一種用于肺癌上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法及其應(yīng)用與流程
1.本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及用于在體外培養(yǎng)或擴(kuò)增原代肺癌上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，還涉及培養(yǎng)得到的細(xì)胞在藥物的療效評估和篩選中的方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2.肺癌是目前世界上最常見的呼吸道腫瘤。世界范圍內(nèi)每年新增加的肺癌患者超過180萬。肺癌作為臨床中最常見的惡性腫瘤，其方式主要為手術(shù)、化療、放療、分子靶向以及免疫等，其中最為常用的手段為手術(shù)、化療和放療，但其臨床方式的適宜人存在局限性。近幾年，在分子生物學(xué)的興起與發(fā)展下，腫瘤藥物呈現(xiàn)多樣化趨勢，其中分子靶向藥物因其針對性強(qiáng)、安全性高等優(yōu)勢成為肺癌臨床中研究的熱點(diǎn)。但是臨床上針對眾多方案，怎么選擇適合病人的方案就尤為重要。盡管有基因檢測作為指標(biāo)，但是對于有些病人沒有基因突變，或者有些病人即使有某種突變，但是針對該突變有多種靶向藥物，這時(shí)確定方案在臨床上有一定的難度。除了基因測序，體外對肺癌病人樣本進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)成為未來體外預(yù)測療效和指導(dǎo)臨床用藥的重要手段，但是體外快速獲得肺癌原代細(xì)胞一直是亟待解決的技術(shù)問題。
3.功能性測試是指在體外對抗腫瘤藥物在癌癥患者細(xì)胞上的敏感性進(jìn)行檢測的方法。應(yīng)用這一方法的關(guān)鍵在于開發(fā)生長周期短且能夠代表肺癌患者自身生物學(xué)特性的腫瘤細(xì)胞模型。另外，所述細(xì)胞模型應(yīng)操作便捷，能快速高效地預(yù)測臨床用藥的療效，從而及時(shí)給予癌癥患者精準(zhǔn)用藥指導(dǎo)。然而，取自癌癥患者的原代腫瘤細(xì)胞在體外建立細(xì)胞模型的成功率往往很低，生長周期長，并存在成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞過度增殖等問題，制約著這一領(lǐng)域的發(fā)展。目前有兩種培養(yǎng)原代上皮細(xì)胞/干細(xì)胞的技術(shù)在腫瘤細(xì)胞功能性測試應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)展得相對成熟。一種是使用經(jīng)輻射的飼養(yǎng)細(xì)胞和rock激酶抑制劑y27632來促進(jìn)原代上皮細(xì)胞的生長以考察個體患者的藥物敏感性的技術(shù)，即細(xì)胞條件重編程技術(shù)(liu等，am j pathol，180：599-607，2012)。另一種技術(shù)是體外3d培養(yǎng)成體干細(xì)胞從而獲得類似于組織器官的類器官技術(shù)(hans clevers等，cell，11，172(1-2)：373-386，2018)。
4.然而，這兩種技術(shù)都存在一定的局限性。細(xì)胞重編程技術(shù)是一種將患者自體原代上皮細(xì)胞與鼠源性飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)的技術(shù)。在對患者原代細(xì)胞進(jìn)行藥物敏感性測試時(shí)，這些鼠源性細(xì)胞的存在會干擾患者自體原代細(xì)胞的藥物敏感性檢測結(jié)果；但如果撤除鼠源性飼養(yǎng)細(xì)胞，病人自體原代細(xì)胞就脫離了重編程環(huán)境，細(xì)胞的增殖速率和細(xì)胞內(nèi)信號通路會發(fā)生明顯的改變(liu等，am j pathol，183(6)：1862-1870，2013；liu等，cell death dis.，9(7)：750，2018)，從而使患者自體原代細(xì)胞對藥物的響應(yīng)結(jié)果受到較大影響。類器官技術(shù)是將患者自體原代上皮細(xì)胞包埋在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)進(jìn)行體外三維立體培養(yǎng)的技術(shù)，該技術(shù)無需飼養(yǎng)細(xì)胞，因此不存在鼠源性飼養(yǎng)細(xì)胞的干擾問題。但是類器官技術(shù)的培養(yǎng)基內(nèi)需添加多種特定的生長因子(如wnt蛋白和r-spondin家族蛋白)，成本昂貴，不適于普及到臨床進(jìn)行大規(guī)模應(yīng)用。另外，類器官在整個培養(yǎng)過程中均需將細(xì)胞包埋在細(xì)胞外基質(zhì)膠中，其細(xì)胞
接種、傳代和藥物敏感性測試的鋪板步驟相較于2d培養(yǎng)操作繁瑣費(fèi)時(shí)，且該技術(shù)所形成的類器官大小尺寸不好控制，易出現(xiàn)部分類器官生長過大而導(dǎo)致內(nèi)部發(fā)生壞死的情況。因此，類器官技術(shù)相較于2d培養(yǎng)技術(shù)可操作性和適用性不強(qiáng)，需要專業(yè)技術(shù)人員操作，不適合大規(guī)模廣泛應(yīng)用于臨床體外藥物敏感性檢測(nick barker，nat cell biol，18(3)：246-54，2016)。
5.鑒于以上技術(shù)的局限性，臨床上需要開發(fā)一種原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，其培養(yǎng)周期短，成本可控，操作便捷，不受外源性細(xì)胞干擾。在將該技術(shù)應(yīng)用于構(gòu)建原代肺癌腫瘤細(xì)胞模型時(shí)，所培養(yǎng)的肺癌腫瘤細(xì)胞能代表肺癌患者自身的生物學(xué)特性。通過體外評估抗腫瘤藥物在不同癌癥患者個體所衍生的細(xì)胞模型上的敏感性，來提高臨床上抗腫瘤藥物的響應(yīng)率，減少不合適的藥物給患者造成的痛苦及醫(yī)療資源的浪費(fèi)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
6.本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于培養(yǎng)原代肺癌上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基以及使用該培養(yǎng)基的原代肺癌上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法。采用本發(fā)明的原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，能夠?qū)崿F(xiàn)體外培養(yǎng)周期短、成本可控、操作便捷并不受外源性細(xì)胞干擾的目的。在該技術(shù)應(yīng)用于構(gòu)建原代肺癌腫瘤細(xì)胞模型時(shí)，能夠獲得具有肺癌患者自身生物學(xué)特性的原代肺癌腫瘤細(xì)胞，并能夠應(yīng)用于新藥篩選和體外藥物敏感性檢測。
7.本發(fā)明的一個方面在于提供一種用于培養(yǎng)原代肺癌上皮細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其含有mst1/2激酶抑制劑；選自y27632、法舒地爾、和h-1152中的至少一種的rock激酶抑制劑；成纖維細(xì)胞生長因子7(fgf7)；b27添加劑和n2添加劑中的至少一種添加劑；肝細(xì)胞生長因子(hgf)；胰島素樣生長因子1(igf-1)；白介素6(il-6)；選自a83-01、sb431542、repsox、sb505124、sb525334、sd208、ly36494、和sjn2511中的至少一種的tgfβi型受體抑制劑，所述mst1/2激酶抑制劑包括式(i)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、或溶劑化物，
[0008][0009]
其中，
[0010]
r1選自c1-c6烷基、c3-c6環(huán)烷基、c4-c8環(huán)烷基烷基、c2-c6螺環(huán)烷基、以及任選地被1-2個獨(dú)立地r6取代的芳基(例如苯基和萘基等)、芳基c1-c6烷基(例如苯甲基等)和雜芳基(例如噻吩基等)；
[0011]
r2和r3各自獨(dú)立地選自c1-c6烷基，優(yōu)選c1-c3烷基，更優(yōu)選甲基；
[0012]
r4和r5各自獨(dú)立地選自氫、c1-c6烷基、c3-c6環(huán)烷基、c4-c8環(huán)烷基烷基、c1-c6烷基羥基、c1-c6鹵代烷基、c1-c6烷基氨基c1-c6烷基、c1-c6烷氧基c1-c6烷基、和c3-c6雜環(huán)基
c1-c6烷基(所述雜環(huán)基選自例如基、四氫吡喃基等)；
[0013]
r6選自鹵素(優(yōu)選氟和氯，更優(yōu)選氟)、c1-c6烷基(優(yōu)選甲基)、c1-c6烷氧基(優(yōu)選甲氧基)、和c1-c6鹵代烷基(優(yōu)選三氟甲基)。
[0014]
優(yōu)選的實(shí)施方式中，mst1/2激酶抑制劑包括式(ia)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、或溶劑化物，
[0015][0016]
其中，
[0017]
r1選自c1-c6烷基、任選地被1-2個獨(dú)立地r6取代的苯基、任選地被1-2個獨(dú)立地r6取代的噻吩基、和任選地被1-2個獨(dú)立地r6取代的苯甲基，r1更優(yōu)選為任選地被1-2個獨(dú)立地r6取代的苯基；
[0018]
r5選自氫、c1-c6烷基、和c3-c6環(huán)烷基，r5更優(yōu)選為氫；
[0019]
r6各自獨(dú)立地選自鹵素、c1-c6烷基、和c1-c6鹵代烷基，r6更優(yōu)選為氟、甲基或三氟甲基。
[0020]
