapy-associated steatohepatitis，cash)、肺纖維化(lung fibrosis)、腎纖維化(renal fibrosis)、腎衰竭(renal failure)、胰腺纖維化(pancreatic fibrosis)、慢性胰腺炎(chronic pancreatitis)及胰腺癌(pancreatic cancer)組成的組中的一種以上疾病。
25.并且，本發(fā)明提供一種上述融合蛋白在制備用于預(yù)防或纖維化疾病的藥物中的用途。
26.發(fā)明的效果
27.本發(fā)明的融合蛋白可通過抑制引起組織纖維化的星狀細胞的活化或者誘導(dǎo)星狀細胞的失活來預(yù)防或纖維化疾病，與用于相同目的的現(xiàn)有融合蛋白相比，在低濃度下表現(xiàn)出更優(yōu)異的效果，因此，本發(fā)明的融合蛋白有望成為一種通用的基礎(chǔ)技術(shù)，可以顯著降低蛋白質(zhì)劑對人體的給藥劑量和頻率。
附圖說明
28.圖1為示出白蛋白iii與rbp結(jié)合的融合蛋白包含在活化的星狀細胞中并起作用的機制的圖。
29.圖2為比較并確認(rèn)本發(fā)明的融合蛋白1及2與現(xiàn)有融合蛋白(rbp-白蛋白iii及白蛋白iii-rbp)對活化的星狀細胞的失活誘導(dǎo)效果的圖。
30.圖3為比較并確認(rèn)本發(fā)明的融合蛋白1及2與融合蛋白3至6對活化的星狀細胞的失活誘導(dǎo)效果的圖。
31.圖4a及圖4b通過天狼星紅組織染來比較并確認(rèn)向肝纖維化動物模型給藥融合蛋白1及4和rbp-白蛋白后的肝纖維化程度的圖。
具體實施方式
32.白蛋白是一種主要在肝細胞中合成的多功能血漿蛋白。白蛋白具有三個結(jié)構(gòu)域(domain)，每個結(jié)構(gòu)域由兩個亞結(jié)構(gòu)域(subdomain)a和b組成。已知白蛋白在分子運動中發(fā)揮作用，即，與包括脂肪酸和視黃酸在內(nèi)的各種疏水物質(zhì)結(jié)合并在血液中運輸分子。根據(jù)晶體學(xué)分析，五個強脂肪酸結(jié)合位點不對稱分布在白蛋白中(一個在亞結(jié)構(gòu)域ib，一個在ia與iia之間，兩個在iiia，一個在iiib)。
33.在之前的研究中，本發(fā)明人制備了一種白蛋白與用于靶向星狀細胞的視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein，rbp)結(jié)合的融合蛋白，并確認(rèn)了上述融合蛋白流入到活化的星狀細胞中，以將細胞的形態(tài)反向轉(zhuǎn)換為活化前的形態(tài)，從而能夠預(yù)防和纖維化疾病。此外，本發(fā)明人已確定視黃酸(retinoic acid，ra)在星狀細胞的活化過程中起重要作用，并且融合蛋白通過降低這種ra的細胞內(nèi)水平來控制星狀細胞的活化。因此，為了開發(fā)一種能夠更穩(wěn)定地與視黃酸(retinoic acid，ra)結(jié)合以誘導(dǎo)星狀細胞的活化抑制或失活的融合蛋白，利用白蛋白的序列變異以及多種組合的白蛋白亞結(jié)構(gòu)域(sub-domain)和rbp的排列制備了一種新的白蛋白rbp融合蛋白。
34.在以往的研究中，在白蛋白的結(jié)構(gòu)域中，結(jié)構(gòu)域iii與rbp的融合蛋白對星狀細胞的活化抑制或失活效果最好。基于該結(jié)果，本發(fā)明人嘗試制備與視黃酸結(jié)合增強的重組融合蛋白。
35.因此，在現(xiàn)有白蛋白結(jié)構(gòu)域iii和rbp融合蛋白中，估計結(jié)構(gòu)域iii的第526位和第600位大氨基酸干擾與ra的結(jié)合，將其替換為較小尺寸的氨基酸，以確認(rèn)活化的星狀細胞由于與ra結(jié)合而失活的效果(參見序列1及2)。
36.具體地，本發(fā)明人將白蛋白結(jié)構(gòu)域iii中的第526位氨基酸殘基(苯丙氨酸(phenylalanine))和第600位氨基酸殘基(纈氨酸(valine))分別替換為纈氨酸(valine)和丙氨酸(alanine)，從而如下設(shè)計和制備了融合蛋白1及2。
