金釵石斛多糖在制備防治皮膚光老化藥物或日化用品中的應用
1.本發明涉及中藥材的提取物的應用技術領域，具體涉及一種金釵石斛多糖在制備防治皮膚光老化藥物或日化用品中的應用。
背景技術：
2.皮膚衰老通常分為內源性老化和外源性老化，諸如紫外線(ultraviolet，uv)輻射、電磁波輻射、大氣污染及不良生活習慣等均是外源性衰老的誘因。而uv輻射是導致皮膚老化的主要因素。所以外源性老化又稱為光老化，光老化和皮膚癌是長期紫外線輻射皮膚產生慢性損傷導致的結果。
3.長、中波紫外線均可刺激皮膚損傷。長波紫外線(uva，400nm
–
315nm，3.10
–
3.94ev)具有的穿透力最強，臭氧層雖然隔絕了大部分的uv輻射，但直達地面輻射仍以uva為主，占比98％以上，其能直接穿透表皮而直達真皮層。uva損傷真皮層內的成纖維細胞時，造成急性dna損傷、活性氧自由基清除酶系統活力下降、蛋白質非正常修飾及生物膜脂質過氧化等一系列惡性影響。
4.金釵石斛(dendrobium nobile lindl.)在《中國藥典(2020年版)》中為藥用石斛的重要來源。近年來，金釵石斛在化妝品中應用日益增多，主要集中在保濕、抗氧化、美白等方面。研究表明石斛有效成分包括生物堿、多糖、微量元素和氨基酸等成分。自然堂、植物醫生等國內著名化妝品公司已推出一系列含有石斛提取成分的護膚品。石斛阿爾茲海默癥、高脂血癥、糖尿病等老年性疾病的研究較多，多聚集在石斛多酚、生物堿、多糖、黃酮等成分的藥理藥效研究。而目前并沒有金釵石斛抗皮膚光老化的相關研究及產品。
技術實現要素：
5.本發明針對現有技術的不足，發現金釵石斛多糖在防治紫外線uva多次輻照導致的人皮膚光老化中具有明顯的保護作用。
6.本發明的目的之一是提供金釵石斛多糖作為活性成分在制備防治皮膚光老化藥物應用，所述的光老化是紫外線uva輻射導致的光老化損傷。
7.進一步的，皮膚光老化為多次紫外線uva輻照所導致的光損傷，包括人真皮層成纖維細胞活性氧(ros)增加、衰老相關β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染陽性率增加、細胞增殖緩慢和壽命降低、sod酶活性降低、cat酶活性降低或者gsh-px的酶活性降低中的一種或者多種。
8.進一步的，所述金釵石斛多糖的提取按照水提醇沉法提取。包括以下步驟：將金釵石斛藥材粉末加入80％乙醇中浸泡30～50min，脫去脂質、極性小分子等；用4～8倍體積的純水回流提取2～3次，每次1～3h；合并濾液，放冷至室溫，先用無菌紗布初濾，濾液離心，再抽濾得濾液；濾液加入3～8倍體積的無水乙醇，4℃冷藏過夜；冷藏后棄去上層大部分溶液，取下層沉淀及少部分溶液離心，再棄上清保留沉淀；沉淀用乙醇，離心后取沉淀恒溫干燥得
金釵石斛多糖。
9.本發明的目的之二是提供金釵石斛多糖作為活性成分在制備日化用品中的應用。
10.進一步的，所述的光老化是紫外線uva輻射導致的光老化損傷。
11.進一步的，皮膚光老化為多次紫外線uva輻照所導致的光損傷，包括人真皮層成纖維細胞活性氧(ros)增加、衰老相關β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染陽性率增加、細胞增殖緩慢和壽命降低、sod酶活性降低、cat酶活性降低或者gsh-px的酶活性降低中的一種或者多種。
12.進一步的，所述日化用品的種類包括香皂、面膜或者面霜。
13.長期慢性輻射如紫外線可以引起皮膚組織的氧化應激反應和dna損傷，而對于這些損傷，目前沒有特別有效的手段進行保護、。而本發明通過現代藥理學實驗證明，金釵石斛多糖對長波紫外線誘導皮膚成纖維細胞光老化具有明顯的拮抗作用，提示預防性給藥可防治皮膚輻射導致的光老化損傷。金釵石斛多糖可以有效保護皮膚長期慢性輻射導致的皮膚光老化損傷，為以后制作以金釵石斛多糖為主要成分的抗皮膚輻射光老化損傷的藥物以及以金釵石斛多糖為主要成分的藥物在預防、紫外線皮膚損傷、光老化造成的皮膚損傷的臨床應用提供了重要的科學依據。
附圖說明
14.圖1為金釵石斛多糖(dnlp)預處理可預防uva損傷的人皮膚成纖維細胞活力示意圖；
15.圖2為金釵石斛多糖(dnlp)降低光損傷人皮膚成纖維細胞中的ros和mda的含量示意圖；
16.圖3為金釵石斛多糖(dnlp)預處理提高uva損傷人皮膚成纖維細胞中sod、cat、 gdh-px的活力示意圖；
17.圖4為金釵石斛多糖(dnlp)抑制uva慢性輻射導致的人皮膚成纖維細胞衰老示意圖。
具體實施方式
18.下面通過具體實施方式進一步詳細說明：
19.1.水提醇沉法提取金釵石斛多糖
