一種聚多巴胺配位納米粒子的制備方法及其應用
1.本發明屬于納米材料及其制備領域，更具體地，涉及一種負載dox的聚多巴胺配位納米粒子的制備方法及其應用。
背景技術：
2.光熱療法是一種新型腫瘤療法。臨床上通過給予患者光熱劑，在外界近紅外光(nir)的輻照下，光熱劑將光能轉化為熱能，促進腫瘤細胞高溫消融凋亡。作為一種低侵入式療法，光熱療法具有低創傷性，高空間性與時間選擇性等優點，已經引起廣泛的興趣。
3.超氧化物歧化酶(sod)與過氧化物酶(pod)是細胞中調節細胞微環境中氧化-還原平衡的兩種酶系。其中，sod可催化超氧陰離子(
·o2-)，生成h2o2和o2；而pod則通過催化底物h2o2反應，產生羥基自由基(
·
oh)，并借以氧化細胞內的其他物質。相對于正常細胞的中性環境，腫瘤微環境的ph在6.5左右，同時具有更高的h2o2和活性氧(ros)含量。利用腫瘤微環境的特點，向細胞內引入具有類sod和類pod活性的材料進行級聯催化反應，可使腫瘤微環境內產生大量生物毒性的
·
oh，破壞生物大分子，同時使得腫瘤細胞氧化還原失衡，引起腫瘤細胞凋亡。
4.目前，聚多巴胺類材料因其良好的生物相容性和其優秀的光熱性質，受到廣泛的關注和研究應用(chem.sci.,2020,11,12269)。在本發明中，我們以生物相容性良好的聚多巴胺為載體，在其結構上配位fe
3+
離子和化療藥物dox，以配位作用與π-π共軛堆積作用為主要驅動力自組裝形成fedd納米粒子，用于級聯催化-光熱-化療的腫瘤聯合療法。一方面，多巴胺作為神經遞質，生物相容性好，在腫瘤中對正常細胞毒性小；另一方面，材料的類pod和類sod的級聯催化作用，聯合光熱療法和化療藥物dox，可高效誘導腫瘤細胞凋亡，實現腫瘤的高效。
技術實現要素：
5.本發明的目的是提供一種用于癌癥聯合療法的負載dox的聚多巴胺配位納米粒子，用于三療法協同腫瘤。即以da為單體，與fe
2+
/fe
3+
進行配位的同時，da發生自聚包裹化療藥物dox，實現腫瘤的級聯催化療法-光熱療法-化療三合一協同。
6.該聚多巴胺配位納米粒子具有如下特征：
7.(1)具有均一的尺寸，其中fed粒徑約為195.2nm，fedd粒徑約為227.6nm；
8.(2)有良好的生物相容性；
9.(3)有良好的體外細胞效果；
10.(4)在腫瘤酸性微環境下，可將腫瘤細胞內的
·o2－
和h2o2催化產生過量的
·
oh，誘導腫瘤細胞凋亡；
11.(5)具有光熱轉化能力，在近紅外光輻照下可消融腫瘤細胞，并促進酶級聯反應速率；
12.本發明以生物體內的神經遞質分子多巴胺為單體，在自聚合產生聚多巴胺的同
時，在材料內包裹有fe
3+
與化療藥物dox，合成了同時具有納米酶特性和光熱特性的腫瘤納米粒子fed和fedd，具有均一的粒徑、良好的分散性和生物相容性。在多巴胺與fe
3+
配位作用，及化療藥物dox與多巴胺的苯環π-π堆積的自組裝驅動力作用下，可在水溶液中以一鍋法簡單合成納米材料，合成方法綠無毒，健康環保。相比于常規的納米材料：一方面，fed和fedd合成簡便安全，生物相容性好，降低了由單純無機材料引起的細胞毒性；另一方面，fedd所涉及的是級聯催化療法、光熱療法及化療藥物三種模式的協同，在腫瘤弱酸微環境的驅動和近紅外光輻照下，產生高溫和過量的
·
oh，同時促進材料中dox的釋放。三種療法互相促進，極大地提高了材料在腫瘤細胞中的效率，僅200μg/ml便可造成90％以上的腫瘤細胞死亡。
附圖說明
13.圖1：本發明fed及fedd的粒徑分布圖
14.圖2：本發明fed透射電鏡圖(標尺：500nm)
15.圖3：本發明fedd透射電鏡圖(標尺：500nm)
16.圖4：本發明fedd催化h2o
2-tmb顯反應檢測類pod活性
17.圖5：本發明fedd抑制鄰苯三酚自氧化檢測類sod活性
18.圖6：本發明fedd在近紅外光輻照下升溫效果