[0037]-融合蛋白1：rbp(1～193)+白蛋白iii{404～526(f
→
v)～600(v
→
a)～601}
[0038]-融合蛋白2：白蛋白[信號肽(signal peptide)(1～18)+iii{404～526(f
→
v)～600(v
→
a)～601}]+rbp(17～192)
[0039]
并且，本發(fā)明人確認(rèn)白蛋白的亞結(jié)構(gòu)域(sub-domain)ib和iiia與視黃酸非常穩(wěn)定地結(jié)合，并如下設(shè)計和制備了融合蛋白3至6。
[0040]-融合蛋白3：rbp(1～193)+白蛋白[iiia{404～517(v)}+ib(131～218)]
[0041]-融合蛋白4：rbp(1～193)+白蛋白[iiia{404～517(v)}+ib(134～218)]
[0042]-融合蛋白5：白蛋白[信號肽(signal peptide)(1～18)+iiia{404～517(v)}+ib(131～218)]+rbp(17～192)
[0043]-融合蛋白6：白蛋白[信號肽(signal peptide)(1～18)+iiia{404～517(v)}+ib(134～218)]+rbp(17～192)
[0044]
接著，本發(fā)明人用制備的融合蛋白1或2處理活化的星狀細胞以測量作為星狀細胞活化標(biāo)志物的α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-sma)和i型膠原蛋白(collagen type i)的表達水平，從而比較并確認(rèn)了先前開發(fā)的融合蛋白(rbp-白蛋白iii和白蛋白iii-rbp)和星狀細胞的失活作用。結(jié)果證實，與先前開發(fā)的融合蛋白相比，本發(fā)明的融合蛋白1及2可以將α-sma和i型膠原蛋白(collagen i)的表達從低濃度降低至高水平(參見實施例1)。
[0045]
由此，本發(fā)明人確認(rèn)了當(dāng)白蛋白iii的526a.a和600a.a被小分子量氨基酸取代時，與視黃酸的結(jié)合力增加，可以更有效地誘導(dǎo)星狀細胞的失活。
[0046]
因此，本發(fā)明可將第526位和第600位氨基酸分別獨立地取代的白蛋白與rbp結(jié)合的融合蛋白用于纖維化疾病的，在上述融合蛋白中，可以定位為白蛋白iii的第526位氨基酸殘基的氨基酸可以是纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸，可以定位為第600位氨基酸殘基的氨基酸可以是丙氨酸、甘氨酸，并且上述融合蛋白可以由序列1或2的氨基酸序列組成或包含這些。
[0047]
接著，本發(fā)明人比較并確認(rèn)了融合蛋白1及2與融合蛋白3至6的α-sma和i型膠原蛋白(collagen i)表達抑制效果，其顯示出比現(xiàn)有融合蛋白更優(yōu)異的抑制星狀細胞活化過程的效果。結(jié)果證實，融合蛋白3至6即使在較低濃度下也能有效抑制星狀細胞的活化(實施例2)。
[0048]
同時，本發(fā)明人使用四氯化碳引起的肝纖維化動物模型，確認(rèn)了融合蛋白1及4與現(xiàn)有融合蛋白(rbp-白蛋白iii)之間的肝纖維化改善效果，結(jié)果證實，融合蛋白1及4可以在比rbp-白蛋白iii更低的濃度下更有效地改善纖維化(實施例3)。
[0049]
因此，本發(fā)明人可以提供一種用于預(yù)防或纖維化疾病的藥物組合物，其包含選自由開發(fā)的上述融合蛋白1至6組成的組中的一種以上融合蛋白，并且可以提供一種纖維化疾病的預(yù)防或方法，其包括向個體給予選自由融合蛋白1至6組成的組中的兩種以上融合蛋白。
[0050]
已確認(rèn)本發(fā)明的融合蛋白1至6可以以低于現(xiàn)有rbp與白蛋白的融合蛋白的濃度有效地誘導(dǎo)活化的星狀細胞的失活，本發(fā)明的藥物組合物有望成為一種通用的基礎(chǔ)技術(shù)，可以顯著降低蛋白質(zhì)劑對人體的給藥劑量和頻率。