20.(1)精確稱定金釵石斛藥材粉末(過100目篩)30g；(2)加入80％乙醇200ml浸泡30min，脫去脂質、極性小分子等；(3)5倍體積的純水回流提取3次，每次2h；(4)合并濾液，放冷至室溫，先用無菌紗布(5層)初濾，濾液4000g離心10min，再抽濾得濾液；(5)濾液加入5倍體積的無水乙醇，慢加快攪，4℃冷藏過夜；(6)冷藏后棄去上層大部分溶液，取下層沉淀及少部分溶液4000g離心20min，再棄上清保留沉淀；(7)沉淀用乙醇洗2次，離心后取沉淀恒溫干燥得金釵石斛多糖(dendrobium nobile lindl. polysaccharides,dnlp)。
21.苯酚-硫酸法測定多糖純度：96孔板加入梯度濃度的葡萄糖溶液40μl作為標準品，然后加入5％苯酚20μl、濃硫酸100μl，搖勻后室溫靜置30min，酶標儀490nm測od值。以標準品的濃度為橫坐標，以od值為縱坐標繪制標準曲線，經標準曲線計算dnlp的多糖純度。
22.dnlp樣品可溶于溫水，精密稱取dnlp 0.00540g溶于1ml 37℃預熱的不含丙酮酸
鈉的基礎培養基，0.45μm微孔濾膜過濾除菌，即得5.4mg/ml的dnlp藥品母液，用于后續藥效活性研究，4℃保存，現配現用。
23.2.實驗
24.2.1cck-8法檢測金釵石斛多糖(dnlp)對uva光損傷后細胞活力的影響
25.將hff-1細胞以2
×
103個/孔接種于96孔板中，在細胞培養箱中用不含丙酮酸鈉的 15％fbs完全培養基培養24h，棄去原培養基，加基礎培養基(不含丙酮酸鈉)同步化6h。共設七組，各組均設3個平行。dnlp加藥組設五個劑量組(dnlp：1.62mg/ml；dnlp： 0.54mg/ml；dnlp：0.18mg/ml；dnlp：0.06mg/ml；dnlp：0.02mg/ml)藥物預處理24h。棄去原培養基，加pbs后，再以uva 12j/cm2輻射加藥組和模型組，正常對照組不做輻射。輻射后各實驗組加入新的5％fbs、含藥或不含藥的完全培養基(不含丙酮酸鈉)， co2孵箱繼續培養24h后，采用cck-8法，全波長酶標儀測定各組od值。
26.對照組大鼠皮膚涂布溶劑，并對該處腿部皮膚進行x射線照射，輻射劑量為8g探究 dnlp預處理對uva損傷模型中hff-1細胞活力的影響，依據前述方法分組，cck-8法檢測細胞活力。統計結果如圖1所示，與正常對照組相比，模型組細胞增殖活力下降(1.000
±
0.000vs 0.5998
±
0.02546，p《0.001)。與模型組相比，加藥組隨著dnlp給藥濃度的增高，細胞的增殖活力是顯著提升的，結果有顯著性差異(0.5998
±
0.02546vs 0.7613
±
0.02078、 0.8036
±
0.02060，p《0.05；0.5998
±
0.02546vs 0.8395
±
0.01319、0.9250
±
0.04212、0.9298
±
0.02757， p《0.001)。在dnlp給藥濃度為0.54mg/ml時增殖活力為最高，此后藥物濃度增加再無顯著性增強。
27.2.2熒光探針dcfh-da法檢測金釵石斛多糖(dnlp)對uva損傷人皮膚成纖維細胞中ros水平的影響
28.將hff-1細胞以2
×
106個/皿接種于2r＝10cm的培養皿中，在細胞培養箱中用不含丙酮酸鈉的15％fbs完全培養基培養24h，棄去原培養基，加基礎培養基(不含丙酮酸鈉)同步化6h。dnlp加藥組設高中低三個劑量組(dnlp：0.54mg/ml；dnlp：0.18mg/ml； dnlp：0.06mg/ml)藥物預處理24h。裝載探針完成后棄去基礎培養基，加pbs后，再以 uva 12j/cm2輻射加藥組和模型組，正常對照組不做輻射，各組均設3個平行。培養30min 后，采用dcfh-da法，流式細胞儀檢測活性氧含量水平。
29.依據上述方法分組，模型建立，流式細胞儀檢測各實驗組的細胞ros水平，結果如圖2所示。圖2中a顯示流式細胞儀輸出的峰值曲線結果，與正常對照組比較，可見模型組吸收峰右移。與模型組比較，加藥組吸收峰左移。b門x-mean結果統計如圖2中b顯示，統計結果顯示模型組ros高表達，有顯著性差異(1.000
±
0.000vs 1.995
±
0.05288，p《0.001)。dnlp 藥物預處理組與模型組比較，ros水平是降低的，且高劑量實驗組降低ros水平最為顯著，低劑量組和中劑量組降低ros水平的能力相似，以上結果均有顯著性差異(1.995
±
0.05288vs 1.359
±
0.05288、1.352
±
0.03177、1.121
±
0.02802，p《0.001)。
30.2.3金釵石斛多糖(dnlp)對uva損傷人皮膚成纖維細胞中mda、sod、cat、gsh-px的影響
31.按照試劑盒說明書，采用硫代酸(tba)比法測定細胞丙二醛(mda)水平，氯化硝基四氮唑藍(nitrotetrazolium blue chloride,nbt)核黃素微板法檢測細胞超氧化物歧化酶(sod)酶活性，分光光度法檢測細胞過氧化氫酶(cat)酶活性，1.4.8 5,5'-二硫