優(yōu)選地，所述mst1/2抑制劑是選自以下化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、或溶劑化物中的至少一種。
[0021]
[0022]
[0023]
[0024]
[0025][0026]
最優(yōu)選地，本發(fā)明的mst1/2激酶抑制劑為化合物1。
[0027]
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，mst1/2激酶抑制劑在培養(yǎng)基中的含量通常為2.5μm～10μm，優(yōu)選為5μm～7.5μm。
[0028]
在又一實(shí)施方式中，rock激酶抑制劑優(yōu)選地為y27632。另外優(yōu)選的，rock激酶抑制劑在培養(yǎng)基中的含量通常為2.5μm～15μm，優(yōu)選為5μm～15μm，更優(yōu)選為10μm～12.5μm。
[0029]
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述成纖維細(xì)胞生長因子7的含量為5ng/ml～160ng/ml，更優(yōu)選為10ng/ml～80ng/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為20ng/ml～40ng/ml；所述b27添加劑或n2添加劑在
培養(yǎng)基中的體積濃度為1:25～1:800，更優(yōu)選為1:25～1:200，進(jìn)一步優(yōu)選1:50～1:100；所述肝細(xì)胞生長因子的含量為5ng/ml～160ng/ml，更優(yōu)選為20ng/ml～80ng/ml；所述胰島素樣生長因子1的含量為5ng/ml～160ng/ml，更優(yōu)選為20ng/ml～80ng/ml；所述白介素6的含量為2.5ng/ml～40ng/ml，更優(yōu)選為5ng/ml～40ng/ml；所述tgfβi型受體抑制劑優(yōu)選a83-01，且tgfβi型受體抑制劑的含量為62.5nm～500nm，優(yōu)選為250nm～500nm。
[0030]
本發(fā)明的培養(yǎng)基配方還含有選自dmem/f12、dmem、f12或rpmi-1640的初始培養(yǎng)基；和選自鏈霉素/青霉素、兩性霉素b和primocin中的一種或多種的抗生素。在一些的實(shí)施方式中，初始培養(yǎng)基優(yōu)選為dmem/f12，抗生素優(yōu)選為primocin。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，primocin在培養(yǎng)基中的含量為25～400μg/ml，優(yōu)選為50～200μg/ml。
[0031]
本發(fā)明的培養(yǎng)基配方成分與細(xì)胞條件重編程培養(yǎng)基和肺癌上皮細(xì)胞類器官培養(yǎng)基成分相比，添加了mst1/2激酶抑制劑，且不包含血清、牛垂體提取物等不確定成分，也不包含wnt激動劑、r-spondin家族蛋白、bmp抑制劑等類器官培養(yǎng)所必須的龕因子，并且不包含煙酰胺(nicotinamide)和n-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine)，從而大大降低了培養(yǎng)基的成本，簡化了配制培養(yǎng)基的操作流程，實(shí)現(xiàn)了成本可控和操作便捷的原代肺癌上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)。
[0032]
本發(fā)明中，原代肺癌上皮細(xì)胞可以為肺癌腫瘤細(xì)胞、正常肺癌上皮細(xì)胞、肺癌上皮干細(xì)胞。
[0033]
本發(fā)明的一個方面在于提供一種原代肺癌上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：
[0034]
(1)按上述配方配制本發(fā)明的原代細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0035]
(2)用細(xì)胞外基質(zhì)膠稀釋液包被培養(yǎng)器皿。
[0036]
具體地，該細(xì)胞外基質(zhì)膠使用低生長因子型細(xì)胞外基質(zhì)膠，例如，可采用市售的matrigel(購自康寧公司)或bme(購自trevigen公司)。更具體而言，用無血清的培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞外基質(zhì)膠，培養(yǎng)基可以是dmem/f12(購自康寧公司)。細(xì)胞外基質(zhì)膠的稀釋比例為1:50-1:400，優(yōu)選為1:100-1:200。包被方法為將稀釋后的細(xì)胞外基質(zhì)膠加入培養(yǎng)器皿內(nèi)，使其完全覆蓋培養(yǎng)器皿底部，靜置包被30分鐘以上，優(yōu)選在37℃條件下靜置包被，優(yōu)選包被時(shí)間為30～60分鐘。包被結(jié)束后吸棄多余的細(xì)胞外基質(zhì)膠稀釋液，培養(yǎng)器皿備用。
[0037]
(3)從肺癌組織分離得到原代肺癌上皮細(xì)胞。
[0038]
原代肺癌上皮細(xì)胞例如可以來源于肺癌手術(shù)樣本和活檢穿刺樣本。肺癌組織樣本例如來源于進(jìn)行過說明并獲得同意的肺癌腫瘤患者手術(shù)切除癌組織樣本，活檢穿刺樣本經(jīng)由超聲引導(dǎo)采集自肺內(nèi)病灶。在患者手術(shù)切除或活檢后的半小時(shí)內(nèi)進(jìn)行上述組織樣本的收集。更具體而言，在無菌環(huán)境下，切取非壞死部位的組織樣本，其體積在5mm3以上，將其置于預(yù)冷的10-15ml dmem/f12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基盛在塑料無菌帶蓋離心管內(nèi)，冰上運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室；其中，dmem/f12培養(yǎng)基中含有本發(fā)明的mst1/2激酶抑制劑(例如化合物1)和0.2-0.4體積％primocin(以下簡稱組織運(yùn)輸液)。當(dāng)使用本發(fā)明的mst1/2激酶抑制劑時(shí)，濃度范圍為0.3μm～10μm，優(yōu)選為2μm～5μm，更優(yōu)選為3μm；當(dāng)使用primocin時(shí)，濃度范圍為25～400μg/ml，優(yōu)選為50～200μg/ml，更優(yōu)選為100μg/ml。
[0039]
在生物安全柜內(nèi)，將組織樣本轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，用組織運(yùn)輸液潤洗組織樣本，將組織樣本表面的血細(xì)胞清洗掉。將潤洗后的組織樣本轉(zhuǎn)移至另一個新的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入
1-3ml組織運(yùn)輸液，用無菌手術(shù)刀片和手術(shù)鑷將組織樣本分割為體積小于3mm3的組織碎塊。
[0040]
將組織樣本碎塊轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，用臺式離心機(jī)(sigma公司3-18k)以1000～3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3～5分鐘；棄上清，按1:1比例加入組織運(yùn)輸液和組織消化液(使用量約為每10mg組織使用5ml組織消化液，其中組織消化液的配制方法為：將1～2mg/ml膠原酶ⅱ、1～2mg/ml膠原酶ⅳ、50～100u/ml脫氧核糖核酸ⅰ、0.5～1mg/ml透明質(zhì)酸酶、0.1～0.5mg/ml氯化鈣、5～10mg/ml牛血清白蛋白溶于體積比1:1的hbss和rpmi-1640中)，標(biāo)記樣本編號，封口膜密封，以37℃、200～300轉(zhuǎn)恒溫?fù)u床(知楚儀器zqly-180n)消化，每間隔1小時(shí)觀察消化是否完成；若未見明顯組織塊即可終止消化，否則繼續(xù)消化，直至消化充分，消化時(shí)間范圍為4～8小時(shí)。消化完成后，細(xì)胞濾網(wǎng)(細(xì)胞篩孔徑為例如70μm)過濾掉未消化的組織團(tuán)塊，濾網(wǎng)上的組織團(tuán)塊用組織運(yùn)輸液沖洗，將殘留細(xì)胞沖入離心管中，用臺式離心機(jī)以1000～3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3～5分鐘。棄上清，觀察剩余細(xì)胞團(tuán)是否含有血細(xì)胞，若有血細(xì)胞，加3～5ml血細(xì)胞裂解液(購自sigma公司)，混勻，4℃裂解10～20分鐘，5分鐘搖晃混勻一次，裂解結(jié)束后取出，以1000～3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3～5分鐘。棄上清，加入本發(fā)明的原代細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，使用流式圖像計(jì)數(shù)儀(江蘇卓微生物科技有限公司jimbio fil)進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞總數(shù)。
[0041]
(4)在包被好的培養(yǎng)器皿內(nèi)接種步驟(3)中分離得到的原代肺癌上皮細(xì)胞，并采用步驟(1)中的原代細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0042]
更具體而言，在多孔板的一個孔中按2
×
104～8
×
104個/cm2(例如4
×
104個/cm2)的密度接種原代肺癌腫瘤細(xì)胞，加入適量如2-3ml原代上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，在例如37℃、5％co2的條件下于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-16天，期間每4天換成新鮮的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，在原代肺癌上皮細(xì)胞長至占多孔板底面積80％～90％左右的細(xì)胞密度時(shí)進(jìn)行消化傳代。