[0051]
在本發(fā)明中，“纖維化疾病”是指由于正常組織被破壞并被纖維結(jié)締組織替代的纖維化(fibrosis)而使器官因纖維化而不能發(fā)揮功能的疾病，包括肝纖維化(liver fibrosis)、慢性肝炎(chronic hepatitis)、肝硬化(cirrhosis)、肝癌(hepatic cancer)、化療相關(guān)脂肪性肝炎(chemotherapy-associated steatohepatitis，cash)、肺纖維化(lung fibrosis)、腎纖維化(renal fibrosis)、腎衰竭(renal failure)、胰腺纖維化(pancreatic fibrosis)、慢性胰腺炎(chronic pancreatitis)及胰腺癌(pancreatic cancer)，只要是由器官的一部分硬化的纖維化引起的疾病，則不限于此。
[0052]
在本發(fā)明中，“個體”只要是哺乳動物就沒有限定，優(yōu)選地，可以為人或家畜。
[0053]
在本發(fā)明中，預(yù)防是指通過給藥本發(fā)明的藥物組合物來延緩纖維化疾病的發(fā)生或組織纖維化的任何行為，是指通過給藥本發(fā)明的藥物組合物來使纖維化疾病的癥狀好轉(zhuǎn)或有利地改變的任何行為。
[0054]
在本發(fā)明中，用于形成上述融合蛋白的白蛋白可以來自任何物種，但優(yōu)選來自與待給藥個體相同的物種(species)，以避免免疫原性的風(fēng)險。
[0055]
在本發(fā)明中，藥物組合物(pharmaceutical composition)除融合蛋白1至6外，還可以進一步包含一種以上已知的能夠預(yù)防或組織纖維化的物質(zhì)，還可包含通常用于制備藥物組合物的合適的載體、賦形劑和稀釋劑。
[0056]
在本發(fā)明中，“載體”也稱為運載體(vehicle)，是指促進蛋白質(zhì)或肽添加到細胞或組織中的化合物，例如，二甲基亞砜(dmso)是一種助于將許多有機物質(zhì)導(dǎo)入生物體的細胞或組織中的常用的載體。
[0057]
在本發(fā)明中，“稀釋劑(diluent)”定義為在水中稀釋的化合物，該化合物不僅可以穩(wěn)定目標(biāo)蛋白質(zhì)或肽的生物活性形式，而且可以溶解該蛋白質(zhì)或肽。溶解在緩沖溶液中的鹽在本領(lǐng)域用作稀釋劑。一種常用的緩沖溶液是磷酸鹽緩沖生理鹽水，因為它模擬了人體溶液的鹽態(tài)。因為緩沖鹽可以在低濃度下控制溶液的ph值，所以緩沖稀釋劑很少改變化合物的生物活性。如本文所用，含有壬二酸的化合物可以原樣或者與用于聯(lián)合的其他成分或合適的載體或賦形劑混合的藥物組合物施用于人類患者。
[0058]
并且，本發(fā)明的用于預(yù)防或纖維化疾病的藥物組合物分別按照常規(guī)方法配制成散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑、氣霧劑等外用劑和無菌注射液劑型，本發(fā)明的抗菌組合物可以根據(jù)需要的方法口服或腸胃外給藥(例如，靜脈內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)或局部給藥)，劑量根據(jù)患者的狀況和體重、疾病的嚴(yán)重程度、藥物劑型、給藥途徑及持續(xù)時間而變化，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)剡x擇，例如，可以以與藥學(xué)上可接受的載體混合的形式給藥約0.001mg至1000mg。本發(fā)明的抗菌組合物可以根據(jù)需要每天給藥一次至數(shù)次，可以單獨使用或與使用手術(shù)、激素療法、藥物療法及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的方法聯(lián)合使用。
[0059]