19.圖7：本發明納米材料的細胞毒性圖
20.圖8：本發明納米材料的細胞圖
具體實施方式
21.下面結合實施例對本發明做進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。如所用溶液的濃度、體積等可根據需要調節。
22.實施例1
23.(1)將14.5mg的da溶解于2ml，1mg/ml的fecl3·
6h2o水溶液中，以超純水補充體積至42ml，在室溫下攪拌1h。
24.(2)向上述反應體系內加入6.45ml，22.5mg/mltris水溶液調節ph，繼續在室溫下反應24h。
25.(3)收集反應液，離心并以超純水洗滌2遍，即得fed納米粒子，納米粒子以水溶液方式保存于4℃。
26.實施例2
27.(1)將7.2mg的da溶解于1ml，1mg/ml的fecl3·
6h2o水溶液中，以超純水補充體積至42ml，在室溫下攪拌1h。
28.(2)1h后，向反應體系內加入6.45ml，22.5mg/mltris水溶液調節ph，同時加入1.5mg dox鹽酸鹽，繼續在室溫下反應12h。
29.(3)收集反應液，離心并以超純水洗滌2遍，即得fedd納米粒子，納米粒子以水溶液方式保存于4℃。
30.實施例3
31.(1)-(3)同實施例2步驟(1)-(3)。
32.(4)向fedd的hac-naac緩沖溶液(ph4.5)(200μg/ml)中加入h2o2和tmb的dmso溶液，使其總體積為3ml，濃度分別達到1mm和200μg/ml，并開始計時。以紫外分光光度計測量混合體系于0，4，8，12，16min的350～800nm波長的吸收曲線。
33.結果顯示，在fedd存在的條件下，混合體系位于370nm和652nm的吸收峰隨反應時間延長不斷增加。這是因為h2o2在過氧化物酶催化作用下，會產生tmb氧化物，并在370nm和652nm處產生吸收。由此可見，fedd具有類pod活性，在弱酸性的腫瘤微環境下催化h2o2分解，產生過量
·
oh并誘導腫瘤細胞凋亡的作用。
34.實施例4
35.(1)-(3)同實施例2步驟(1)-(3)。
36.(4)在96孔板中加入0,50,100,150,200μg/mlfedd的tris-hcl溶液(50mm，ph8.2)各160μl。向各孔加入40μl鄰苯三酚的50mm鹽酸溶液，同時開始計時，以酶標儀檢測0～10min內各體系325nm處的吸光度變化。
37.鄰苯三酚是一種在中堿性環境中自發氧化的物質，其氧化產物中間體在325nm處有吸光度。吸光度越深，說明自氧化程度越完全，而具有類sod特性的材料能顯著抑制鄰苯三酚的自氧化過程。因此，向自氧化體系內加入具有類sod活性的物質，體系內325nm的吸光度增長速度將會減緩。實驗結果顯示：隨著溶液內fedd材料的濃度增加，10min內體系在325nm的吸光度增長逐漸降低，這說明fedd可以有效抑制鄰苯三酚的自氧化過程，具有類sod活性，在細胞中可將超氧陰離子歧化為h2o2和o2，在類pod活性的作用下起到增強
·
oh產率，促進化學動力學效果的作用。
38.實施例5
39.(1)-(3)同實施例2步驟(1)-(3)。
40.(4)向光熱實驗的專用反應容器內分別加入濃度為0，12.5，25，50，100，200μg/ml的fedd水溶液1ml，并以808nm近紅外光(1.5w/cm2)輻照15min，用熱電偶監測這段時間內溶液的升溫情況。
41.結果表明：隨著近紅外光輻照，溶液在15min內不斷升溫。隨著溶液內fedd濃度的增加，溶液的升溫速率和最高溫度也隨之增長。當fedd濃度為200μg/ml時，溶液在15min內升溫46.2℃，而不含有fedd的對照組僅升溫1.8℃。由此可見，fedd具有出的光熱轉化能力，在nir輻照下可迅速產生大量熱量，達到消融腫瘤細胞并加速酶促反應的效果。
42.實施例6