[0043]
該接種步驟無需使用飼養(yǎng)細(xì)胞，相比細(xì)胞條件重編程技術(shù)，免去了培養(yǎng)和輻照飼養(yǎng)細(xì)胞的操作步驟。該步驟相比類器官技術(shù)，也無需在冰上將原代細(xì)胞和基質(zhì)膠混勻后形成膠滴，并等待膠滴凝固后加入培養(yǎng)基，預(yù)先包被好的培養(yǎng)器皿可直接用于原代細(xì)胞接種。此外，包被培養(yǎng)器皿僅需少量稀釋后的細(xì)胞外基質(zhì)膠，相比類器官技術(shù)，節(jié)約了價(jià)格昂貴的細(xì)胞外基質(zhì)膠的使用量，也簡化了操作步驟。
[0044]
任選地，接種后的原代肺癌上皮細(xì)胞在培養(yǎng)8～16天后，當(dāng)培養(yǎng)容器內(nèi)形成的細(xì)胞克隆匯合達(dá)到底面積80％，棄去上清，加入0.5～2ml 0.05％胰酶(購自thermo fisher公司)進(jìn)行細(xì)胞消化，室溫下孵育5～20分鐘；然后用含有例如5％(v/v)胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)液1～4ml重懸消化處理后的細(xì)胞，以1000～3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3～5分鐘，使用本發(fā)明的原代細(xì)胞培養(yǎng)基將消化后的單細(xì)胞重懸，將所得到的細(xì)胞懸液置入包被有細(xì)胞外基質(zhì)膠的t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶的包被操作同步驟(2)。
[0045]
擴(kuò)增的肺癌上皮細(xì)胞呈2d生長，避免了類器官技術(shù)擴(kuò)增出現(xiàn)的類器官大小不均一和生長過大的類器官出現(xiàn)內(nèi)部壞死等情況。
[0046]
另一方面，由本發(fā)明的原代肺癌上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的肺癌上皮細(xì)胞、特別是肺癌腫瘤細(xì)胞，能夠用于藥物的療效評估和篩選，所述方法包括以下步驟：
[0047]
(1)獲取原代肺癌上皮細(xì)胞，特別優(yōu)選獲取源自肺癌患者的癌組織樣本或活檢癌組織樣本，分離得到原代肺癌上皮細(xì)胞，根據(jù)如上所述的原代肺癌上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法培
養(yǎng)并擴(kuò)增原代肺癌上皮細(xì)胞(特別是原代肺癌腫瘤細(xì)胞)達(dá)至少105數(shù)量級、優(yōu)選至少106數(shù)量級的細(xì)胞數(shù)目。
[0048]
(2)選定需要檢測的藥物。
[0049]
(3)藥物以其最大血漿濃度c
max
為參考，以2-5倍c
max
為起始濃度，稀釋多個不同的藥物濃度梯度，例如5-10個、優(yōu)選6-8個藥物濃度梯度。
[0050]
(4)將步驟(1)中培養(yǎng)得到的肺癌上皮細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，用流式圖像計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，用本發(fā)明的原代細(xì)胞培養(yǎng)基將單細(xì)胞懸液稀釋，按每孔2000-4000個的密度將稀釋后的細(xì)胞懸液均勻地加入到多孔板內(nèi)，例如每孔50μl細(xì)胞稀釋液，并進(jìn)行過夜貼壁。
[0051]
該步驟避免了細(xì)胞重編程技術(shù)出現(xiàn)的由于飼養(yǎng)細(xì)胞的存在而干擾原代細(xì)胞計(jì)數(shù)和后續(xù)的原代細(xì)胞活力檢測的問題，也無需像類器官技術(shù)一樣，在冰上將細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠混合包埋再鋪板的繁瑣步驟，從而大大簡化了操作流程，增強(qiáng)了技術(shù)的可操作性和實(shí)用性。由于接種的細(xì)胞為單細(xì)胞懸液而不是像類器官一樣的3d結(jié)構(gòu)，所以該技術(shù)與類器官技術(shù)相比，鋪板的細(xì)胞數(shù)更加均一，鋪板產(chǎn)生的孔間細(xì)胞數(shù)差異小，也更適合進(jìn)行后續(xù)的高通量藥物篩選操作。
[0052]
(5)采用高通量自動化工作站，對步驟(4)中得到的貼壁細(xì)胞添加梯度稀釋后的所選定的傳統(tǒng)化療藥物、靶向藥物、抗體藥物或幾種藥物組合等候選藥物，進(jìn)行處理。
[0053]
(6)加藥處理數(shù)小時(shí)后，例如72小時(shí)后，采用cell-titer glo發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(購自promega公司)檢測肺癌上皮細(xì)胞的存活率，進(jìn)行藥物活性篩選。
[0054]
具體而言，向每孔加入例如10μl cell titer-glo試劑(購自promega公司)，均勻震蕩后，用熒光酶標(biāo)儀測量各孔的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)測得的數(shù)值，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，應(yīng)用graphpad prism軟件繪制藥物量-效曲線，計(jì)算各個藥物對所測試細(xì)胞的增殖的抑制強(qiáng)度。
[0055]
在本發(fā)明的原代肺癌腫瘤細(xì)胞在藥物篩選和體外藥物敏感性檢測的應(yīng)用中，由于不是細(xì)胞共培養(yǎng)體系，所以不會出現(xiàn)細(xì)胞重編程技術(shù)中的飼養(yǎng)細(xì)胞干擾檢測結(jié)果的現(xiàn)象。由于細(xì)胞呈2d生長，與藥物的作用時(shí)間也比類器官技術(shù)的藥物檢測時(shí)間短(類器官技術(shù)的平均給藥時(shí)間為6天)。
[0056]
本發(fā)明的有益效果還包括：
[0057]
(1)提高原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，成功率達(dá)到80％以上；
[0058]
(2)保證體外原代培養(yǎng)的肺癌上皮細(xì)胞能夠保持原代細(xì)胞來源病人的病理表型和異質(zhì)性；
[0059]
(3)所培養(yǎng)的原代肺癌上皮細(xì)胞不受成纖維細(xì)胞干擾，能得到純化的肺癌上皮細(xì)胞；
[0060]
(4)培養(yǎng)基成分不含血清，所以不受不同批次血清質(zhì)量和數(shù)量的影響；
[0061]
(5)擴(kuò)增肺癌上皮細(xì)胞效率高，只要有104級別的細(xì)胞數(shù)量就可在兩周左右時(shí)間內(nèi)成功擴(kuò)增出106數(shù)量級的肺癌上皮細(xì)胞，擴(kuò)增出的肺癌上皮細(xì)胞還可以連續(xù)傳代；
[0062]
(6)傳代步驟無需冰上操作和解離基質(zhì)膠，10-15分鐘內(nèi)即可完成細(xì)胞的消化傳代；
[0063]
(7)培養(yǎng)成本可控：原代肺癌細(xì)胞培養(yǎng)基無需加入價(jià)格昂貴的wnt激動劑、r-spondin家族蛋白、bmp抑制劑等因子，是對已有原代肺癌上皮細(xì)胞類器官培養(yǎng)基的簡化和
改進(jìn)，細(xì)胞接種也無需使用濃度較高的細(xì)胞外基質(zhì)與原代細(xì)胞混合形成膠滴，而只需使用少量細(xì)胞外基質(zhì)膠制備的稀釋液，節(jié)約了成本較高的細(xì)胞外基質(zhì)的用量；
[0064]
(8)操作便捷，該技術(shù)相比條件重編程技術(shù)，無需培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞并對飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行輻射，避免了不同批次飼養(yǎng)細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量影響原代細(xì)胞培養(yǎng)效率的問題，藥物篩選的鋪板和檢測的對象只有原代肺癌上皮細(xì)胞，而不受細(xì)胞條件重編程技術(shù)所需的共培養(yǎng)體系中飼養(yǎng)細(xì)胞的干擾；相比類器官技術(shù)，本發(fā)明采用的細(xì)胞外基質(zhì)膠的包被方法，培養(yǎng)器皿可預(yù)先準(zhǔn)備，無需像類器官技術(shù)一樣將細(xì)胞包埋于基質(zhì)膠內(nèi)，所述技術(shù)操作步驟簡便易行；
[0065]
(9)所述技術(shù)培養(yǎng)獲得的肺癌上皮細(xì)胞數(shù)量大，均一化程度高，適合高通量篩選新候選化合物，并為病人提供高通量藥物體外敏感性功能測試。
[0066]
采用本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)基，可培養(yǎng)來源于包括人的或其他哺乳動物的肺癌上皮細(xì)胞，包括肺癌腫瘤細(xì)胞、正常肺上皮細(xì)胞、肺癌上皮干細(xì)胞、或者包含這些細(xì)胞中的至少任一種的組織。同時(shí)本發(fā)明技術(shù)的培養(yǎng)基還可以用于開發(fā)體外肺癌原代細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的試劑盒。
[0067]
另外，通過本實(shí)施方式的培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞可應(yīng)用于再生醫(yī)療、肺癌上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究、藥物應(yīng)答的篩選、以及來源于肺癌疾病的新藥研發(fā)等。
