一種生物肩袖補片及其制備方法與流程
1.本技術(shù)涉及生物材料制備技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種生物肩袖補片及其制備方法。
背景技術(shù)：
2.肩袖損傷是骨外科最常見肌腱損傷之一，是導(dǎo)致肩關(guān)節(jié)疼痛、活動度降低、功能減弱的常見原因。據(jù)統(tǒng)計，在60歲以上的人中，肩袖全層損傷的發(fā)病率較高，到達了28%以上。
3.肩袖修補術(shù)后，肌腱與骨交界面處（腱-骨界面）不易愈合是目前醫(yī)學上面臨重點問題之一。許多相關(guān)學者對上述問題進行了深入研究，并提出了在施行肩袖修補手術(shù)時可采用生物肩袖補片進行加強，旨在促進受損肩袖組織快速地愈合。
4.目前，根據(jù)生物材料來源的不同，生物肩袖補片大致可分為三類，包括自體組織、同種異體組織和脫細胞化組織。自體組織移植材料主要來源于自體的闊筋膜、肱二頭肌長頭肌腱等組織。自體組織移植類補片不會引起機體的炎癥反應(yīng)，但是，取材時可能會給自體帶來額外創(chuàng)傷，影響肩關(guān)節(jié)穩(wěn)定性。同種異體組織移植材料通常來源于同源肩袖組織、異體髕腱組織、跟腱組織及股四頭肌肌腱組織等。同種異體類補片雖然容易取材，但是，力學性能受供體差異影響大，不能較好地解決肌腱退變或肌腱損傷等常見的生物性問題。脫細胞化組織移植材料經(jīng)物理方法或化學方法脫細胞化操作后，可去除細胞dna中的免疫成分，同時保留細胞外基質(zhì)（ecm）中原有的三維結(jié)構(gòu)及膠原纖維成分，脫細胞化組織移植材料類補片具有良好的生物相容性及抗拉伸的力學特性，有效地促進肩袖組織中膠原纖維及血管的再生，在肩袖修補術(shù)中具有明顯的優(yōu)越性，逐漸成為研究及應(yīng)用的熱點。但是，此類補片在力學強度方面比人體原生肌腱或韌帶弱。因此，需要一種取材方便、安全性及強度高的生物肩袖補片。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
5.為了提高生物肩袖補片的強度，本技術(shù)提供了一種生物肩袖補片及其制備方法。
6.第一方面，本技術(shù)提供了一種生物肩袖補片，所述生物肩袖補片是利用動物真皮進行制得，且生物肩袖補片的拉伸強度≥1.97mpa，頂破強度≥24kpa，撕裂強度≥18n/mm。
7.在本技術(shù)中，利用動物真皮制得一種脫細胞化組織的生物肩袖補片，制得肩袖補片強度較高，且無毒性，無細胞殘留，安全性更高，與人體原生肌腱或韌帶的力學強度更加接近。
8.本技術(shù)中真皮指的是位于表皮和皮下組織之間的組織，動物指的是豬、牛和羊等動物，所以，本技術(shù)中動物真皮來源較為廣泛，且優(yōu)先使用安全性更高的豬真皮。
9.第二方面，本技術(shù)提供一種生物肩袖補片的制備方法，包括以下步驟：s1：選取動物真皮作為原材料；s2：利用過氧乙酸溶液對步驟s1中的動物真皮進行浸泡；
s3：利用曲拉通溶液和十二烷基硫酸鈉溶液進行脫細胞處理，制得脫細胞真皮補片；s4：對所述脫細胞真皮補片進行去抗原處理，制得去抗原真皮補片；s5：利用交聯(lián)劑對所述去抗原真皮補片進行交聯(lián)處理，制得生物肩袖補片。
10.在本技術(shù)中，挑選檢疫合格的動物真皮作為原材料，加入過氧乙酸溶液進行浸泡，在室溫，搖床100r/min條件下，浸泡時間1-3h，在過氧乙酸溶液中浸泡后，再利用純化水超聲清洗3-5遍，每遍清洗時間不少于15min。
11.進一步地，所述過氧乙酸溶液的濃度為0.2%~0.4%。
12.進一步優(yōu)選地，所述過氧乙酸溶液的濃度為0.3%。
13.進一步地，所述過氧乙酸溶液的加入量為10~30ml/g。
14.進一步優(yōu)選地，所述過氧乙酸溶液的加入量為20ml/g。
15.本技術(shù)中過氧乙酸溶液按照上述濃度進行配制，將動物真皮在過氧乙酸溶液中浸泡，使得動物真皮中初始污染菌的含量保持在最低水平。當過氧乙酸的濃度低于0.2%時，不能有效地去除初始污染菌；當過氧乙酸的濃度大于0.4%時，對動物真皮造成損傷，降低了生物肩袖補片的強度。