代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),dtnb)比法檢測細胞谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)酶活性。
32.mda是脂質過氧化的產物，常用來反應脂質氧化水平。活性氧自由基作用于脂質不飽和脂肪酸生成過氧化脂質，因此一定程度上也反映了積累過量的ros產生的損傷水平。依據前述方法進行分組，實驗結果統計如圖2中c所示，與正常對照組相比，模型組經過高劑量 uva輻射后mda水平明顯增高(12.74
±
0.2986vs 18.89
±
0.7006，p《0.01)。相比模型組， dnlp加藥的低、中、高劑量組細胞mda表達水平是顯著下降的(18.89
±
0.7006vs 15.08
±
0.9544、13.69
±
0.4389、13.32
±
0.6889，p《0.05)。
33.sod是ros清除酶系統中最關鍵的生物酶，sod是人體內o2·-的清除劑，能把有害的 o2·-轉化為h2o2。因此依據前述方法分組，考察高劑量uva輻射對hff-1中sod酶活性的影響，探究dnlp預處理對uva損傷hff-1模型的細胞sod酶活性產生的影響。結果如圖3中a所示，與正常對照組相比，模型組經過高劑量uva輻射后sod酶活性水平明顯降低(46.19
±
1.333vs 18.03
±
3.168，p《0.001)。相比模型組，dnlp加藥的低、中劑量組細胞sod 酶活性水平是有明顯恢復的(18.03
±
3.168vs 36.74
±
3.201、38.16
±
2.499，p《0.05)，尤以高劑量組sod酶活性水平的恢復最為顯著(18.03
±
3.168vs 44.46
±
1.570，p《0.001)。
34.cat廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是最主要的h2o2清除酶，在ros 清除酶系統的主要生物酶之一。依據前述方法分組，考察高劑量uva輻射對hff-1中cat 酶活性的影響，探究dnlp預處理對uva損傷模型hff-1細胞中cat酶活性產生的影響。結果如圖3中b所示，與正常對照組相比，模型組經過高劑量uva輻射后cat酶活性水平明顯降低(0.02420
±
0.001616vs 0.01326
±
0.001467，p《0.01)。相比模型組，dnlp加藥的中、高劑量組細胞cat酶活性水平是有明顯恢復的(0.01326
±
0.001467vs 0.02356
±
0.002263、0.02319
±
0.001269，p《0.01)，尤以低劑量組cat酶活性水平的恢復最為顯著(0.01326
±
0.001467vs 0.02639
±
0.0007443，p《0.001)。以上差異均有統計學意義。
35.gsh-px也是人體內分解h2o2的生物酶。gsh-px特異性催化還原型gsh對h2o2的還原反應，與cat具有協同作用。依據前述方法分組，考察高劑量uva輻射對hff-1中gsh-px酶活性的影響，探究dnlp預處理對uva損傷模型hff-1細胞中gsh-px酶活性產生的影響。結果如圖3中c所示，與正常對照組相比，模型組經過高劑量uva輻射后gsh-px酶活性水平明顯降低(1.126
±
0.01858vs 0.5591
±
0.06328，p《0.001)。相比模型組，dnlp加藥的低、中、高劑量組細胞gsh-px酶活性水平是有明顯恢復的(0.5591
±
0.06328vs 1.406
±
0.03250、 2.450
±
0.05306、2.319
±
0.02715，p《0.001)。以上差異均有統計學意義。
36.2.4sa-β-gal衰老染法評價金釵石斛多糖(dnlp)對uva損傷人皮膚成纖維細胞的保護作用
37.將hff-1細胞以2
×
106個/皿接種于2r＝10cm的培養皿中，在細胞培養箱中用不含丙酮酸鈉的15％fbs完全培養基培養24h，棄去原培養基，加基礎培養基(不含丙酮酸鈉)同步化6h。共設五組，各組均設3個平行。dnlp加藥組設高中低三個劑量組(dnlp：0.54 mg/ml；dnlp：0.18mg/ml；dnlp：0.06mg/ml)。加藥組藥物預處理24h，棄去原培養基，加pbs后，再以uva 12j/cm2輻射加藥組和模型組，每隔24h進行一次輻射，共輻射5次，每次輻射后加入含5％fbs、含藥或不含藥的完全培養基(不含丙酮酸鈉)，正常對照組不做輻射。最后一次輻射后各組在co2孵箱繼續培養24h后，檢測指標。
38.檢測步驟：(1)吸除細胞培養液，用pbs洗滌2次，加入適量能完全覆蓋細胞的β
??