附圖說明
[0068]
圖1a-1d為顯示培養(yǎng)基中不同因子對肺癌原代細(xì)胞增殖的影響的圖。
[0069]
圖2是顯示培養(yǎng)基中不同因子遞增對肺癌原代細(xì)胞增殖的影響的圖。
[0070]
圖3a-3h是顯示各添加因子的濃度對肺癌原代細(xì)胞增殖的影響的圖。
[0071]
圖4a和4b是將從1例肺癌臨床組織樣本分離得到的細(xì)胞采用本發(fā)明的培養(yǎng)基flm分別培養(yǎng)至第4天和第12天的肺癌腫瘤細(xì)胞在倒置顯微鏡下拍攝的照片。
[0072]
圖5a-5d是從1例肺癌手術(shù)切除樣本分離得到的細(xì)胞采用四種不同培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)12天后在倒置顯微鏡下拍攝的照片。
[0073]
圖6是從9例肺癌手術(shù)切除樣本分離得到的細(xì)胞在四種不同培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)16天后得到細(xì)胞增殖效果的比較圖。
[0074]
圖7是將從1例肺癌臨床組織樣本分離得到的細(xì)胞分別采用四種不同培養(yǎng)基條件培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞生長曲線對比圖。
[0075]
圖8是從1例肺癌手術(shù)切除樣本分離得到的細(xì)胞采用本發(fā)明的培養(yǎng)基flm培養(yǎng)獲得的肺癌腫瘤細(xì)胞的免疫組化結(jié)果對比圖。
[0076]
圖9是將從1例肺癌臨床組織樣本分離得到的細(xì)胞分別在本發(fā)明的培養(yǎng)基flm以及刪減不同組分后得到的培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的生長曲線對比圖。
[0077]
圖10是將從1例肺癌臨床組織樣本分離得到的細(xì)胞分別在本發(fā)明的培養(yǎng)基flm以及刪減不同組分后得到的培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)8天后，分別收集細(xì)胞計(jì)數(shù)后的比較圖。
[0078]
圖11a和11b分別表示從兩個不同的肺癌患者的手術(shù)切除癌組織樣本采用本發(fā)明的培養(yǎng)基flm培養(yǎng)的原代肺癌腫瘤細(xì)胞對不同化療藥物和靶向藥物的劑量-效應(yīng)曲線。
具體實(shí)施方式
[0079]
本說明書中，上皮細(xì)胞包括從上皮組織獲取的已分化的上皮細(xì)胞及上皮干細(xì)胞。“上皮干細(xì)胞”是指具有長期的自我更新能力和向上皮細(xì)胞分化的細(xì)胞，是指來源于上皮組織的干細(xì)胞。作為上皮組織，可例舉例如角膜、口腔粘膜、皮膚、結(jié)膜、膀胱、腎小管、腎臟、消化器官(食道、胃、十二指腸、小腸(包括空腸及回腸)、大腸(包括結(jié)腸))、肝臟、胰臟、乳腺、唾液腺、淚腺、前列腺、毛根、氣管、肺等。其中，本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)基較好是用于培養(yǎng)來源于肺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基。
[0080]
此外，本說明書中，“上皮腫瘤細(xì)胞”是指來源于上述的上皮組織的細(xì)胞腫瘤化而得的細(xì)胞。
[0081]
本說明書中，“類器官”是指通過使細(xì)胞在受控的空間內(nèi)高密度地自發(fā)組織和聚集而成的三維立體的、類似于器官的細(xì)胞組織體。
[0082]
[mst1/2激酶抑制劑的制備實(shí)施例]
[0083]
本說明書中，mst1/2激酶抑制劑是指直接或間接地對mst1/2信號傳導(dǎo)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)的任意的抑制劑。一般來說，mst1/2激酶抑制劑例如與mst1/2激酶結(jié)合并降低其活性。由于mst1和mst2的結(jié)構(gòu)具有相似性，mst1/2激酶抑制劑也可以是例如與mst1或mst2結(jié)合并降低其活性的化合物。
[0084]
1.mst1/2激酶抑制劑化合物1的制備
[0085]
4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氫蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺1
[0086][0087]
2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(a2)：在圓底燒瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸(2.0克)后加入甲醇(30毫升)，隨后冰浴下滴加二氯亞砜(1.2毫升)。反應(yīng)體系在85℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，體系在減壓下蒸干溶劑，所得白固體，直接用于下一步。
[0088]
2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(a3)：在圓底燒瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2克)后加入丙酮(30毫升)和碳酸鉀(2.2克)，然后用冰鹽浴使體系冷卻到-10℃，接著緩慢加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.1克)的丙酮溶液。反應(yīng)體系在室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濾液在減壓下除去溶劑，殘留物經(jīng)加壓硅膠柱層析提純后得化合物a3。lc/ms：m+h 359.0。
[0089]
2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氫蝶啶-6(5h)-酮(a4)：在圓底燒瓶中加入2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2.5克)后加入醋酸(50毫升)和鐵粉(3.9克)。反應(yīng)體系在60℃攪拌兩小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，體系在減壓下蒸干溶劑，所得物用飽和碳酸氫鈉中和至堿性。乙酸乙酯萃取，有機(jī)相分別用水、飽和食鹽水洗滌后用無水硫酸鈉干燥。有機(jī)相經(jīng)過濾，減壓蒸干后得粗品。粗品經(jīng)乙醚洗滌后得化合物a4。lc/ms：m+h 297.0。
[0090]
2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氫蝶啶-6(5h)-酮(a5)：在圓底燒瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氫蝶啶-6(5h)-酮(2克)和n,n-二甲基乙酰胺(10毫升)，冷卻至-35℃，加入(0.9毫升)，隨后加入氫化鈉(615毫克)，反應(yīng)體系繼續(xù)攪拌兩小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加水淬滅，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相分別用水、飽和食鹽水洗滌后用無水硫酸鈉干燥。有機(jī)相經(jīng)過濾，減壓蒸干后得粗品。粗品經(jīng)乙醚洗滌后得化合物a5。lc/ms：m+h 325.0。
[0091]
4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氫蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(1)：在圓底燒瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氫蝶啶-6(5h)-酮(100毫克)、磺胺(53毫克)、對甲苯磺酸(53毫克)和仲丁醇(5毫升)。反應(yīng)體系在120℃攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，甲醇和乙醚洗滌得化合物1。lc/ms：m+h 461.1。
[0092]
2.本發(fā)明的其他mst1/2抑制劑化合物的制備
[0093]
本發(fā)明的其他mst1/2抑制劑化合物按照與化合物1類似的方法合成，其結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下表所示。
[0094]
[0095]
[0096]
[0097]
[0098][0099]
[實(shí)施例1]
[0100]
人原代肺癌上皮細(xì)胞的分離
[0101]
肺癌組織樣本來源于進(jìn)行過說明并獲得同意的肺癌腫瘤患者手術(shù)切除癌組織樣本。下面以其中一例樣本(編號b4)進(jìn)行說明。
[0102]
在患者手術(shù)切除或活檢后的半小時(shí)內(nèi)進(jìn)行上述組織樣本的收集。更具體而言，在無菌環(huán)境下，切取非壞死部位的組織樣本，其體積在0.5cm3以上，將其置于預(yù)冷的4ml組織運(yùn)輸液(具體配制見表1)中，運(yùn)輸液盛在5ml塑料無菌帶蓋凍存管(購自廣州潔特生物)內(nèi)，冷鏈(0-10℃)運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。
[0103]
表1組織運(yùn)輸液配方
[0104]
組織運(yùn)輸液成分供應(yīng)商終濃度dmem/f12康寧97.8體積％primocininvivogen0.2體積％(市售產(chǎn)品濃度50mg/ml)
化合物1自制3μm
[0105]
表2組織消化液配方
[0106]
組織消化液成分供應(yīng)商終濃度hbssgibco50％(體積)rpmi-1640康寧50％(體積)膠原酶ⅱsigma2mg/ml膠原酶ⅳsigma2mg/ml脫氧核糖核酸ⅰsigma50u/ml透明質(zhì)酸酶sigma0.5mg/ml氯化鈣上海生工0.33mg/ml牛血清白蛋白上海生工10mg/ml