16.本技術(shù)中，根據(jù)動物真皮的重量加入過氧乙酸溶液，每克動物真皮需要加入10~30ml的過氧乙酸溶液。過氧乙酸溶液的加入量可以為10ml/g，12ml/g，15ml/g，18ml/g，20ml/g，25ml/g或30ml/g。
17.在步驟s3中，首先分別配制曲拉通和十二烷基硫酸鈉的溶液，再按照相應(yīng)的比例進行混合，制得混合溶液，然后在室溫，搖床120r/min的條件下，利用混合溶液對浸泡后的動物真皮進行清洗，清洗時間為12h以上，之后再利用純化水清洗4-5遍，制得脫細胞真皮補片。
18.進一步地，所述曲拉通的濃度為0.1~0.5%。
19.進一步地，所述十二烷基硫酸鈉的濃度為0.1~0.5%。
20.進一步地，所述曲拉通和所述十二烷基硫酸鈉的體積比為1 :（0.5-2）。
21.進一步優(yōu)選地，所述曲拉通和所述十二烷基硫酸鈉的體積比為1 : 0.5。
22.曲拉通是一種非離子洗滌劑，通過分解脂質(zhì)-脂質(zhì)，脂質(zhì)-蛋白質(zhì)，脫氧核糖核酸（dna）-蛋白質(zhì)的相互作用來溶解細胞膜并解離dna與蛋白質(zhì)，但是保持了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用。由于蛋白質(zhì)不能變性，非離子洗滌劑可以清除遺傳內(nèi)容物，而不會損害膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和取向，但是不足以完全去除細胞和dna，進而使得生物肩袖補片的安全性較差。
23.十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡稱sds）是一種離子洗滌劑，通過破壞脂質(zhì)-脂質(zhì)，脂質(zhì)-蛋白質(zhì)，dna
??
蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來溶解核膜和細胞質(zhì)膜，從而消除細胞和遺傳內(nèi)容物。所以，sds的濃度在脫細胞處理過程中起著至關(guān)重要的作用。
24.當sds濃度小于0.1%時，膠原蛋白的保留含量越高，細胞外基質(zhì)（ecm）蛋白變性越少，細胞殘留物越多，細胞毒性作用越強。當sds濃度大于0.5%時，sds濃度過大，降低了生物肩袖補片機械強度，同時，sds濃度過大時，導(dǎo)致sds的殘留，進而降低了生物肩袖補片的安全性。
25.由于離子洗滌劑中斷蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，所以對ecm結(jié)構(gòu)和生物活性成分存
在一定影響。所以采用十二烷基硫酸鈉和曲拉通聯(lián)用的方式進行脫細胞處理，在完全去除細胞成分的同時，既能保證生物肩袖補片的強度，又能保證生物肩袖補片的安全性。
26.在步驟s4中，利用核酸酶溶液對脫細胞真皮補片進行清洗，清洗時間在3h以上，完畢后再利用純化水超聲清洗，接著再利用α-gal抗原酶溶液清洗3h，最后利用純化水超聲清洗，即得去抗原真皮補片。
27.進一步地，核酸酶為脫氧核糖核酸酶。
28.進一步地，所述核酸酶溶液的濃度為5~15u/ml。
29.進一步優(yōu)選地，所述核酸酶溶液的濃度為5u/ml。
30.在本技術(shù)中，核酸酶選用的是脫氧核糖核酸酶，又稱為dna酶。dna酶能夠有效地降低dna含量，同時通過切割核酸序列保留蛋白質(zhì)。動物真皮經(jīng)過曲拉通和十二烷基硫酸鈉洗滌后，增加了其內(nèi)部間距和孔隙率，使脫氧核糖核酸酶更容易和更快地滲入組織中。滲透的dna酶可以去除殘留的核酸和細胞碎片，并有助于去除多余或殘留的洗滌劑。
31.進一步地，α-gal抗原酶為α-半乳糖苷酶抗原酶。
32.進一步地，所述α-gal抗原酶溶液的濃度為10~50u/ml。
