ZF683作為免疫抑制靶點在誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受調(diào)控中的應(yīng)用
znf683作為免疫抑制靶點在誘導(dǎo)t細(xì)胞免疫耐受調(diào)控中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明涉及基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及znf683作為靶標(biāo)在t細(xì)胞免疫耐受調(diào)控相關(guān)疾病的診斷或預(yù)后監(jiān)測，以及方面的用途。
背景技術(shù)：
2.異基因造血干細(xì)胞移植(allogenic hematopoietic stem cell transplantation，allo-hsct)是治愈多種血液疾病的手段，例如侵襲性惡性血液腫瘤、骨髓異常增生癥等。一方面，allo-hsct后重塑的免疫系統(tǒng)發(fā)揮移植物抗白血病(graft-versus-leukemia effects,gvl)、預(yù)防機會性細(xì)菌、病毒感染等作用，為受者提供強大的免疫保護(hù)。另一方面，allo-hsct后由于同種異體反應(yīng)性t細(xì)胞的存在可能引發(fā)急、慢性移植物抗宿主病的發(fā)生。國內(nèi)外研究顯示：30％-60％患者異基因造血干細(xì)胞移植后發(fā)生ii-iv級急性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，gvhd)，14％患有嚴(yán)重(iii-iv級)急性移植物抗宿主病，慢性gvhd發(fā)生率高達(dá)80％(malard f,huang x j,sim j p y.treatment and unmet needs in steroid-refractory acute graft-versus-host disease[j].leukemia,2020,(5):1229-40。blazar b r,murphy w j,abedi m.advances in graft-versus-host disease biology and therapy[j].nat rev immunol,2012,12(6):443-58。ferrara j l,levine j e,reddy p,et al.graft-versus-host disease[j].lancet,2009,373(9674):1550-61)。
[0003]
gvhd指由異基因供者細(xì)胞與受者組織發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致的臨床綜合征，其生理過程主要是供者t細(xì)胞和炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)導(dǎo)致受者體內(nèi)多器官組織損傷。而防治gvhd的關(guān)鍵是誘導(dǎo)allo-hsct后t細(xì)胞的耐受。因此，探索異基因造血干細(xì)胞移植后誘導(dǎo)t細(xì)胞免疫耐受的關(guān)鍵調(diào)控分子，從而及時診斷和監(jiān)測gvhd并進(jìn)行適當(dāng)?shù)模酥猎趃vhd發(fā)病前即可評估其患者風(fēng)險來實現(xiàn)“預(yù)警預(yù)測”，是改善gvhd診療策略的關(guān)鍵科學(xué)問題。
[0004]
在單倍型相合造血干細(xì)胞移植(haploidentical stem cell transplantation，haplo-hsct)中，由于hla不完全相合導(dǎo)致供體和宿主細(xì)胞的同種異體反應(yīng)更為強烈，受者更可能發(fā)生gvhd、嚴(yán)重影響患者預(yù)后和生存質(zhì)量。因此迫切需要探索單倍型相合造血干細(xì)胞移植后誘導(dǎo)免疫耐受從而減輕gvhd的關(guān)鍵調(diào)控分子。
[0005]
znf683，又稱鋅指蛋白683，是一種轉(zhuǎn)錄因子，它介導(dǎo)了組織中多種t淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄程序，包括組織中的記憶t細(xì)胞，nk細(xì)胞和nkt細(xì)胞。在胸腺和周圍t細(xì)胞、nkt細(xì)胞的分化中也起著重要作用。本發(fā)明的研究團(tuán)隊前期研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)；在單倍型相合造血干細(xì)胞移植后形成免疫耐受的受者中，cd8效應(yīng)t細(xì)胞(cd8 effector t,cd8 teff)顯著擴(kuò)增，并且高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子znf683。目前在人的原代t細(xì)胞中，對于znf683的研究局限于其表達(dá)水平的探究。既往研究表明znf683多表達(dá)于循環(huán)效應(yīng)t細(xì)胞中，然而znf683對人原代t細(xì)胞的調(diào)控作用以及調(diào)控的具體分子機制尚未見報道。
