一種協同增效抗肺癌藥物組合物及其在醫藥上的應用的制作方法
1.本發明屬于醫藥應用領域，涉及靶向藥物(吉非替尼)和中藥有效組分(薯蕷皂素)組合物和其制備方法，以及防治肺癌的藥物用途。本發明提供了一種肺癌的聯合用藥物組合，它含有不同規格的單位制劑，同時或分別給藥吉非替尼和薯蕷皂素。本發明聯合用藥可以有效抑制肺癌細胞增殖，及降低肺癌細胞遷移能力，發揮高效抗非小細胞肺癌作用，其效果明顯優于吉非替尼或薯蕷皂素單獨使用，說明二者在本發明特定配比下配合使用后具有協同增效的作用，臨床應用前景好。
背景技術：
2.肺癌是世界上發病率和死亡率均居第一的惡性腫瘤，在我國肺癌發病率及死亡率也是最高的癌癥。肺癌主要包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌約占肺癌的85％，發現時大多處于晚期，其5年生存率《15％。化療、放療、手術、小分子靶向藥物是目前最常見的癌癥的方法。吉非替尼等是肺癌的第一代靶向藥物，目前臨床應用廣泛，但同時也伴隨著毒副作用，和使用一段時間(8-11個月左右)后會產生耐藥等問題，進而影響效果。肺癌極易轉移是導致患者的預后差的主要原因。如何解決耐藥性和防治肺癌轉移一直是藥物研發人員急需解決的問題。近年來，中藥因其具有療效好、毒副作用小，不易產生耐藥，且價格低廉、易獲得的優點，目前也被廣泛應用于非小細胞肺癌的。特別是近年來，研究發現一些中藥具有逆轉腫瘤藥物耐藥性等功能。相應，中藥有效組分能否改善或解決分子靶向藥物的耐藥性等問題是近年來研究人員重點關注的方向。
3.吉非替尼(gefitinib)是一種代表性的表皮生長因子受體(egfr)酪氨酸激酶抑制劑 (tki)。egfr是癌基因的表達產物，與癌癥的發生發展有密切關聯，阻斷egfr受體酪氨酸激酶信號轉導能抑制腫瘤生長、加速腫瘤細胞凋亡。吉非替尼是臨床應用較為成熟的靶向藥物，也是egfr酪氨酸激酶受體抑制劑中的代表物，進入體內后可與細胞外配體結合位點進行競爭性結合，阻斷分子內的酪氨酸磷酸化過程，使得egfr受體受體酪氨酸激酶信號轉導發生異常，拮抗腫瘤血管的新生，并能使有絲分裂蛋白激酶失活，特異性作用于腫瘤細胞的活性周期，抑制細胞分裂與腫瘤生長，誘導腫瘤細胞凋亡，以達到靶向的目的。吉非替尼因其療效確切，已經被推薦用于egfr突變陽性患者的一線。
4.薯蕷皂素(diosgenin)，是薯蕷科薯蕷屬植物根莖中薯蕷皂苷的水解產物，是合成甾體和甾體類激素藥物的重要原料在制藥業中應用廣泛。除此之外，薯蕷皂素本身具有抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗氧化、解毒等多種活性，可以用于腫瘤、心血管系統疾病、風濕性疾病、皮膚過敏、糖尿病等疾病。研究表明，薯蕷皂素抗腫瘤譜廣泛，可以通過多種途徑在多種腫瘤細胞系中發揮抗腫瘤作用。薯蕷皂素可通過抑制pi3k-akt途徑誘導人肝細胞癌 smmc-7721細胞系發生周期阻滯；通過p38、jnk途徑促進人結腸癌ht29細胞系凋亡；通過p-p38 mapk途徑調控人食管癌eca109細胞系增殖；通過降低bcl2蛋白表達和線粒體膜電位下降使人宮頸癌hela細胞凋亡和dna片段化；通過抑制vegf分泌使人前列腺癌細胞 pc-3細胞系遷移侵襲能力減弱等。薯蕷皂素在抗腫瘤方面主要通過抑制惡性腫瘤細胞增殖、抑制
遷移與侵襲、誘導凋亡、阻斷細胞周期等起作用。薯蕷皂素從天然植物中分離制得，成本低、效率高、純天然、毒性低、安全性好，是極具開發潛能和藥用活性的中藥，使其在抗腫瘤方面成為一種臨床腫瘤的輔助用藥而得到廣泛的推廣及應用。
5.目前，未見有gefitinib與diosgenin聯合用藥以腫瘤的相關報道。
技術實現要素：
6.本發明目的是吉非替尼聯合薯蕷皂素非小細胞肺癌的用途，具有協同抗腫瘤功效的聯合藥物，具體涉及吉非替尼與薯蕷皂素以最低有效劑量聯合，達到高療效、少抗藥性、小毒副作用，抑制非小細胞肺癌的增殖與轉移，從而來非小細胞肺癌。
7.本發明是通過一下技術方案實現的：
8.一種抗腫瘤藥物組合物，將傳統中藥薯蕷皂素和靶向藥物吉非替尼聯合。
9.其中，吉非替尼和薯蕷皂素摩爾比為8:1、4:1和2:1。
10.其中，吉非替尼和薯蕷皂素濃度分別為0.0625～40μm:0.078125～50μm、0.0625～ 40μm:0.15625～50μm、0.0625～40μm:0.3125～50μm。
11.其中，所述靶向藥物吉非替尼稀釋溶劑為二甲基亞砜，化療藥物薯蕷皂素稀釋溶劑為無水乙醇。