33.進一步優(yōu)選地，所述α-gal抗原酶溶液的濃度為10u/ml。
34.在步驟s5中，利用交聯(lián)劑對所述去抗原真皮補片進行交聯(lián)處理，處理時間為4h以上，處理結(jié)束后再利用75%乙醇超聲清洗3遍，每遍10min，清洗結(jié)束后使用純化水清洗，即得生物肩袖補片。
35.在一個實施方案中，所述交聯(lián)劑為京尼平溶液或戊二醛。
36.在一個實施方案中，所述京尼平溶液的濃度為1~5mmol/l。
37.在本技術(shù)中，利用交聯(lián)劑對去抗原真皮補片進行處理，形成強度較高的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，制得的生物肩袖補片強度較高，生物肩袖補片的拉伸強度≥1.97mpa，頂破強度≥24kpa，撕裂強度≥18n/mm。
38.本技術(shù)中，交聯(lián)劑優(yōu)選為京尼平溶液，在堿性環(huán)境下，京尼平受到oh-攻擊，開環(huán)形成單個醛基中間體，開環(huán)的京尼平單分子發(fā)生自聚合反應(yīng)后形成穩(wěn)定的長鏈結(jié)構(gòu)，聚合物末端的醛基結(jié)合膠原中的-nh2生成schiff鍵，形成一種交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。此外，京尼平具有生物相容性好，抗降解能力強和細胞毒性低等優(yōu)點。
39.在本技術(shù)中，所述京尼平溶液的濃度可以為1 mmol/l、2 mmol/l、3 mmol/l、4 mmol/l或5 mmol/l。京尼平溶液的濃度在1-5 mmol/l范圍內(nèi)，交聯(lián)效果較優(yōu)，所得生物肩袖補片的拉伸強度≥2.14mpa，頂破強度≥25.6kpa，撕裂強度≥19.2n/mm。
40.當京尼平溶液的濃度超過5 mmol/l后，所得生物肩袖補片的拉伸強度、頂破強度和撕裂強度基本不在提高，隨著京尼平溶液的濃度繼續(xù)增大時，降低了生物肩袖補片的安全性。
41.綜上所述，本技術(shù)具有以下有益效果：1、本技術(shù)采用動物真皮制得生物肩袖補片，生物肩袖補片的拉伸強度≥1.97mpa，頂破強度≥24kpa，撕裂強度≥18n/mm；2、本技術(shù)中生物肩袖補片的制備方法包括選材、浸泡、脫細胞處理、去抗原處理和交聯(lián)處理，制備方法簡單，易于控制，且生物肩袖補片的強度較高；3、本技術(shù)優(yōu)選曲拉通的濃度為0.1~0.5%，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.1~0.5%，脫
細胞效果較優(yōu)，安全性較高；4、本技術(shù)優(yōu)選京尼平溶液的濃度為1~5mmol/l，交聯(lián)效果好，生物肩袖補片強度高。
附圖說明
42.圖1為實施例1所得生物肩袖補片；圖2為實施例1所得生物肩袖補片的he染結(jié)果圖。
具體實施方式
43.以下結(jié)合附圖和實施例對本技術(shù)作進一步詳細說明。
44.原料本技術(shù)所述原料來源如表1所示，如無特殊說明，均可通過市售獲得。
45.表1 原料來源
實施例
46.實施例1生物肩袖補片的制備包括以下步驟：s1：取檢疫合格的豬真皮做為原材料，剔除表面多余軟組織；s2：將步驟1中的處理后豬真皮置于0.3%的過氧乙酸溶液中，在室溫下，搖床100r/min浸泡1h，其中過氧乙酸溶液的加入量為20ml/g；浸泡結(jié)束后，使用等體積的純化水超聲清洗3遍，每遍清洗時間不少于15min；s3：脫細胞處理，采用濃度為0.1%曲拉通溶液和濃度為0.1%十二烷基硫酸鈉溶液進行配制混合溶液，其中曲拉通溶液和十二烷基硫酸鈉溶液的體積比為1:1；利用所得混合溶液對步驟2中的處理后豬真皮進行清洗，在室溫下?lián)u床120r/min清洗12h，其中按照每克豬真皮加入20ml的混合溶液；清洗結(jié)束后，再采用等體積純化水清洗5遍；按照步驟3的方法重復(fù)清洗3次，制得脫細胞真皮補片；s4：去抗原處理，使用核酸酶溶液對脫細胞真皮補片進行清洗3h，清洗完畢后再使