[0006]
因此，針對以上不足，本發(fā)明研究了znf683在人原代t細(xì)胞中的調(diào)控作用，并通過
10等細(xì)胞因子的分泌水平降低,細(xì)胞毒性分子cd107a的表達(dá)下降；rna-seq結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)znf683的cd8+t細(xì)胞中對維持端粒穩(wěn)定性、保護(hù)和延伸至關(guān)重要的rtel基因上調(diào)；t細(xì)胞活化相關(guān)wnt信號通路在過表達(dá)znf683的cd8+t細(xì)胞中下調(diào)。
[0028]
第三，研究還發(fā)現(xiàn)t細(xì)胞在活化過程中會下調(diào)znf683的表達(dá)水平。可見，znf683是維持效應(yīng)t細(xì)胞處于相對靜止且長壽命狀態(tài)的免疫檢查點基因，t細(xì)胞通過上調(diào)znf683表達(dá)水平進(jìn)入靜息態(tài)，下調(diào)znf683水平進(jìn)入活化狀態(tài)。znf683基因的高表達(dá)可以誘導(dǎo)人t細(xì)胞進(jìn)入免疫耐受狀態(tài)，znf683可作為預(yù)測以及靶向急、慢性gvhd的關(guān)鍵分子。
附圖說明
[0029]
圖1：znf683在單倍型移植受者的cd8+t細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)；a：rna-seq和atac-seq數(shù)據(jù)的綜合分析。顯示了來自haplo-sct受體與其配對供體相比，cd8 t細(xì)胞中的差異基因。
[0030]
圖2：驗證體外原代t細(xì)胞過表達(dá)znf683。a-b:通過慢病毒感染在健康人的cd3+t細(xì)胞中過表達(dá)znf683，感染48h后a：qpcr檢測znf683的過表達(dá)效率。b：慢病毒感染效率在空白對照(non-infection)、空載對照(control)和znf683過表達(dá)組(znf683-oe)的流式典型圖。
[0031]
圖3：過表達(dá)znf683對原代t細(xì)胞增殖的影響。a-e:通過慢病毒感染在健康人的cd3+t細(xì)胞中過表達(dá)znf683，感染48h后。a-c：流式檢測細(xì)胞周期的變化。d-e；感染48h后,用celltracetm violet細(xì)胞示蹤劑標(biāo)記3天，測對照組t細(xì)胞以及過表達(dá)znf683的t細(xì)胞增殖。
[0032]
圖4：原代t細(xì)胞過表達(dá)znf683對凋亡的影響。a-b：通過慢病毒感染在健康人的cd3+t細(xì)胞中過表達(dá)znf683，感染48h后，用annexin v與7-aad共染共染檢測t細(xì)胞凋亡。a：典型流式圖。b：統(tǒng)計圖。
[0033]
圖5：原代t細(xì)胞過表達(dá)znf683對細(xì)胞因子分泌的影響。a-e:通過慢病毒感染在健康人的cd3+t細(xì)胞中過表達(dá)znf683，感染48h后,流式分選過表達(dá)znf683t細(xì)胞，體外刺激3d后，流式檢測過表達(dá)znf683 gfp+細(xì)胞(a)、cd4+t細(xì)胞(b)、cd8+t細(xì)胞(c)分泌il-4、il-10、ifn-γ、il-2、cd107a的水平。d-e；統(tǒng)計圖。
[0034]
圖6：高表達(dá)znf683的原代cd8+t細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜變化
[0035]
a:熱圖展示高表達(dá)znf683的原代cd8+t細(xì)胞與對照組cd8+t細(xì)胞表達(dá)的差異基因。b：go富集分析高表達(dá)znf683的原代cd8+t細(xì)胞與對照組cd8+t細(xì)胞的差異基因。c：分選單倍型造血干細(xì)胞移植1年以上患者的cd8+t細(xì)胞，體外cd3/28beads刺激3天后，qpcr檢測znf683的表達(dá)水平。
具體實施方式
[0036]
為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0037]