[0107]
在生物安全柜內(nèi)，將組織樣本(編號b4)轉(zhuǎn)移至100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(購自nest公司)內(nèi)，用組織運(yùn)輸液潤洗組織樣本，將組織樣本表面的殘留的血液清洗掉，并剔除組織樣本表面的脂肪等多余的組織。將潤洗后的組織樣本轉(zhuǎn)移至另一個新的100mm培養(yǎng)皿內(nèi)，加入2ml運(yùn)輸液，用無菌手術(shù)刀片和手術(shù)鑷將組織樣本分割為體積小于3mm3的組織碎塊。
[0108]
將組織樣本碎塊轉(zhuǎn)移至15ml離心管內(nèi)，用臺式離心機(jī)(sigma公司3-18k)以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心4分鐘；棄上清，按1:1比例加入組織運(yùn)輸液和組織消化液(使用量約為每10mg組織使用5ml組織消化液，具體配制見表2)，標(biāo)記樣本編號，封口膜密封，以37℃、300轉(zhuǎn)恒溫?fù)u床(知楚儀器zqly-180n)消化，每間隔1小時(shí)觀察消化是否完成。
[0109]
消化完成后，70μm濾網(wǎng)過濾掉未消化的組織團(tuán)塊，濾網(wǎng)上的組織團(tuán)塊用組織運(yùn)輸液沖洗，將殘留細(xì)胞沖入離心管中，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心4分鐘。
[0110]
棄上清，觀察剩余細(xì)胞團(tuán)是否含有血細(xì)胞，若有血細(xì)胞，加3ml血細(xì)胞裂解液(購自sigma公司)，混勻，4℃裂解15分鐘，5分鐘搖晃混勻一次，裂解結(jié)束后取出，以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心4分鐘。棄上清，得到消化分離后的肺癌原代細(xì)胞，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基(bm)重懸，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基是由市售的dmem/f-12培養(yǎng)基中加入0.2體積％primocin(購自invivogen公司，濃度為50mg/ml)，以得到100μg/ml的最終濃度。使用流式圖像計(jì)數(shù)儀(江蘇卓微生物科技有限公司jimbio fil)進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞總數(shù)為121萬。
[0111]
[實(shí)施例2]
[0112]
原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基的優(yōu)化
[0113]
(1)不同因子的作用
[0114]
將細(xì)胞外基質(zhì)膠(bd生物科技公司制)使用無血清dmem/f12培養(yǎng)基按1:100比例稀釋，配制成細(xì)胞外基質(zhì)稀釋液，在48孔培養(yǎng)板內(nèi)加入500μl/孔的細(xì)胞外基質(zhì)稀釋液使其完全覆蓋培養(yǎng)板孔的底部。在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置1小時(shí)。1小時(shí)后，移除細(xì)胞外基質(zhì)稀釋液，得到包被有matrigel的培養(yǎng)板。
[0115]
配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基(縮寫為bm)：向市售的dmem/f-12培養(yǎng)基中加入0.2體積％primocin(購自invivogen公司，濃度為50mg/ml)，以得到100μg/ml的最終濃度，配制得到bm。
[0116]
接著，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(bm)中分別加入不同種類和不同濃度的添加劑因子(表3)，配
制成含有不同添加成分的肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0117]
表3不同組分培養(yǎng)基的配制(濃度為終濃度)
[0118][0119][0120]
將不同成分的培養(yǎng)基按500μl/孔體積加入至包被有細(xì)胞外基質(zhì)膠(matrigel)的48孔板內(nèi)。將按照實(shí)施例1相同方法從肺癌組織分離得到的肺癌腫瘤細(xì)胞(編號b5)以2
×
104個/cm2的細(xì)胞密度接種在matrigel包被過的48孔培養(yǎng)板內(nèi)，表面消毒后置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱(購自賽默飛)，使相同數(shù)量的新鮮分離的肺癌腫瘤細(xì)胞(編號b5)在不同的培養(yǎng)基配方條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后每4天進(jìn)行一次培養(yǎng)基的更換。培養(yǎng)12天后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。其中，作為實(shí)驗(yàn)對照，使用未添加任何添加劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(bm)。將結(jié)果示于圖1a-d。圖中縱坐標(biāo)表示不同培養(yǎng)基培養(yǎng)之后得到的細(xì)胞數(shù)與基礎(chǔ)培養(yǎng)基bm培養(yǎng)之后得到細(xì)胞數(shù)的比值。如圖所示，在bm基礎(chǔ)上加入表3中不同濃度的不同因子對細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同的作用。其中，在特定濃度范圍下，b27添加劑、n2添加劑、成纖維細(xì)胞生長因子7、白介素6、肝細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子1、化合物1、y27632和a83-01均對細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用。
[0121]
(3)培養(yǎng)基中不同因子遞增對本專利方法獲得的肺癌原代細(xì)胞增殖的影響
[0122]
將細(xì)胞外基質(zhì)膠(購自bd生物科技公司)使用無血清dmem/f12培養(yǎng)基按1:100比例稀釋，配制成細(xì)胞外基質(zhì)稀釋液。在48孔培養(yǎng)板內(nèi)加入500μl/孔的細(xì)胞外基質(zhì)稀釋液使其完全覆蓋培養(yǎng)板孔的底部。在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置1小時(shí)。1小時(shí)后，移除細(xì)胞外基質(zhì)稀釋液，得到包被有matrigel的培養(yǎng)板。
[0123]
向基礎(chǔ)培養(yǎng)基bm中分別依次遞加不同小分子、添加劑以及生長因子(表4)，配制成含有不同添加成分的肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0124]
表4不同組分培養(yǎng)基的配制(濃度為終濃度)
[0125]
培養(yǎng)基no.組分no.1bm+10μm y27632no.2no.1+5μm化合物1no.3no.2+1:50b27添加劑no.4no.3+40ng/ml成纖維細(xì)胞生長因子7no.5no.4+40ng/ml肝細(xì)胞生長因子no.6no.5+40ng/ml胰島素樣生長因子1no.7no.6+500nm a83-01no.8no.7+20ng/ml白介素6
[0126]
將不同成分的培養(yǎng)基按500μl/孔體積加入至包被有細(xì)胞外基質(zhì)膠(matrigel)的48孔板內(nèi)，同時(shí)將bm培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)對照。將按照實(shí)施例1的方法從肺癌組織分離得到的肺癌腫瘤細(xì)胞(編號b5)以2
×
104個/cm2的細(xì)胞密度接種在matrigel包被過的48孔培養(yǎng)板內(nèi)，表面消毒后置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱(購自賽默飛)，使相同數(shù)量的新鮮分離的肺癌腫瘤細(xì)胞(編號b5)在不同的培養(yǎng)基配方條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)10天后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖2。如圖所示，確定no.8為本專利最優(yōu)選的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)擴(kuò)增肺癌原代細(xì)胞(下文縮寫為flm)。
[0127]
(4)所添加因子的不同濃度對本專利獲得的肺癌原代細(xì)胞的增殖作用
[0128]
將細(xì)胞外基質(zhì)膠(bd生物科技公司制)使用無血清dmem/f12培養(yǎng)基按1:100比例稀釋，配制成細(xì)胞外基質(zhì)稀釋液，在48孔培養(yǎng)板內(nèi)加入200μl/孔的細(xì)胞外基質(zhì)稀釋液使其完全覆蓋培養(yǎng)板孔的底部。在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置1小時(shí)。1小時(shí)后，移除細(xì)胞外基質(zhì)稀釋液，得到包被有matrigel的培養(yǎng)板。
[0129]