12.一種抗腫瘤藥物組合物在制備非小細胞肺癌制劑中的應用。
13.一種抗腫瘤藥物組合物在制備作為減毒增效用于非小細胞肺癌的臨床輔助制劑中的應用。
14.本發明的優點和積極效果如下：
15.本發明有益效果在于gefitinib與diosgenin聯合使用，兩種藥物在低效量下的組合在非小細胞肺癌時具有協同作用。兩種藥物聯合使用可以增強療效和降低其引起的副作用，抑制非小細胞肺癌細胞遷移能力，為耐藥性惡性腫瘤的提供了新的思路。
16.本發明采用了gefitinib聯合diosgenin，對腫瘤細胞進行實驗，經體外實驗證實gefitinib 聯合diosgenin有協同增效作用，將有助于降低藥物的毒副作用，提高藥物的敏感性，抑制腫瘤的遷移，增強抑制腫瘤的效果，為研發新藥提供了科學依據。
附圖說明
17.圖1兩藥單用濃度為1.5625μm～100μm對h1299細胞增殖抑制作用；
18.圖2兩藥單用及gefitinib:diosgenin(16:1)聯合時對h1299細胞增殖抑制作用；
19.圖3兩藥單用及gefitinib:diosgenin(8:1)聯合時對h1299細胞增殖抑制作用；
20.圖4兩藥單用及gefitinib:diosgenin(4:1)聯合時對h1299細胞增殖抑制作用；
21.圖5兩藥單用及genfitinib:diosgenin(16:1)聯合時對h1299細胞的ci值；
22.圖6兩藥單用及genfitinib:diosgenin(8:1)聯合時對h1299細胞的ci值；
23.圖7兩藥單用及genfitinib:diosgenin(4:1)聯合時對h1299細胞的ci值；
24.圖8兩藥單用濃度為1.5625μm～100μm對h460細胞增殖抑制作用；
25.圖9兩藥單用及gefitinib:diosgenin(16:1)聯合時對h460細胞增殖抑制作用；
26.圖10兩藥單用及gefitinib:diosgenin(8:1)聯合時對h460細胞增殖抑制作用；
27.圖11兩藥單用及gefitinib:diosgenin(4:1)時聯合對h460細胞增殖抑制作用；
28.圖12兩藥單用及genfitinib:diosgenin(16:1)時聯合對h460細胞的ci值；
29.圖13兩藥單用及genfitinib:diosgenin(8:1)時聯合對h460細胞的ci值；
30.圖14兩藥單用及genfitinib:diosgenin(4:1)時聯合對h460細胞的ci值；
31.圖15兩藥單用及固定值聯合對h1299細胞的遷移抑制作用；
32.圖16兩藥單用及固定值聯合對h460細胞的遷移抑制作用。
具體實施方式
33.本發明的目的在于提供一種高活性的抗腫瘤藥物組合物及其在肺癌的藥物中的應用。
34.本發明的抗腫瘤藥物組合物含有genfitinib與diosgenin。
35.genfitinib和diosgenin的結構式如i、ii所示
[0036][0037]
genfitinib與diosgenin的摩爾比優選為4:1。
[0038]
本發明所述的抗腫瘤藥物組合物，優選的情況下，所述genfitinib與diosgenin的有效濃度分別為0.15625～30μm:1.25～40μm、0.3125～30μm:0.625～40μm、0.3125～25μm:0.625～ 30μm。
[0039]
本發明所述的抗腫瘤藥物組合物，優選的情況下，所述genfitinib的稀釋溶劑為
二甲基亞砜，diosgenin的稀釋溶劑為無水乙醇。
[0040]
本發明的抗腫瘤藥物組合物可應用于肺癌。
[0041]
所述的抗腫瘤藥物組合物的應用是genfitinib與diosgenin同時應用。
[0042]
本發明抗腫瘤藥物組合物中的genfitinib或其衍生物與diosgenin或其衍生物可以直接混合做成制劑；分別和相應的輔料混合分別做成制劑，然后再按照本領域常規的方式包裝或結合在一起，或分別和相應的輔料混合后，再混合做成制劑。制劑使用的輔料可采用本領域常規的輔料，但以不和本發明藥物組合物發生反應或不影響本發明藥物組合物的療效為前提。
[0043]
根據制劑形式和制劑規格的不同，本發明藥物組合物在制劑中的含量可在1～99wt％之間進行調整，優選10～99wt％。此外，本發明藥物組合物的給藥劑量可根據給藥對象、給藥途徑或藥物的制劑形式進行適當變化，但以保證該藥物組合物在哺乳動物體內能夠達到有效的血藥濃度為前提。
[0044]