實施例1樣本來源與細(xì)胞培養(yǎng)
[0038]
1.病例資料：選取北京大學(xué)人民醫(yī)院血液病研究所接受單倍型相合以及同胞相合造血干細(xì)胞移植的患者及健康供者共8對；年齡周歲≦60周歲；造血干細(xì)胞移植后呈嵌合狀態(tài)；停用免疫抑制劑；收集標(biāo)本時，患者無慢性gvhd、無復(fù)發(fā)，無植入不良，無嚴(yán)重感染等移
植相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生。
[0039]
2.t細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：通過ficoll密度梯度離心法從健康供體的骨髓中分離出人骨髓單核細(xì)胞(bmmcs)。使用cd3microbeads((miltenyibiotec,130-097-043)從bmmcs中純化cd3+t細(xì)胞，并將cd3+t細(xì)胞重懸在imdm(gibco,invitrogen)+10％9500bit(stemcell technologies,09500)(血清替代物，排除血清中可能含有的tgf-β對t細(xì)胞造成的影響)+il-2(100u/ml)培養(yǎng)基中。
[0040]
實施例2慢病毒過表達(dá)znf683的表達(dá)水平
[0041]
znf683過表達(dá)的慢病毒載體購自sangon biotech(中國上海)。cd3+t細(xì)胞重懸于imdm+10％9500bit+il-2(100u/ml)培養(yǎng)基中，鋪于24孔板，2
×
105細(xì)胞/孔，加入cd3/28beads(invitrogen,11131d)刺激，24h后將每孔培養(yǎng)體系濃縮至一半，根據(jù)病毒滴度加入相應(yīng)體積的病毒，使得moi達(dá)到30，并加入polybrene(sigma,usa)至終濃度為6μg/ml；培養(yǎng)24h后換液。加入病毒48h后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測感染效率，并分析過表達(dá)znf683后，t細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞因子分泌的變化。
[0042]
znf683在形成免疫耐受的單倍型移植受者的cd8 t細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。選取了8對在已停用免疫抑制藥物的情況下，生存期大于1年的單倍型造血干細(xì)胞移植術(shù)后患者和其相應(yīng)供者外周血標(biāo)本，并且收取標(biāo)本時無感染無復(fù)發(fā)等事件發(fā)生。我們分選了供受者外周血來源的cd3
+
cd4
+
和cd3
+
cd8
+
t細(xì)胞亞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組水平測序(rna-seq)以及atac-seq(assay for transposase-accessible chromatin with high throughput sequencing)。我們的結(jié)果表明在單倍型移植受者中，znf683不僅在cd8
+
t細(xì)胞中有更加開放的染質(zhì)可及性，并且znf683在cd8
+
t細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平表達(dá)明顯上調(diào)(圖1，表示了rna-seq和atac-seq數(shù)據(jù)的綜合分析，顯示了來自haplo-sct受體與其配對供體相比，cd8 t細(xì)胞中的差異基因。)
[0043]
驗證體外原代t細(xì)胞過表達(dá)znf683。在體外通過慢病毒感染在人原代t細(xì)胞中過表達(dá)znf683，通過qpcr驗證了感染后znf683的過表達(dá)水平(圖2a)。定量pcr結(jié)果顯示，znf683表達(dá)水平在znf683過表達(dá)組(znf683-oe)顯著高于對照組(ct)，通過流式檢測熒光標(biāo)記的慢病毒載體感染效率(圖2b)。
[0044]
實施例3.t細(xì)胞細(xì)胞周期檢測
[0045]
在室溫下重懸細(xì)胞于pbs中使用流式抗體避光孵育20分鐘進(jìn)行表面cd4-percp-cy5.5(biolegend，357414)，cd8-apc-r700(bd horizon，565165)染。使用固定/穿孔試劑盒(bd pharmingen,562574)對t細(xì)胞進(jìn)行固定30分鐘后加入抗體ki-67-apc(biolegend，350514)染，并在室溫下孵育20分鐘。pbs洗滌并上機檢測。上機檢測前加入dapi。單克隆抗體購于bd、biolengend公司。