另一方面，本發(fā)明的重組融合蛋白的氨基末端可以與乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕櫚酰基、肉豆蔻基、硬脂基及聚乙二醇(peg)等保護基結(jié)合，肽的羧基末端可以用羥基(-oh)、氨基(-nh2)、疊氮基(-nhnh2)等修飾。
[0060]
并且，脂肪酸(fatty acids)、寡糖鏈(oligosaccharides chains)、所有納米顆粒(金顆粒、脂質(zhì)體、肝素、水凝膠等)、氨基酸、載體蛋白(carrier proteins)都可以與本發(fā)明的融合蛋白末端或氨基酸的r-殘基(r-group)結(jié)合。上述氨基酸的修飾用于改善本發(fā)明蛋白質(zhì)的效力(potency)和穩(wěn)定性。
[0061]
如本文所用，術(shù)語“穩(wěn)定性”不僅指體內(nèi)(in vivo)穩(wěn)定性，還指儲存穩(wěn)定性(包括在室溫、冷藏和冷凍儲存下的儲存穩(wěn)定性)。
[0062]
另一方面，本發(fā)明提供一種上述融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：
[0063]
步驟(1)，制備重組載體，上述重組載體包含用于編碼由序列3至8中任一氨基酸序列組成的融合蛋白的基因；
[0064]
步驟(2)，通過將上述重組載體導(dǎo)入宿主細胞來制備轉(zhuǎn)化體；
[0065]
步驟(3)，培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體；以及
[0066]
步驟(4)，從上述培養(yǎng)液中獲得融合蛋白。
[0067]
如本文所用，術(shù)語“基因”應(yīng)以其最廣泛的意義來考慮，并且旨在編碼結(jié)構(gòu)蛋白或調(diào)節(jié)蛋白，只要是編碼本發(fā)明的融合蛋白1至6的dna片段，則不做限定，具體可以包含序列9至14中任一堿基序列。
[0068]
并且，在本發(fā)明中，“載體(vector)”是指含有可操作地連接到能夠在合適宿主中表達dna的合適調(diào)節(jié)序列的dna序列的dna制備物。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆粒或僅僅是潛在的基因組插入物。一旦轉(zhuǎn)化到合適的宿主中，載體就可以獨立于宿主基因組進行復(fù)制和發(fā)揮作用，或者在某些情況下可以整合到基因組本身中。由于質(zhì)粒是目前最常用的載體形式，因此在本說明書中有時可以互換使用質(zhì)粒(plasmid)和載體(vector)。
[0069]
當(dāng)一個堿基序列與另一個堿基序列形成功能關(guān)系時，它是“可操作地鏈接”的。它可以是當(dāng)合適的分子(例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與(多個)調(diào)節(jié)序列結(jié)合時以使基因表達的方式連接的基因和(多個)調(diào)節(jié)序列。例如，如果針對前序列(pre-sequence)或分泌前導(dǎo)(leader)的dna作為參與多肽分泌的前蛋白表達，則它與針對多肽的dna可操作地連接；如果啟動子或增強子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子或增強子與編碼序列可操作地連接；或者，如果核糖體的結(jié)合部位影響序列的轉(zhuǎn)錄，則核糖體結(jié)合位點與編碼序列可操作地連接；或者當(dāng)定位以促進翻譯時，核糖體結(jié)合位點與編碼序列可操作地連接。一般而言，“可操作地連接”是指連接的dna序列是接觸的，并且在分泌前導(dǎo)的情況下，是指接觸的并且存在于閱讀框中。然而，增強子(enhancer)不需要接觸。這些序列的連接是通過在方便的限制酶位點處連接(ligation)來完成的。當(dāng)這樣的位點不存在時，使用根據(jù)常規(guī)方法合成的寡核苷酸接頭(oligonucleotide adaptor)或銜接物(linker)。
[0070]