用純化水超聲清洗；清洗結(jié)束后再使用α-gal抗原酶溶液清洗3h，清洗完畢后使用純化水超聲清洗，得到去抗原真皮補片；其中核酸酶溶液的濃度為5u/ml，核酸酶為脫氧核糖核酸酶；其中α-gal抗原酶溶液的濃度為10u/ml，α-gal抗原酶為α-半乳糖苷酶抗原酶；s5：交聯(lián)處理，利用3mmol/l的京尼平溶液（用0.1mol氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值，使得ph=8））對去抗原真皮補片處理4h，處理結(jié)束后使用75%乙醇超聲清洗3遍，每遍10min，清洗結(jié)束后使用純化水清洗，制得生物肩袖補片。
47.實施例2-7，對比例1-4實施例2-7，對比例1-4與實施例1的區(qū)別參數(shù)如表2所示。
48.表2 實施例2-7，對比例1-4與實施例1的區(qū)別參數(shù)性能檢測試驗將上述由實施例1-7和對比例1-4制得的生物肩袖補片進行力學性能測試，細胞殘留檢測，細胞毒性檢測。
49.力學性能測試主要包括拉伸強度實驗、頂破強度實驗和撕裂強度實驗。
50.其中拉伸強度實驗參照gb/t3923.1標準進行檢測；其中頂破強度實驗參照yy/t0500-2021中a.5.3.5規(guī)定方法進行檢測；其中撕裂強度實驗參照gb/t3917.2規(guī)定的方法進行檢測。
51.細胞殘留檢測通過he染實驗進行觀察細胞有無殘留，將制得的生物肩袖補片經(jīng)過福爾馬林固定48h后，進行脫水、石蠟包埋、病例切片、he染，然后置于顯微鏡下觀察。
52.細胞毒性檢測：參考gb/t 16886.5-2017第5部分：體外細胞毒性試驗。具體方法為：將所得生物肩袖補片按0.2g/ml的比例加入含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基，37℃下浸提
24h，得到浸提液。
53.取細胞密度約80%-90%的l929細胞系，棄去原培養(yǎng)基，加入浸提液，以原培養(yǎng)基做為對照，繼續(xù)培養(yǎng)72h后，采用mtt法檢測細胞活力，記錄相對增長率（%）。
54.具體檢測結(jié)果如表3所示。
55.表3 力學性能檢測結(jié)果結(jié)合實施例1-7和對比例1-4并結(jié)合表3可以看出，由實施例1-7制得的生物肩袖補片具有強度高、無細胞殘留且毒性低；所得生物肩袖補片的拉伸強度≥1.97mpa，頂破強度≥24kpa，撕裂強度≥18n/mm。
56.參照圖1，按照實施例1所述的制備方法獲得的生物肩袖補片。
57.參照圖2，將實施例1制得的生物肩袖補片經(jīng)過福爾馬林固定48h后，進行脫水、石蠟包埋、病例切片、he染，然后置于顯微鏡下觀察。
58.觀察后發(fā)現(xiàn)：所得生物肩袖補片中無細胞殘留，且肌腱組織保存完好，膠原纖維之間存在間隙，利于后期自體細胞及組織的長入。
59.結(jié)合實施例1/4/5和對比例4/5并結(jié)合表3可以看出，當十二烷基硫酸鈉溶液的濃度在0.1-0.5%范圍內(nèi)，隨著十二烷基硫酸鈉溶液的濃度逐漸遞增，所得生物肩袖補片的強度逐漸下降。
60.實施例8-9，對比例5-6實施例8-9，對比例5-6與實施例1的不同之處如表4所示。
61.表4 實施例8-9，對比例5-6與實施例1的區(qū)別參數(shù)
性能檢測試驗將上述由實施例8-9和對比例5-6制得的生物肩袖補片進行力學性能測試，細胞殘留檢測，細胞毒性檢測。主要包括拉伸強度實驗、頂破強度實驗和撕裂強度實驗，具體檢測結(jié)果如表5所示。
62.表5 力學性能檢測結(jié)果結(jié)合實施例1/8/9和對比例5/6并結(jié)合表5可以看出，當京尼平溶液的濃度在1-5 mmol/l范圍內(nèi)，隨著京尼平溶液的濃度逐漸遞增，交聯(lián)效果較優(yōu)，所得生物肩袖補片的強度逐漸升高；當京尼平溶液的濃度超過5mmol/l時，所得生物肩袖補片的強度基本不在增加，京尼平溶液的濃度過高時，細胞毒性增高。