[0046]
znf683抑制t細(xì)胞的增殖。znf683可能是單倍型相合造血干細(xì)胞移植后誘導(dǎo)或者維持cd8t+細(xì)胞免疫耐受的關(guān)鍵分子。真核細(xì)胞周期由四個不同的階段組成:g1期、s期、g2期和m期。一方面，t細(xì)胞增殖對于產(chǎn)生有效的適應(yīng)性免疫反應(yīng)至關(guān)重要，增殖的一個關(guān)鍵因素是細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期；另一方面，真核生物中的非增殖(非分裂)細(xì)胞通常從g1進(jìn)入靜止g0狀態(tài)來長時間保持靜止。我們?yōu)榱颂骄縵nf683對t細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，使用ki67/dapi染后進(jìn)行流式檢測，將細(xì)胞周期分為g0，g1和s/g2/m期，結(jié)果顯示與空載病毒對照感染的t細(xì)胞相比，高表達(dá)znf683的原代t細(xì)胞處于g0期的細(xì)胞比例明顯增多(圖3a、圖3c)；與對照
組的t細(xì)胞相比，znf683過表達(dá)的t細(xì)胞ki-67的表達(dá)有下降(圖3a、圖3b)。使用celltrace
tm violet標(biāo)記高表達(dá)znf683的原代t細(xì)胞與對照組原代t細(xì)胞，結(jié)果顯示與對照組的t細(xì)胞相比，過表達(dá)znf683的t細(xì)胞增殖明顯下降(圖3d、3e)。
[0047]
實施例4.t細(xì)胞凋亡檢測
[0048]
在室溫下重懸細(xì)胞于pbs中使用流式抗體避光孵育20分鐘進(jìn)行表面cd4-af700(biolegend，357418)，cd8-v500(bd horizon，560774)并在室溫下孵育20分鐘,孵育完抗體后將細(xì)胞重懸于100μl 1
×
binding buffer，加入凋亡試劑盒annexinv-apc和7-aad-percp(bd pharmingen，550475)標(biāo)記并室溫避光孵育15min，pbs洗滌并1h內(nèi)上機檢測。單克隆抗體購于bd、biolengend公司。
[0049]
znf683抑制t細(xì)胞的凋亡
[0050]
t細(xì)胞的凋亡對t細(xì)胞形成免疫耐受來說至關(guān)重要。一方面，自身反應(yīng)性tcr的胸腺細(xì)胞在發(fā)育過程通過細(xì)胞凋亡途徑得以消除，免疫反應(yīng)過程中擴(kuò)增的效應(yīng)t細(xì)胞也會發(fā)生凋亡(activation induced cell death,acid)。另一方面，細(xì)胞長壽是和tnaive以及記憶t細(xì)胞持續(xù)存在外周穩(wěn)態(tài)擴(kuò)增的基礎(chǔ)。為了探究znf683對t細(xì)胞凋亡的影響，我們通過流式分選過表達(dá)znf683的t細(xì)胞，用annexin v與7-aad共染評估znf683對t細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示高表znf683的t細(xì)胞早凋與晚凋比例較對照組下降(圖4a、圖4b)，這些結(jié)果表明znf683與t細(xì)胞的長壽命狀態(tài)相關(guān)。
[0051]
實施例5細(xì)胞分泌因子和細(xì)胞毒分子的表達(dá)檢測
[0052]
收集細(xì)胞前4h使用golgiplug(bd pharmingen,555029)在室溫下重懸細(xì)胞于pbs中使用流式抗體避光孵育20分鐘進(jìn)行表面cd4-percp-cy5.5(biolegend，357414)，cd8-apc-r700(bd horizon，565165)染。使用固定/穿孔試劑盒(bd pharmingen,562574)對t細(xì)胞進(jìn)行固定30分鐘后加入抗體ifn-γ-bv510(biolegend，502528)、cd107a-pe(bd pharmingen，555801)收集細(xì)胞前4h加入；il-4-apc(biolegend，500714)、il-10-pe-cy7(biolegend，501420)、il-2-v450(biolegend，560867)染，并在室溫下孵育20分鐘。pbs洗滌并上機檢測。單克隆抗體購于bd、biolengend公司。
[0053]
實施例6.celltracetm violet細(xì)胞增殖實驗
[0054]
重懸細(xì)胞于預(yù)溫的pbs，細(xì)胞濃度1
×