配制本發(fā)明的原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基(縮寫為flm)：向基礎(chǔ)培養(yǎng)基(bm)中以最終濃度40ng/ml的條件添加成纖維細(xì)胞生長因子7(fgf7)，以最終濃度40ng/ml的條件添加肝細(xì)胞生長因子(hgf)，以最終濃度40ng/ml的條件添加胰島素樣生長因子1(igf-1)，以最終濃度1:50體積比的條件添加b27添加劑，以最終濃度5μm的條件添加化合物1，以最終濃度10μm的條件添加y27632，以最終濃度500nm的條件添加tgfβ1抑制劑a83-01，以最終濃度20ng/ml的條件添加白介素6(il-6)，制備原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0130]
使用與實(shí)施例1同樣的方法從肺癌患者的癌組織(編號b6)中分離獲得癌組織來源的肺癌上皮細(xì)胞。接著，將癌組織來源的肺癌上皮細(xì)胞用流式圖像計(jì)數(shù)儀(江蘇卓微生物科技有限公司jimbio fil)進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞總數(shù)。然后按4
×
104個/cm2密度接種至(購自bd生物科技公司)包被處理過的48孔板內(nèi)。向48孔板中添加2ml制備好的原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基flm，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱(購自賽默飛)中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞生長達(dá)到底面積的80％左右時(shí)，棄去48孔板內(nèi)的培養(yǎng)基上清，加入500μl 0.05％胰酶(購自gibco公司)對細(xì)胞進(jìn)行消化，37℃下孵育10分鐘，直至顯微鏡(invitrogen公司evos m500)下能觀察到細(xì)胞已經(jīng)消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清(購自依科賽公司)、100u/ml青霉素(購自康寧公司)和100μg/ml鏈霉素(購自康寧公司)的dmem/f12培養(yǎng)液1ml終止消化，并收集至15ml離心管內(nèi)，1500rpm離心4分鐘后，棄上清。使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基bm重
懸離心后的細(xì)胞沉淀，使用流式圖像計(jì)數(shù)儀(江蘇卓微生物科技有限公司jimbio fil)進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞總數(shù)。所得細(xì)胞用于以下培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
[0131]
接著，配制以下8種配方培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：
[0132]
配方1：培養(yǎng)基flm組分中不含b27添加劑；
[0133]
配方2：培養(yǎng)基flm組分中不含成纖維細(xì)胞生長因子7；
[0134]
配方3：培養(yǎng)基flm組分中不含胰島素樣生長因子1；
[0135]
配方4：培養(yǎng)基flm組分中不含肝細(xì)胞生長因子；
[0136]
配方5：培養(yǎng)基flm組分中不含y27632；
[0137]
配方6：培養(yǎng)基flm組分中不含化合物1；
[0138]
配方7：培養(yǎng)基flm組分中不含a83-01；
[0139]
配方8：培養(yǎng)基flm組分中不含白介素6。
[0140]
分別使用上述配方1～8來稀釋上述消化后的細(xì)胞懸液，按照每孔1萬細(xì)胞，250微升體積種入48孔板中。
[0141]
在使用配方1的培養(yǎng)基時(shí)，在接種有原代細(xì)胞的48孔板中分別添加配制好的b27添加劑每孔250微升，b27添加劑的終濃度分別為1:800、1:400、1:200、1:100、1:50、1:25；并使用配方1的培養(yǎng)基設(shè)置對照孔(bc)。
[0142]
在使用配方2的培養(yǎng)基時(shí)，在接種有原代細(xì)胞的48孔板中分別添加配制好的成纖維細(xì)胞生長因子7每孔250微升，成纖維細(xì)胞生長因子7的終濃度分別為160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml；并使用配方2的培養(yǎng)基設(shè)置對照孔(bc)。
[0143]
在使用配方3的培養(yǎng)基時(shí)，在接種有原代細(xì)胞的48孔板中分別添加配制好的胰島素樣生長因子1每孔250微升，胰島素樣生長因子1的終濃度分別為160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml；并使用配方3的培養(yǎng)基設(shè)置對照孔(bc)。
[0144]
在使用配方4的培養(yǎng)基時(shí)，在接種有原代細(xì)胞的48孔板中分別添加配制好的肝細(xì)胞生長因子每孔250微升，肝細(xì)胞生長因子的終濃度分別為160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml；并使用配方4的培養(yǎng)基設(shè)置對照孔(bc)。
[0145]
在使用配方5的培養(yǎng)基時(shí)，在接種有原代細(xì)胞的48孔板中分別添加配制好的y27632每孔250微升，y27632的終濃度分別為20μm、15μm、12.5μm、10μm、5μm、2.5μm；并使用配方5的培養(yǎng)基設(shè)置對照孔(bc)。
[0146]
在使用配方6的培養(yǎng)基時(shí)，在接種有原代細(xì)胞的48孔板中分別添加配制好的化合物1每孔250微升，化合物1的終濃度分別為20μm、10μm、7.5μm、5μm、2.5μm、1.25μm；并使用配方6的培養(yǎng)基設(shè)置對照孔(bc)。
[0147]
在使用配方7的培養(yǎng)基時(shí)，在接種有原代細(xì)胞的48孔板中分別添加配制好的a83-01每孔250微升，a83-01的終濃度分別為2000nm、1000nm、500nm、250nm、125nm、62.5nm；并使用配方7的培養(yǎng)基設(shè)置對照孔(bc)。
[0148]
在使用配方8的培養(yǎng)基時(shí)，在接種有原代細(xì)胞的48孔板中分別添加配制好的白介素6每孔250微升，白介素6的終濃度分別為80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml；并使用配方8的培養(yǎng)基設(shè)置對照孔(bc)。
[0149]
待細(xì)胞擴(kuò)增至48孔的85％左右消化計(jì)數(shù)，分別參比對照孔(bc)細(xì)胞數(shù)計(jì)算比值，將結(jié)果分別示于圖3a～3h。圖3a～圖3h中，比值為使用各培養(yǎng)基培養(yǎng)一代得到的細(xì)胞數(shù)與
對應(yīng)的對照孔培養(yǎng)一代得到的細(xì)胞數(shù)的比。比值大于1說明配制的含不同濃度的因子或小分子化合物的培養(yǎng)基促增殖效果優(yōu)于對照孔培養(yǎng)基，比值小于1，則說明配制的含不同濃度的因子或小分子化合物的培養(yǎng)基促增殖效果較對照孔培養(yǎng)基促增殖效果弱。
[0150]
根據(jù)圖3a～3h的結(jié)果，b27添加劑在培養(yǎng)基中的體積濃度優(yōu)選為1:25～1:800，更優(yōu)選1:25～1:200，進(jìn)一步優(yōu)選1:50～1:100；成纖維細(xì)胞生長因子7的含量優(yōu)選為5ng/ml～160ng/ml，更優(yōu)選10ng/ml～80ng/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為20ng/ml～40ng/ml；胰島素樣生長因子1的含量優(yōu)選為5ng/ml～160ng/ml，更優(yōu)選為20ng/ml～80ng/ml；肝細(xì)胞生長因子的含量優(yōu)選為5ng/ml～160ng/ml，更優(yōu)選20ng/ml～80ng/ml；y27632的含量優(yōu)選為2.5μm～15μm，更優(yōu)選為5μm～15μm，進(jìn)一步優(yōu)選為10μm～12.5μm；化合物1的含量優(yōu)選為2.5μm～10μm，更優(yōu)選為5μm～7.5μm；a83-01的含量優(yōu)選為62.5nm～500nm，更優(yōu)選為250nm～500nm；白介素6的含量優(yōu)選為2.5ng/ml～40ng/ml，更優(yōu)選為5ng/ml～40ng/ml。
[0151]
[實(shí)施例3]
[0152]
肺癌組織來源的原代肺癌腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)
[0153]
使用與實(shí)施例1同樣的方法從肺癌患者的癌組織(樣本編號b7)中分離獲得癌組織來源的肺癌上皮細(xì)胞。接著，將癌組織來源的肺癌上皮細(xì)胞用流式圖像計(jì)數(shù)儀(江蘇卓微生物科技有限公司jimbio fil)進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞總數(shù)。然后按4
×
104個/cm2密度接種至(購自bd生物科技公司)包被處理過的12孔板內(nèi)。向12孔板中添加2ml制備好的原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基flm，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱(購自賽默飛)中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0154]
圖4a是本實(shí)施例按4
×