并且，如本文所用，“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”是指將dna導(dǎo)入宿主，使得dna可以作為染體外因子復(fù)制或通過染體整合完成復(fù)制，在本發(fā)明中，用于制備融合蛋白使用的宿主細胞為cho細胞，但不限于此。
[0071]
發(fā)明的實施方式
[0072]
本發(fā)明可以有多種變形，并且可以具有多種實施例，以下，在附圖中例示特定實施例并在詳細說明中進行詳細說明。然而，這并不意在將本發(fā)明限制于特定實施方式，應(yīng)理解，包括本發(fā)明的精神和技術(shù)范圍內(nèi)所包含的所有修改、等同物和替代物。在描述本發(fā)明時，如果判斷為相關(guān)公知技術(shù)的詳細描述可能混淆本發(fā)明的主旨，則將省略其詳細描述。
[0073]
實驗方法
[0074]
1.肝星狀細胞(hepatic stellate cells，hscs)的分離及培養(yǎng)
[0075]
首先，用磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate-buffered saline，pbs)灌注14周齡雄性balb/c小鼠的肝臟，再用含有膠原酶(collagenase)、鏈霉蛋白酶(pronase)及dnase的格氏平衡鹽溶液(gey's balanced salt solution，gbss)灌注后，提取肝臟。去除附著在肝臟上的膽囊和結(jié)締組織，然后將肝細胞懸液置于與gbss相同的溶液中，并在37℃下處理12分鐘后，在13.4％密度梯度離心劑(nycodenz)梯度下以1400g離心20分鐘。取密度梯度離心劑(nycodenz)溶液與水層之間界面上的星狀細胞，并在補充有10％胎牛血清(fbs)的杜貝克改良鷹培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle's medium，dmem)(carlsbad，ca)中培養(yǎng)。星狀細胞的純度通過顯微鏡觀察和使用抗酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶抗體(anti-tyrosine aminotransferase antibody)的蛋白質(zhì)印跡(western blotting)來評價。當(dāng)細胞在培養(yǎng)皿
中匯合(confluent)時，將它們傳代培養(yǎng)并用作活化的星狀細胞。通過形態(tài)學(xué)變化和α-sma和i型膠原蛋白(collagen i)的表達增加確認(rèn)了肝星狀細胞的活化。
[0076]
2.融合蛋白的設(shè)計及制備
[0077]
2-1.融合蛋白的設(shè)計
[0078]
為了增強與視黃酸的結(jié)合力而設(shè)計的融合蛋白1至6的具體信息如下表1所示。小寫字母表示的氨基酸表示信號肽(signal peptide)的序列，白蛋白iii中取代的氨基酸用粗體字母和下劃線表示，下劃線表示的氨基酸表示rbp。
[0079]
表1
[0080][0081]
[0082]
[0083][0084]
2-2.融合蛋白的制備
[0085]
制備編碼為了制備融合蛋白而設(shè)計的融合蛋白1至6的多核苷酸，并將每個dna片段克隆到xbai/kpni cut pcdna3.1(+)載體中以制備重組表達載體。關(guān)于編碼每種融合蛋白的dna片段的具體信息總結(jié)在下表2中。使用脂質(zhì)體2000(invitrogen,carlsbad,ca)將每種載體導(dǎo)入cho細胞中，以制備表達融合蛋白的轉(zhuǎn)化體。通過培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體表達和分泌的融合蛋白通過親和層析(affinity chromatography)和hplc法進行純化和使用。
[0086]
表2
[0087][0088]
3.實時熒光定量pcr(quantitative real-time pcr)
[0089]