106/ml，每1ml細(xì)胞中加入1ul celltracetm violet(thermofisher,c34557)貯存液，終濃度為10um，37℃孵育30min，并加入5倍體積的完全培養(yǎng)基，終止染。培養(yǎng)3天后405nm激發(fā)光檢測。
[0055]
實施例7.定量qpcr檢測znf683mrna的表達(dá)情況
[0056]
根據(jù)rneasy mini試劑盒(qiagen,74106)的實驗方法提取來自健康供者純化的t細(xì)胞的rna。使用cdna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(takara，rr047a)進(jìn)行cdna的合成。利用sybr green染料法檢測細(xì)胞中目的基因的表達(dá)情況。以18s作為內(nèi)參，使用δδct方法計算目的基因mrna的相對表達(dá)。引物序列如下：znf683上游引物：5'-catatgtggcaagagctttgg-3'；znf683下游引物：5'-ggcaagttgagtgaagctct-3'，18s上游引物：5'-accgattggatggtttagtgag-3'；和18s下游引物：5'-cctacggaaaccttgttacgac-3'。
[0057]
實施例8.rna-seq實驗
[0058]
使用rneasy micro kit(qiagen,74004)提取rna，并通過nebnextoligo d(t)25珠子(neb,e7490)純化mrna；使用nebnext ultra ii rnalibrary prep kit(neb,e7770s)用
于構(gòu)建cdna文庫；使用ampure xp珠子(beckman coulter，a63881)用于純化300bp到500bp之間的cdna文庫。cdna雙末端測序在novaseq6000(illumina)上進(jìn)行，每個樣本產(chǎn)生28到3500萬個150bp雙末端讀數(shù)。
[0059]
統(tǒng)計學(xué)分析：spss 20.0用于統(tǒng)計分析，使用配對t檢驗評估znf683-0e、ct組凋亡、細(xì)胞因子分泌、增殖在組間的差異。p＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)差異。
[0060]
實施例9 znf683降低t細(xì)胞因子分泌水平
[0061]
il-2主要作為重要的t細(xì)胞生長因子,不僅是重要的免疫刺激劑，也對調(diào)節(jié)t細(xì)胞的免疫反應(yīng)和維持其外周耐受發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為了探究znf683對t細(xì)胞分泌il-2的影響，流式分選過表達(dá)znf683的t細(xì)胞，體外cd3/28beads刺激培養(yǎng)三天后，流式評估測定過表達(dá)znf683的t細(xì)胞的因子分泌水平。我們的結(jié)果顯示相較于對照組的t細(xì)胞，高表達(dá)znf683的gfp+細(xì)胞，以及cd4+t,cd8+t細(xì)胞中il-2分泌降低的趨勢明顯(圖5a、圖5c、圖5d)，在cd3+，cd8+t細(xì)胞中il-2分泌降低趨勢具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5e)。我們的結(jié)果還顯示，相較于對照組t細(xì)胞，高表達(dá)znf683的gfp+細(xì)胞、cd4+t、cd8+t細(xì)胞中il-4,il-10分泌都有降低的趨勢(圖5a、圖5b)，其中il-4在總t細(xì)胞中降低趨勢有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5d)，并且il-10在高表達(dá)znf683的cd4+t細(xì)胞中降低趨勢有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5d)。cd107a是nk和活化的cd8+t細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志物，ifn-γ的間接作用通常會增強cd8+t細(xì)胞活性。對于這兩種細(xì)胞因子的分泌情況，我們的結(jié)果顯示，相較于對照組t細(xì)胞，高表達(dá)znf683組的gfp+細(xì)胞，cd4+t,cd8+t細(xì)胞中inf-γ,cd107a表達(dá)水平降低，inf-γ表達(dá)水平降低，其中在高表達(dá)znf683的gfp+細(xì)胞，高表達(dá)znf683的cd4+t細(xì)胞中inf-γ表達(dá)降低的水平有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5d)，并且cd107a表達(dá)水平降低在高表達(dá)znf683的gfp+細(xì)胞、cd8+t中有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5e)。