104個/cm2密度接種至matrigel包被處理過的12孔板，自接種開始后培養(yǎng)至第4天的鏡下照片(40倍倒置相差顯微鏡拍照)。鏡下觀察可見，所培養(yǎng)的癌組織來源的原代肺癌腫瘤細(xì)胞純度較高，不含有成纖維細(xì)胞。圖4b是本實(shí)施例自接種后培養(yǎng)第12天的鏡下照片(40倍倒置相差顯微鏡拍照)。從圖4a和4b兩張圖可以看出，分離后得到肺癌原代細(xì)胞在體外培養(yǎng)4天在鏡下就可以看到明顯的克隆形成，并且經(jīng)過12天的擴(kuò)增，細(xì)胞數(shù)目得到顯著的擴(kuò)增，提示本發(fā)明技術(shù)是一種高效的體外擴(kuò)增肺癌上皮細(xì)胞的技術(shù)。
[0155]
[實(shí)施例4]
[0156]
不同培養(yǎng)基對肺癌組織來源的原代肺癌腫瘤細(xì)胞的促增殖效果
[0157]
(1)不同培養(yǎng)基對初代原代細(xì)胞克隆形成的影響和增殖效果的比較
[0158]
使用與實(shí)施例2同樣的方法制備原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基flm，和作為對照的基礎(chǔ)培養(yǎng)基bm。另外制備細(xì)胞條件重編程培養(yǎng)基fm作為另一對照例，配制步驟參見(liu等，nat protoc.，12(2):439-451，2017)，培養(yǎng)基配方見表5。此外，作為另一對照例，自stem cell公司購買商品化培養(yǎng)基epimcult
tm plus medium，以下也稱“epim培養(yǎng)基”，培養(yǎng)基配方見表6。
[0159]
表5細(xì)胞條件重編程培養(yǎng)基(fm)成分
[0160]
培養(yǎng)基成分供應(yīng)商終濃度dmem培養(yǎng)基corning65體積％胎牛血清gibico10體積％ham’s f12營養(yǎng)液gibico25體積％氫化可的松sigma-aldrich25ng/ml表皮生長因子r&d0.125ng/ml
胰島素sigma-aldrich5μg/ml兩性霉素bsigma-aldrich250ng/ml慶大霉素gibico10μg/ml毒素sigma-aldrich0.1nmy27632enzo10μm
[0161]
表6商品化培養(yǎng)基epimcult
tm plus medium(epim)成分
[0162][0163][0164]
使用與實(shí)施例1同樣的方法獲得肺癌組織來源的原代肺癌腫瘤細(xì)胞(編號b8)。接著，按照相同的密度(4
×
104個/cm2)分別在以下五種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)：
[0165]
a.本發(fā)明技術(shù)：按4
×
104個/cm2接種密度將原代肺癌腫瘤細(xì)胞接種至((bd生物科技公司制)包被處理過的24孔板內(nèi)，采用2ml的本發(fā)明的原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基flm進(jìn)行培養(yǎng)；
[0166]
b.細(xì)胞條件重編程技術(shù)：按4
×
104個/cm2接種密度將原代肺癌腫瘤細(xì)胞接種至鋪有受γ射線輻照過后的小鼠成纖維細(xì)胞系j2細(xì)胞(購自kerafast公司)上，采用細(xì)胞條件重編程技術(shù)培養(yǎng)基fm在24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)(具體步驟參見liu等，am j pathol，183(6):1862-1870，2013)；
[0167]
c.按4
×
104個/cm2接種密度將原代肺癌腫瘤細(xì)胞接種至((bd生物科技公司制)包被處理過的24孔板內(nèi)，采用2ml的商品化培養(yǎng)基epim在24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0168]
d.按4
×
104個/cm2接種密度將原代肺癌腫瘤細(xì)胞接種至((bd生物科技公司制)包被處理過的24孔板內(nèi)，采用2ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基bm在24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0169]
上述四種培養(yǎng)中，每4天對四種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行換液。同時(shí)觀察24孔板中各培養(yǎng)基培養(yǎng)下細(xì)胞形成克隆和細(xì)胞增殖狀態(tài)，使用顯微鏡(invitrogen公司evos m500)進(jìn)行拍照記錄細(xì)胞生長狀況。
[0170]
對于采用本發(fā)明技術(shù)培養(yǎng)的原代肺癌腫瘤細(xì)胞(編號b8)，分別在培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞生長達(dá)到底面積的80％左右時(shí)，棄去24孔板內(nèi)的培養(yǎng)基上清，加入500μl 0.05％胰酶(購自gibco公司)對細(xì)胞進(jìn)行消化，37℃下孵育10分鐘，直至顯微鏡(invitrogen公司evos m500)下能觀察到細(xì)胞已經(jīng)消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)液1ml終止消化，并收集至15ml離心管內(nèi)，1500rpm離心4分鐘后，棄上清。使用本發(fā)明的培養(yǎng)基重懸離心后的細(xì)胞沉淀，使用流式圖像計(jì)數(shù)儀(江蘇卓微生物科技有限公司jimbio fil)進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞總數(shù)為46.4萬。另三種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的細(xì)胞采用如上述同樣的操作方式進(jìn)行消化和計(jì)數(shù)，使用培養(yǎng)基fm、epim和bm培養(yǎng)得到的細(xì)胞總數(shù)分別是35萬、11萬和6.8萬。
[0171]
圖5a-5d的細(xì)胞照片為編號b8的樣本在四種不同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至第12天時(shí)的鏡下照片(40倍倒置相差顯微鏡下)：其中圖5a為b8使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基bm培養(yǎng)至第12天時(shí)的鏡
下照片；圖5b為b8使用本專利培養(yǎng)基flm培養(yǎng)至第12天時(shí)的鏡下照片；圖5c為b8使用商品化培養(yǎng)基epim培養(yǎng)至第12天時(shí)的鏡下照片；圖5d為b8使用條件重編程培養(yǎng)基fm培養(yǎng)至第12天時(shí)的鏡下照片。從圖中可以看出，樣本b8使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基bm(圖5a)培養(yǎng)12天不能形成細(xì)胞克隆；使用epim(圖5c)培養(yǎng)12天僅形成少量細(xì)胞克隆，且細(xì)胞狀態(tài)不佳；使用條件重編程培養(yǎng)基fm(圖5d)培養(yǎng)12天細(xì)胞有一定擴(kuò)增，但是細(xì)胞密度和細(xì)胞數(shù)量均不及本專利培養(yǎng)基flm培養(yǎng)的效果明顯。
[0172]
圖6是9例肺癌病人樣本按照實(shí)施例1獲得的肺癌原代細(xì)胞在以上四種不同培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)16天后得到細(xì)胞增殖效果的比較圖，其中√代表有一般的克隆形成能力和促增殖效果，√√代表有較明顯的克隆形成能力和促增殖效果，√√√代表有較強(qiáng)的克隆形成能力和促增殖效果，
×
代表不能形成克隆。從圖6中可以確認(rèn)，本發(fā)明的培養(yǎng)基在對肺癌組織來源獲得的原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，克隆形成能力和促細(xì)胞增殖效果、以及培養(yǎng)成功率都較其他三種培養(yǎng)條件有明顯優(yōu)勢。
[0173]
(2)不同培養(yǎng)基對原代肺癌腫瘤細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)和生長曲線的繪制
[0174]
使用與本實(shí)施例(1)中同樣的方法獲得原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基flm，以及作為對照的培養(yǎng)基bm、fm和epim。
[0175]
使用與本實(shí)施例(1)中同樣的方法將肺癌組織來源的原代肺癌腫瘤細(xì)胞(編號b9)分別在四種培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)，并進(jìn)行消化傳代和計(jì)數(shù)。
[0176]
當(dāng)傳代后的細(xì)胞在培養(yǎng)板內(nèi)生長再次達(dá)到約80％板底面積時(shí)，再次按上述操作方法消化收集所培養(yǎng)獲得的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。同樣按4
×
104個/孔密度接種并持續(xù)培養(yǎng)。
[0177]
以下為原代肺癌上皮細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)(population doubling)的計(jì)算公式：
[0178]
population doubling(pd)＝3.32*log
10
(消化后細(xì)胞總數(shù)/初始種入細(xì)胞數(shù))，公式參見(chapman等.stem cell research&therapy 2014,5:60)。
[0179]