使用trizol(ambion，austin，tx，usa)準(zhǔn)備總rna并制備cdna。使用abi quantstudio tm 3實時熒光定量pcr系統(tǒng)(abi quantstudio tm 3real-time pcr system)進行qrt-pcr。為了控制反應(yīng)的變化，將pcr產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)化為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase，gapdh)的mrna水平。
[0090]
4.肝纖維化動物模型的制備
[0091]
將按1：1的比例溶解在礦物油中的ccl4以1ml/kg的濃度注射到balb/c小鼠腹腔內(nèi)6周，每周3次，以制備肝損傷誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型。對照組僅給藥相同量的礦物油。在
最后一次注射ccl4后48小時處死小鼠。
[0092]
為了評價處死小鼠的纖維化，取出肝臟，將各實驗組的肝臟組織固定在10％緩沖福爾馬林中并包埋在石蠟中，制備組織切片。為了進行組織學(xué)分析，組織切片用天狼星紅(sirius red)染，然后用光學(xué)顯微鏡觀察。
[0093]
5.統(tǒng)計分析
[0094]
結(jié)果表示為平均值
±
標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)。使用t檢驗(t-tests)進行統(tǒng)計分析。為了比較，在p《0.05時檢驗了顯著性，并對p值進行了雙邊檢驗。
[0095]
實驗結(jié)果
[0096]
實施例1.融合蛋白1及2與現(xiàn)有白蛋白-rbp融合蛋白的效果比較
[0097]
將在前期研究中對星狀細胞的活化抑制或失活表現(xiàn)出優(yōu)異效果的rbp-白蛋白iii及白蛋白iii-rbp與實施例2中設(shè)計的融合蛋白1及2進行比較。具體地，用0.25μm的每種融合蛋白處理活化的小鼠肝星狀細胞20小時，并使用實時pcr(real-time pcr)測量α-sma和i型膠原蛋白(collagen i)的表達水平。現(xiàn)有融合蛋白(rbp-白蛋白iii及白蛋白iii-rbp)是kr 10-1395394中的r-iii和iii-r融合蛋白。
[0098]
結(jié)果，如圖2所示，確認(rèn)了融合蛋白1及2比現(xiàn)有融合蛋白更能降低α-sma和i型膠原蛋白(collagen i)的mrna表達。
[0099]
實施例2.融合蛋白1至6的效果比較
[0100]
將在活化的星狀細胞的失活效果中確認(rèn)了優(yōu)于現(xiàn)有融合蛋白的效果的融合蛋白1及2與融合蛋白3至6的效果進行比較并確認(rèn)。除了處理活化的星狀細胞的融合蛋白的量設(shè)定為0.125μm之外，以與實施例1相同方法進行。
[0101]
結(jié)果，如圖3所示，確認(rèn)了融合蛋白3至6即使在蛋白質(zhì)的量少的情況下也能夠?qū)ⅵ?sma和i型膠原蛋白(collagen i)的表達降低到非常高的水平。
[0102]
實施例3.融合蛋白1及4與現(xiàn)有白蛋白-rbp融合蛋白在體內(nèi)(in vivo)的效果比較
[0103]
使用通過注射四氯化碳(ccl4)誘導(dǎo)的肝纖維化模型對融合蛋白的效果進行了比較并評價。具體地，將按1：1的比例溶解在礦物油中的四氯化碳以1ml/kg的濃度注射到balb/c小鼠腹腔內(nèi)6周，每周3次，并在最后一次注射ccl4后靜脈內(nèi)給藥上述融合蛋白(25μg、12.5μg、6.25μg或3μg)或生理鹽水2周，每周3次(n＝5只)。
[0104]
用光學(xué)顯微鏡觀察組織的結(jié)果，僅給藥礦物油的對照組的小鼠(control)表現(xiàn)出正常的肝臟結(jié)構(gòu)，而用ccl4處理的小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的肝組織結(jié)構(gòu)損傷和纖維化。并且，可以確認(rèn)白蛋白與rbp的融合蛋白的給藥改善纖維化(圖4a)。