[0062]
圖5原代t細(xì)胞過表達(dá)znf683對細(xì)胞因子分泌的影響
[0063]
a-e:通過慢病毒感染在健康人的cd3+t細(xì)胞中過表達(dá)znf683，感染48h后,流式分選過表達(dá)znf683t細(xì)胞，體外刺激3d后，流式檢測過表達(dá)znf683 gfp+細(xì)胞(a)、cd4+t細(xì)胞(b)、cd8+t細(xì)胞(c)分泌il-4、il-10、ifn-γ、il-2、cd107a的水平。d-e；統(tǒng)計圖。
[0064]
實施例10.過表達(dá)znf683的cd8+t細(xì)胞活化端粒維持相關(guān)信號通路
[0065]
在明確了znf683的表達(dá)對誘導(dǎo)t細(xì)胞處于靜止且長壽命的調(diào)控作用后，我們?yōu)榱颂骄縵nf683調(diào)控t細(xì)胞的具體分子機制，我們對高表達(dá)znf683的cd8+t細(xì)胞與對照組cd8+t進(jìn)行rna-seq。我們的結(jié)果顯示znf683表達(dá)在高表達(dá)znf683組中上調(diào)，與對照組cd8+t細(xì)胞相比，維持端粒穩(wěn)定性、保護(hù)和伸長至關(guān)重要的rtel1在高表達(dá)znf683的cd8+t細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(圖6a)，參與端粒維持過程的t環(huán)形成相關(guān)基因和端粒環(huán)解體相關(guān)基因在過表達(dá)znf683的cd8+t細(xì)胞中富集(圖6b)。此外，與對照cd8+t細(xì)胞相比，wnt信號通路相關(guān)基因，如porcn，在過表達(dá)znf683的cd8 t細(xì)胞中下調(diào)(圖6a-b)。最有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)分選單倍型造血干細(xì)胞移植1年以上患者的cd8+t細(xì)胞，體外cd3/28beads刺激后，znf683的表達(dá)水平降低。這些結(jié)果表明：znf683的高表達(dá)使cd8+t細(xì)胞處于失活的狀態(tài)；與此同時znf683維持cd8+t細(xì)胞中端粒的復(fù)制能力并抑制cd8+t細(xì)胞的凋亡，可能是抑制cd8+t細(xì)胞衰老的重要調(diào)控基因。此外，當(dāng)cd8+t細(xì)胞在體外被活化的過程中，znf683的表達(dá)會下調(diào)，說明znf683可能是維持cd8+t細(xì)胞處于靜息態(tài)的免疫檢查點。
[0066]
實施例11gvhd模型小鼠的
[0067]
將balb/c小鼠(h-2d)進(jìn)行全身8gy致死劑量照射清髓后，形成放射性造血損傷模
型。回輸c57bl/6小鼠來源的去除t細(xì)胞的骨髓細(xì)胞(tcelldepletion-bm)混合脾臟來源t細(xì)胞(spleent)。
[0068]
對照組(20只)通過尾靜脈注射5
×
106tcd-bm+3
×
106spleent；
[0069]
組(20只)通過尾靜脈注射5
×
106tcd-bm+3
×
106spleent-znf683-oe，即利用慢病毒在脾臟來源t細(xì)胞中過表達(dá)znf683基因。
[0070]
觀察并記錄兩實驗組在接受異源hsc移植后的存活時間。
[0071]
試驗結(jié)果表明，對照組的造血損傷小鼠體內(nèi)注射入異源造血干細(xì)胞后，所有小鼠均產(chǎn)生嚴(yán)重的gvhd，表現(xiàn)為超過三分之一以上的體重?fù)p失以及因為嚴(yán)重gvhd而死亡。對照組的存活率在8天內(nèi)下降到了50％，并且所有小鼠在14天內(nèi)皆因嚴(yán)重gvhd死亡。
[0072]
而組中的老鼠由于接受了過表達(dá)znf683慢病毒載體，gvhd癥狀顯著減輕，其存活率在8天內(nèi)提高到了80％，并且在14天有超過50％以上的小鼠存活。
[0073]
該實施例驗證了過表達(dá)znf683能夠或預(yù)防移植物抗宿主病gvhd，從而進(jìn)而提高gvhd模型小鼠的存活率。
[0074]