具體實施例中所用生物材料、藥品和實驗方法如下：
[0045]
本發明所述的肺癌株包括人源非小細胞肺癌nci-h1299(h1299)和人源大細胞肺癌 nci-h460(h460)。
[0046]
本發明所述的藥品genfitinib標準品、diosgenin標準品。以二甲基亞砜或無水乙醇分別溶解，配成genfitinib的濃度為50mmol/l，diosgenin的濃度為50mmol/l，貯存液在-20℃下保存。使用時稀釋到表中所列舉的合適的濃度。
[0047]
mtt檢測細胞增殖：細胞于含1％的青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)，10％的胎牛血清的 rpmi1640細胞培養基中，置于37℃、5％co2培養箱培養。將細胞用胰酶消化后，用血細胞計數板進行計數。按每孔體積100μl接種于96孔細胞培養板(濃度為2
×
104cell/ml)，于37℃、 5％co2培養箱中培養24h后加入不同濃度梯度的藥物，置于37℃，5％co2恒溫培養箱中培養48h。每孔加入5mg/ml的mtt溶液20μl(用pbs配制，0.22μm濾膜過濾除菌)，置于 37℃，5％co2恒溫培養箱中繼續孵育4h，終止培養。小心移除孔內培養上清液，每孔加入 100μl dmso，37℃，放置10min后，使紫結晶物充分溶解，用酶標儀(550nm，570nm)測定各孔的吸光度(od)值。
[0048]
細胞存活率(％)＝(實驗組od-空白組od)/(對照組od-空白組od)
×
100％。
[0049]
ic
50
：又稱半數有效抑制濃度，即細胞存活率為50％時的藥物濃度。根據mtt結果求直線回歸方程，并計算ic
50
值。
[0050]
藥物相互作用評價：對genfitinib與diosgenin的聯合作用采用ci值法計算，應用計算機軟件compusyn計算，ci《1，表示兩藥聯合后具有協同作用；ci＝1，表示兩藥聯合后具有相加作用；ci》1，表示兩藥聯合后具有拮抗作用。
[0051]
細胞劃痕實驗檢測細胞遷移：1.先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻劃橫線，大約每隔0.5～1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過3條線。2.在6孔板加入約5
×
104cell/孔細胞。3.第二天用頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，頭要垂直，不能傾斜。4.用 pbs洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入培養基并分別給藥。5.放入37度5％co2培養箱培養。按0，12，24，36,48小時取樣，拍照。
[0052]
實施例1
[0053]
genfitinib與diosgenin單體對h1299、h460細胞的進行了增殖抑制作用的實驗結
果圖1 和圖8，genfitinib與diosgenin單體在兩種細胞的ic50值如下表1所示。
[0054]
表1 genfitinib與diosgenin對肺癌細胞的ic50值
[0055][0056]
實施例2
[0057]
用培養基分別稀釋genfitinib與diosgenin母液為下表中的濃度，不同濃度的genfitinib 與diosgenin單用時對h1299細胞增殖抑制作用的實驗結果見圖1-7及表2-4。
[0058]
表2 genfitinib對h1299細胞存活率
[0059]
genfitinib(梯度稀釋)細胞存活率(％)121.87048
±
0.84707671/237.3094
±
0.93717631/449.30553
±
0.94834541/866.82846
±
0.59088931/1678.32318
±
0.99235231/3286.21928
±
1.2146881/6496.46054
±
1.107083
[0060]
表3 diosgenin對h1299細胞存活率
[0061]
diosgenin(梯度稀釋)細胞存活率(％)13.814608
±
0.60275661/26.758531
±
0.34345551/416.31684
±
0.35999121/841.49739
±
1.4000541/1668.62926
±
1.1180131/3282.15765
±