半乳糖苷酶染固定液，25℃下固定15min。吸除細胞固定液，用pbs洗滌細胞3次，每次3min。每孔加入2毫升染工作液。染工作液的配制方法參考說明書。(2)37℃孵育過夜，應用封板膜或保鮮膜封住6孔板降低染工作液的蒸發。(5)普通光學顯微鏡下拍照并用image j分析。
39.依據前述方法分組，考察多次高劑量uva輻射對hff-1中sa-β-gal活性的影響，dnlp 預處理對uva損傷hff-1細胞光老化模型中sa-β-gal活性產生的影響。結果如圖4所示，與正常對照組相比，模型組經過高劑量uva輻射后sa-β-gal活性水平明顯升高(1.856
±
0.1463vs 19.43
±
2.549，p《0.001)。相比模型組，dnlp加藥的低劑量組細胞sa-β-gal 活性是明顯水平降低的(19.43
±
2.549vs 7.355
±
0.3205、5.494
±
0.07419，p《0.01)，尤以中、高劑量組的sa-β-gal活性水平降低最為顯著(19.43
±
2.549vs 3.277
±
0.3869，p《0.001)。
40.以上結果均用spss 17.0分析，所有結果均用均數
±
平均值的標準誤差(
±
sem)表示。組間均采用單因素方差分析，用lsd檢驗，p《0.05，差異有統計學意義。
41.以上所述的僅是本發明的實施例，方案中公知的具體結構及特性等常識在此未作過多描述。應當指出，對于本領域的技術人員來說，在不脫離本發明結構的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應該視為本發明的保護范圍，這些都不會影響本發明實施的效果和專利的實用性。本技術要求的保護范圍應當以其權利要求的內容為準，說明書中的具體實施方式等記載可以用于解釋權利要求的內容。
技術特征：
1.金釵石斛多糖作為活性成分在制備防治皮膚光老化藥物應用，其特征在于，所述的光老化是紫外線uva輻射導致的光老化損傷。2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：皮膚光老化為多次紫外線uva輻照所導致的光損傷，包括人真皮層成纖維細胞活性氧(ros)增加、衰老相關β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染陽性率增加、細胞增殖緩慢和壽命降低、sod酶活性降低、cat酶活性降低或者gsh-px的酶活性降低中的一種或者多種。3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于：所述金釵石斛多糖的提取按照水提醇沉法提取。4.根據權利要求2所述的應用，其特征在于：藥物的劑型包括外用涂抹制劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑、混懸劑、糖漿劑、腸溶制劑、噴霧劑、膏劑、凝膠劑、透皮吸收劑或者乳劑。5.金釵石斛多糖作為活性成分在制備日化用品中的應用，其特征在于，所述的光老化是紫外線uva輻射導致的光老化損傷。6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于：皮膚光老化為多次紫外線uva輻照所導致的光損傷，包括人真皮層成纖維細胞活性氧(ros)增加、衰老相關β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染陽性率增加、細胞增殖緩慢和壽命降低、sod酶活性降低、cat酶活性降低或者gsh-px的酶活性降低中的一種或者多種。7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：所述日化用品的種類包括香皂、面膜或者面霜。
技術總結
本申請公開了中藥材的提取物的應用技術領域中金釵石斛多糖在制備預防或皮膚紫外線輻射損傷導致皮膚光老化藥物或日化用品中的應用。其中，光老化損傷是紫外線UVA輻射導致的光老化。通過現代藥理學實驗證明，金釵石斛多糖對長波紫外線誘導皮膚成纖維細胞光老化具有明顯的拮抗作用，提示預防性給藥可防治皮膚輻射導致的光老化損傷。皮膚輻射導致的光老化損傷。皮膚輻射導致的光老化損傷。