43.(1)-(3)同實施例2步驟(1)-(3)。
44.(4)在細胞毒性實驗中，將4t1細胞以1
×
104個/孔的密度接種在96孔板中，在孵育24h后，棄去培養基，分別更換為含有0，12.5，25，50，100，200μg/mlfedd的培養基，并繼續孵育24h。通過mtt法確定與不同濃度fedd共孵育時，各組的細胞活力。
45.結果表明：與不含fedd的對照組相比，各組的細胞活力值不存在顯著性差異，即使fedd的濃度達到了200μg/ml，細胞仍具有89.34％的活力值。由此可見fedd對正常細胞沒有顯著的毒性，具有良好的生物相容性。
46.實施例7
47.(1)-(3)同實施例2步驟(1)-(3)。
48.(4)在細胞實驗中，將4t1細胞以1
×
104個/孔的密度接種在96孔板中，孵育
24h，之后更換培養基，與不同組共培養24h。
49.其中，fed/fedd的濃度為0～200μg/ml(材料梯度同實施例6)，而dox的濃度等于對應濃度下fedd的包封濃度。對于添加h2o2的實驗組，h2o2的濃度均為100μm，并用鹽酸調節培養基ph至6.8。對于nir組，在更換培養基共孵育12h后，以808nm激光輻照每孔3min，激光功率為1.5w/cm2。在共孵育12h后，以mtt試劑盒法測定各組的細胞活力。
50.結果顯示：在以上細胞實驗中，僅單一使用fed或fedd時，效果很弱，因為ph7.4下(正常細胞環境)，fed和fedd的類pod活性較弱，幾乎不能產生
·
oh，并且fedd包封的dox的緩釋也較慢。而隨著h2o2的加入及ph降低至6.8(腫瘤細胞環境)，材料的級聯催化功能開始發揮效果，使細胞活力逐漸下降，且fedd+h2o2+nir組的效果遠高于對應濃度下的游離dox組，在fedd共孵育濃度達到200μg/ml時，細胞活力僅8.97％，這進一步驗證了fedd三種療法的協同功能。實驗結果證實了fedd在腫瘤細胞微環境中可將
·o2-和h2o2轉化為過量的
·
oh，誘導腫瘤細胞凋亡。而nir的輻照不僅能使腫瘤細胞消融，還兼具加速級聯催化反應和dox緩釋的功能。最終數據驗證了fedd高效的抗腫瘤能力。
技術特征：
1.一種聚多巴胺配位納米粒子的制備方法，其特征在于，多巴胺即da單體與fecl3溶液中的鐵離子進行配位的同時，利用三羥甲基氨基甲烷即tris緩沖溶液調節至弱堿性，使da能夠自氧化聚合形成聚多巴胺，最終自組裝形成聚多巴胺配位納米粒子fed。2.根據權利要求1所述聚多巴胺配位納米粒子的制備方法，其特征在于，將14.5mg da
·
hcl加入至1mg/ml，1.0或2.0ml fecl3·
6h2o的水溶液中，補充超純水至體積為42ml，攪拌1h；加入22.5mg/ml，6.45ml的tris水溶液，繼續攪拌24h；將所得溶液10000rpm，10min離心清洗2次。3.一種負載dox的聚多巴胺配位納米粒子的制備方法，其特征在于，在權利要求1的合成體系中還加入dox，通過dox與鐵離子配位，自組裝形成負載dox的聚多巴胺配位納米粒子fedd。4.根據權利要求3所述負載dox的聚多巴胺配位納米粒子的制備方法，其特征在于，將14.5mg da
·
hcl加入至1mg/ml，1.0ml fecl3·
6h2o的水溶液中，補充超純水至體積為42ml，攪拌1h；加入22.5mg/ml，6.45ml的tris水溶液，加入1.0mg或1.5mg的dox
·
hcl繼續攪拌12h；將所得溶液10000rpm，10min離心清洗2次。5.由權利要求1～4任一項所述的制備方法制得的聚多巴胺配位納米粒子或負載dox的聚多巴胺配位納米粒子。6.采用權利要求1～4任一項所述的制備方法制得的聚多巴胺配位納米粒子或負載dox的聚多巴胺配位納米粒子作為腫瘤的藥物的應用。
技術總結
本發明公開了一種聚多巴胺配位納米粒子的制備方法及其應用。通過多巴胺單體自氧化聚合，同時與Fe