綜上所述，體外實驗結(jié)果表明，znf683高表達(dá)抑制t細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒功能，并且抑制t細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步結(jié)合組學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在高表達(dá)znf683的cd8 t細(xì)胞中，參與維持端粒穩(wěn)定性、保護(hù)和延伸至關(guān)重要的rtel基因表達(dá)上調(diào)，即znf683與體內(nèi)hcmv感染后的特異性t細(xì)胞、過繼性免疫細(xì)胞后的t細(xì)胞持續(xù)存在相關(guān)；同時實驗發(fā)現(xiàn)znf683的高表達(dá)下調(diào)了t細(xì)胞活化wnt信號通路相關(guān)基因。結(jié)合這些體外實驗證明了znf683使t細(xì)胞處于靜止并且長壽命的狀態(tài)。另外，還發(fā)現(xiàn)haplo-sct受者cd8
+
t細(xì)胞和健康供者的cd8
+
t細(xì)胞在體外受到刺激時，znf683表達(dá)均有所降低。這些結(jié)果均表明znf683是cd8效應(yīng)t細(xì)胞處于長壽命、靜止?fàn)顟B(tài)的免疫檢查點。
[0075]
因此，形成免疫耐受的haplo-sct受者中cd8
+
t細(xì)胞高表達(dá)znf683表明:znf683是維持haplo-sct受者免疫耐受的關(guān)鍵調(diào)控分子。綜上所述，本發(fā)明為臨床單倍型相合造血干細(xì)胞移植后免疫耐受的監(jiān)測、預(yù)測以及靶向急、慢性gvhd的潛在關(guān)鍵分子。
[0076]
最后應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的精神和范圍。
技術(shù)特征：
1.znf683在制備用于t細(xì)胞免疫耐受調(diào)控相關(guān)疾病的診斷或預(yù)后監(jiān)測的試劑或試劑盒中的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述t細(xì)胞免疫耐受調(diào)控相關(guān)疾病為異基因造血干細(xì)胞移植引起的疾病，優(yōu)選為急性或慢性移植物抗宿主病(gvhd)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述試劑為檢測znf683表達(dá)量的試劑，所述試劑盒中含有檢測znf683表達(dá)量的試劑。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述檢測znf683表達(dá)量的試劑包括檢測mrna表達(dá)量和/或蛋白表達(dá)量的試劑。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述檢測mrna表達(dá)量的試劑包括以下方法中使用到的試劑：基于pcr的檢測方法、southern雜交方法、northern雜交方法、點雜交方法、熒光原位雜交方法、dna微陣列方法、aso法、高通量測序平臺方法。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述檢測znf683的mrna表達(dá)量的試劑包括特異性引物和/或探針，優(yōu)選的，所述znf683上游引物：5'-catatgtggcaagagctttgg-3'；znf683下游引物：5'-ggcaagttgagtgaagctct-3'。7.znf683在制備用于或預(yù)防t細(xì)胞免疫耐受調(diào)控相關(guān)疾病的藥物中的用途。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述t細(xì)胞免疫耐受調(diào)控相關(guān)疾病為異基因造血干細(xì)胞移植引起的疾病，優(yōu)選為急性或慢性移植物抗宿主病。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的用途，其特征在于，所述藥物為用于增加患者體內(nèi)znf683基因或蛋白的量的試劑。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述試劑為znf683的激動劑、過表達(dá)znf683的慢病毒載體或者znf683的功能域的模擬肽。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及ZF683作為靶標(biāo)在T細(xì)胞免疫耐受調(diào)控相關(guān)疾病的診斷或預(yù)后監(jiān)測，以及方面的用途。特別的，本發(fā)明研究了ZF683對人原代T細(xì)胞的調(diào)控作用，檢驗了ZF683作為臨床移植后預(yù)后及GVHD靶點的可行性。床移植后預(yù)后及GVHD靶點的可行性。床移植后預(yù)后及GVHD靶點的可行性。