[0105]
使用imagej軟件(nih)對天狼猩紅(siruis red)染進行定量分析的結(jié)果，改善纖維化的效果因試樣而異(圖4b)。現(xiàn)有融合蛋白rbp-白蛋白iii僅在25μg給藥組中顯示出顯著改善效果，而融合蛋白4在6.25μg給藥組中也顯示出優(yōu)異的效果。從上述結(jié)果可以確認(rèn)，融合蛋白1及4與現(xiàn)有融合蛋白相比，在低濃度下表現(xiàn)出優(yōu)異的效果。
[0106]
以上對本發(fā)明內(nèi)容的特定部分進行了詳細描述，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來而言，該具體描述僅為優(yōu)先實施方式且本發(fā)明的范圍并不限于此是顯而易見的。因此，本發(fā)明的實質(zhì)范圍將由所附發(fā)明要求保護范圍及其等同物來定義。
[0107]
產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0108]
本發(fā)明有望成為一種通用的基礎(chǔ)技術(shù)，通過用作預(yù)防及纖維化疾病的藥物，
可以顯著降低蛋白質(zhì)劑對人體的給藥劑量和給藥頻率。
技術(shù)特征：
1.一種融合蛋白，其特征在于，由序列1或2的氨基酸序列組成。2.一種融合蛋白，其特征在于，由序列3至8中任一氨基酸序列組成。3.一種多核苷酸，編碼權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，上述多核苷酸由序列9至14中任一堿基序列組成。4.一種重組載體，其特征在于，包含權(quán)利要求3所述的多核苷酸。5.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，包含權(quán)利要求4所述的重組載體。6.一種融合蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括：步驟(1)，制備重組載體，上述重組載體包含用于編碼由序列3至8中任一氨基酸序列組成的融合蛋白的基因；步驟(2)，通過將上述重組載體導(dǎo)入宿主細胞來制備轉(zhuǎn)化體；步驟(3)，培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體；以及步驟(4)，從上述培養(yǎng)液中獲得融合蛋白。7.一種用于預(yù)防或纖維化疾病的藥物組合物，其特征在于，包含由序列1至8中任一氨基酸序列組成的融合蛋白。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于預(yù)防或纖維化疾病的藥物組合物，其特征在于，上述纖維化疾病為選自由肝纖維化、慢性肝炎、肝硬化、肝癌、化療相關(guān)脂肪性肝炎、肺纖維化、腎纖維化、腎衰竭、胰腺纖維化、慢性胰腺炎及胰腺癌組成的組中的一種以上疾病。9.一種纖維化疾病的預(yù)防或方法，其特征在于，包括向個體給予由序列1至8中任一氨基酸序列組成的融合蛋白的步驟。10.一種由序列1至8中任一氨基酸序列組成的融合蛋白在制備用于預(yù)防或纖維化疾病的藥物中的用途。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種可用于預(yù)防或發(fā)生在肝臟、胰腺、肺等中的纖維化疾病的白蛋白與視黃醇結(jié)合蛋白的融合蛋白，本發(fā)明的融合蛋白可通過抑制引起組織纖維化的星狀細胞的活化或者誘導(dǎo)星狀細胞的失活來預(yù)防或纖維化疾病，與用于相同目的的現(xiàn)有融合蛋白相比，在低濃度下表現(xiàn)出更優(yōu)異的效果，因此，本發(fā)明的融合蛋白有望成為一種通用的基礎(chǔ)技術(shù)，可以顯著降低蛋白質(zhì)劑對人體的給藥劑量和頻率。降低蛋白質(zhì)劑對人體的給藥劑量和頻率。降低蛋白質(zhì)劑對人體的給藥劑量和頻率。