1.0242821/6483.47072
±
1.026054
[0062]
表4 genfitinib與diosgenin聯合用藥對h1299的細胞存活率與ci值
[0063][0064][0065]
聯合用藥會有種結果協同效應、拮抗效應和相加效應。一般采用合用指數ci來判斷具體效果，ci《1，表示兩藥聯合后具有協同作用；ci＝1，表示兩藥聯合后具有相加作用；ci》1，表示兩藥聯合后具有拮抗作用。從上述結果可以看出，genfitinib和diosgenin同時給藥時， ci值在一定劑量配比下可以達到《1，此時，二者合用對h1299細胞具有較好的協同作用。
[0066]
實施例3
[0067]
用培養基分別稀釋genfitinib與diosgenin母液為下表中的濃度，不同濃度的genfitinib 與diosgenin單用時對h460細胞增殖抑制作用的實驗結果見圖8-14及表5-7。
[0068]
表5 genfitinib對h460細胞存活率
[0069]
genfitinib(梯度稀釋)細胞存活率(％)10.1684315
±
0.45540271/25.065873
±
0.58989361/412.59507
±
0.36181781/837.05401
±
0.31052151/1672.69972
±
1.9601371/3290.1998
±
2.0061991/6496.18035
±
1.278472
[0070]
表6 diosgenin對h460細胞存活率
[0071]
diosgenin(梯度稀釋)細胞存活率(％)17.780216
±
0.60544431/234.60015
±
2.6776161/446.39225
±
1.5127691/865.20983
±
0.99865691/1666.98426
±
1.0877121/3274.355
±
1.2303291/6479.79606
±
2.811806
[0072]
表7 genfitinib與diosgenin聯合用藥對h460的細胞存活率與ci值
[0073]
[0074][0075]
聯合用藥會有種結果協同效應、拮抗效應和相加效應。一般采用合用指數ci來判斷具體效果，ci《1，表示兩藥聯合后具有協同作用；ci＝1，表示兩藥聯合后具有相加作用；ci》1，表示兩藥聯合后具有拮抗作用。從上述結果可以看出，genfitinib和diosgenin同時給藥時， ci值在一定劑量配比下可以達到《1，此時，二者合用對h460細胞具有較好的協同作用。
技術特征：
1.一種抗肺癌藥物組合物，其特征在于：靶向藥物吉非替尼和傳統中藥活性組分(薯蕷皂素)的聯合。2.據權利要求1所述的抗肺癌藥物組合，其特征在于：吉非替尼和薯蕷皂素摩爾比為(16～1):1。3.據權利要求2所述的抗肺癌藥物組合，其特征在于：吉非替尼和薯蕷皂素摩爾優選比為4:1。4.據權利要求1～3所述的抗肺癌藥物組合物，其特征在于：吉非替尼和薯蕷皂素濃度分別為0.0625～40μm:0.078125～50μm、0.0625～40μm:0.15625～50μm、0.0625～40μm:0.3125～50μm。5.據權利要求1所述的抗肺癌藥物組合，其特征在于：靶向藥物吉非替尼溶劑為二甲亞砜，傳統中藥薯蕷皂素溶劑為無水乙醇。6.據權利要求1所述的抗肺癌藥物組合在制備非小細胞肺癌制劑中的應用。7.據權利要求1所述的抗腫瘤藥物組合在制備作為減毒增效用于非小細胞肺癌的臨床輔助制劑中的應用。8.薯蕷皂素作為一代抗肺癌藥物增效劑的應用。9.據權利要求8所述薯蕷皂素作為一代抗肺癌藥物增效劑的應用，其特征在于：所述一代抗肺癌藥物為吉非替尼。
技術總結
本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及薯蕷皂素/吉非替尼組合物與制備方法，及其用于肺癌的用途。該藥物組合物的活性成分包括靶向藥物(吉非替尼)和中藥有效組分(薯蕷皂素)。本發明運用肺癌細胞評價該藥物組合對腫瘤細胞增殖與轉移等抗腫瘤活性作用。實驗證明，吉非替尼和薯蕷皂素配伍聯合使用能協同抑制肺癌細胞增殖等活性，并且大幅度降低吉非替尼用量，相應可減少其副作用。同時實驗證明，吉非替尼和薯蕷皂素在一定比例范圍(100:1～0.01:1)內聯合時，協同增效抑制肺癌細胞轉移活性。因此，吉非替尼和薯蕷皂素配伍聯合對肺癌細胞的增殖與轉移有很好抑制作用，可將吉非替尼和薯蕷皂素組合物作為有效成分或配方制備防治人肺癌的藥物。肺癌的藥物。肺癌的藥物。