63.可以理解的是，以上實施方式僅僅是為了說明本技術(shù)的原理而采用的示例性實施方式，然而本技術(shù)并不局限于此。對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員而言，在不脫離本技術(shù)的精神和實質(zhì)的情況下，可以做出各種變型和改進，這些變型和改進也視為本發(fā)明的保護范圍。
技術(shù)特征：
1.一種生物肩袖補片，其特征在于，所述生物肩袖補片是利用動物真皮進行制得，且生物肩袖補片的拉伸強度≥1.97mpa，頂破強度≥24kpa，撕裂強度≥18n/mm。2.一種如權(quán)利要求1所述生物肩袖補片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：s1：選取動物真皮作為原材料；s2：利用過氧乙酸溶液對步驟s1中的動物真皮進行浸泡；s3：利用曲拉通溶液和十二烷基硫酸鈉溶液進行脫細胞處理，制得脫細胞真皮補片；s4：對所述脫細胞真皮補片進行去抗原處理，制得去抗原真皮補片；s5：利用交聯(lián)劑對所述去抗原真皮補片進行交聯(lián)處理，制得生物肩袖補片。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述生物肩袖補片的制備方法，其特征在于，在所述步驟s2中，所述過氧乙酸溶液的濃度為0.2%~0.4%。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述生物肩袖補片的制備方法，其特征在于，在所述步驟s3中，所述曲拉通溶液的濃度為0.1~0.5%。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述生物肩袖補片的制備方法，其特征在于，在所述步驟s3中，所述十二烷基硫酸鈉溶液的濃度為0.1~0.5%。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述生物肩袖補片的制備方法，其特征在于，所述曲拉通溶液和所述十二烷基硫酸鈉溶液的體積比為1 :（0.5-2）。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述生物肩袖補片的制備方法，其特征在于，在步驟s4中，利用核酸酶溶液對脫細胞處理的動物真皮進行清洗，清洗完畢后使用純化水超聲清洗，再利用α-gal抗原酶溶液進行清洗，清洗完畢后使用純化水超聲清洗。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述生物肩袖補片的制備方法，其特征在于，所述核酸酶溶液的濃度為5~15u/ml，所述α-gal抗原酶溶液的濃度為10~50u/ml。9.根據(jù)權(quán)利要求2所述生物肩袖補片的制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑為京尼平溶液或戊二醛。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述生物肩袖補片的制備方法，其特征在于，所述京尼平溶液的濃度為1~5mmol/l。
技術(shù)總結(jié)
本申請涉及生物材料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種生物肩袖補片及其制備方法。所述生物肩袖補片的制備方法，包括S1：選取動物真皮作為原材料；S2：利用過氧乙酸溶液對步驟S1中的動物真皮進行浸泡；S3：利用曲拉通溶液和十二烷基硫酸鈉溶液進行脫細胞處理，制得脫細胞真皮補片；S4：對所述脫細胞真皮補片進行去抗原處理，制得去抗原真皮補片；S5：利用交聯(lián)劑對所述去抗原真皮補片進行交聯(lián)處理，制得生物肩袖補片。所得生物肩袖補片的拉伸強度≥1.97MPa，頂破強度≥24kPa，撕裂強度≥18/mm，且無細胞殘留，毒性低。毒性低。毒性低。