圖7是采用graphpad prism軟件繪制的四種不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞b9的生長曲線。橫坐標(biāo)表示細(xì)胞培養(yǎng)的天數(shù)，縱坐標(biāo)是累計(jì)的細(xì)胞增殖倍數(shù)，表示細(xì)胞在培養(yǎng)周期內(nèi)擴(kuò)增的倍數(shù)，數(shù)值越大表示細(xì)胞在一定周期內(nèi)擴(kuò)增的次數(shù)越多，即擴(kuò)增得到的細(xì)胞數(shù)也就越多，斜率代表的是細(xì)胞擴(kuò)增的速率。從圖中可以確認(rèn)本發(fā)明的培養(yǎng)基flm培養(yǎng)的肺癌上皮細(xì)胞的增殖速率優(yōu)于其他四種培養(yǎng)條件，同時(shí)可以確認(rèn)本發(fā)明的培養(yǎng)基可以對原代肺癌上皮細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng)，在擴(kuò)增至30天時(shí)速率仍保持不變。
[0180]
[實(shí)施例5]
[0181]
原代肺癌組織和傳代培養(yǎng)后的肺癌細(xì)胞免疫組化鑒定
[0182]
從一例肺癌患者的臨床手術(shù)切除樣本取出約綠豆粒大小的癌組織(樣本編號b12)，浸泡在1ml 4％多聚甲醛中固定。剩余癌組織使用與實(shí)施例1相同的方法獲得肺癌上皮細(xì)胞(樣本編號b12)。使用實(shí)施例3的方法采用本發(fā)明的培養(yǎng)基flm將樣本b12持續(xù)培養(yǎng)至第四代。
[0183]
采用免疫組化法檢測樣本b12原始組織和持續(xù)培養(yǎng)至第四代得到的原代細(xì)胞中與肺癌相關(guān)的重要生物標(biāo)記物的表達(dá)。4％多聚甲醛固定后的組織，經(jīng)石蠟包埋，用切片機(jī)切成4μm厚的組織切片。隨后進(jìn)行常規(guī)的免疫組織化學(xué)檢測(具體步驟參見li等，nature conmunication，(2018)9:2983)。所使用的一抗為ttf-1抗體(購自cst公司)和ki67抗體(購
自r&d公司)。
[0184]
由圖8可以確認(rèn)，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的肺癌腫瘤細(xì)胞(樣本編號b12)培養(yǎng)至第4代時(shí)，細(xì)胞上與肺癌相關(guān)的生物標(biāo)記物的表達(dá)情況與細(xì)胞來源的原始組織切片的標(biāo)記物表達(dá)情況基本一致。說明采用本發(fā)明的培養(yǎng)基所培養(yǎng)的細(xì)胞保持了肺癌病人癌組織的原始病理特性。
[0185]
[實(shí)施例6]
[0186]
培養(yǎng)基中去除單一因子對原代肺癌細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)的影響
[0187]
使用與實(shí)施例2同樣的方法制備原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基flm。作為對照，使用與實(shí)施例2同樣的方法制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基bm。另外按照表7制備其他8種不同培養(yǎng)基。
[0188]
表7不同培養(yǎng)基成分(濃度為終濃度)
[0189][0190]
使用與實(shí)施例1同樣的方法獲得一例肺癌組織來源的原代肺癌腫瘤細(xì)胞(編號
b13)。按4
×
104個/cm2接種密度將原代肺癌腫瘤細(xì)胞接種至(bd生物科技公司制)包被處理過的48孔板內(nèi)，采用2ml的本發(fā)明的原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基(flm)置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱(購自賽默飛)進(jìn)行培養(yǎng)。
[0191]
在培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞生長達(dá)到底面積的80％左右時(shí)，棄去48孔板內(nèi)的培養(yǎng)基上清，加入200μl 0.05％胰酶(購自gibco公司)對細(xì)胞進(jìn)行消化，37℃下孵育10分鐘，直至顯微鏡(invitrogen公司evos m500)下能觀察到細(xì)胞已經(jīng)消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)液800μl終止消化，并收集至15ml離心管內(nèi)，1500rpm離心4分鐘后，棄上清。使用本發(fā)明的培養(yǎng)基重懸離心后的細(xì)胞沉淀，使用流式圖像計(jì)數(shù)儀(江蘇卓微生物科技有限公司jimbio fil)進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞總數(shù)。按2
×
104個/cm2密度將細(xì)胞接種至另一包被有細(xì)胞外基質(zhì)膠的48孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0192]
在另8種培養(yǎng)基條件和bm培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的細(xì)胞采用如上述同樣的操作方式進(jìn)行消化傳代和計(jì)數(shù)，使用各自不同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0193]
當(dāng)傳代后的細(xì)胞在培養(yǎng)板內(nèi)生長再次達(dá)到約80％板底面積時(shí)，再次按上述操作方法消化收集所培養(yǎng)獲得的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。同樣按2
×
104個/cm2密度接種并持續(xù)培養(yǎng)。
[0194]
以下為原代肺癌上皮細(xì)胞在不同培養(yǎng)基條件下細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)(population doubling)的計(jì)算公式：
[0195]
population doubling(pd)＝3.32*log
10
(消化后細(xì)胞總數(shù)/初始種入細(xì)胞數(shù))，公式參見(chapman等.stem cell research&therapy 2014,5:60)。
[0196]
圖9是采用graphpad prism軟件繪制的十種不同培養(yǎng)基條件下的細(xì)胞生長曲線。橫坐標(biāo)表示細(xì)胞培養(yǎng)的天數(shù)，縱坐標(biāo)是累計(jì)的細(xì)胞增殖倍數(shù)，表示細(xì)胞在培養(yǎng)周期內(nèi)擴(kuò)增的倍數(shù)，數(shù)值越大表示細(xì)胞在一定周期內(nèi)擴(kuò)增的次數(shù)越多，即擴(kuò)增得到的細(xì)胞數(shù)也就越多，斜率代表的是細(xì)胞擴(kuò)增的速率。
[0197]
圖10所示是十種不同培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)8天后，收集細(xì)胞計(jì)數(shù)后作圖所得。
[0198]
由圖9和圖10的結(jié)果可知，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中單獨(dú)去除各種小分子和添加劑因子之后，細(xì)胞的增殖效果都有一定程度的減弱。這提示本發(fā)明的培養(yǎng)基中，這些組分都是細(xì)胞增殖和持續(xù)培養(yǎng)所必需的。
[0199]
[實(shí)施例7]
[0200]
癌組織來源的原代肺癌腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的異種移植成瘤實(shí)驗(yàn)
[0201]
使用與實(shí)施例1同樣的方法從一例病理診斷為肺癌患者的癌組織中分離獲得肺癌腫瘤細(xì)胞(編號b15)，按照實(shí)施例3的方法采用本發(fā)明的培養(yǎng)基flm對b15進(jìn)行培養(yǎng)，待肺癌腫瘤細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1
×
107個時(shí)，采用實(shí)施例4的方法對肺癌腫瘤細(xì)胞進(jìn)行消化，并收集。采用本發(fā)明的肺癌腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基flm和(購自bd生物科技公司)按照1:1混勻，并吸取100μl與matrigel混勻后的培養(yǎng)基將5
×
106個肺癌腫瘤細(xì)胞重懸，分別注射入6周大的雌性高度免疫缺陷小鼠(ncg)小鼠(購自南京模式動物研究所)的肺癌脂肪墊和右前肢腋下部位，每三天觀察一次肺癌腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)形成腫瘤的體積和生長速率。
[0202]
在腫瘤細(xì)胞接種后的第15天即可觀察到小鼠的兩處腫瘤細(xì)胞接種部位均有瘤體形成，自第15天起至第30天，小鼠體內(nèi)腫瘤增殖明顯。這說明采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法所培養(yǎng)的癌組織來源的肺癌腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)具有成瘤性。
[0203]
[實(shí)施例8]
[0204]
癌組織來源的肺癌腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性功能測試
[0205]
下面以肺癌患者手術(shù)切除樣本為例，說明由病人來源的肺癌腫瘤樣本培養(yǎng)得到的肺癌腫瘤細(xì)胞可以用于檢測病人腫瘤細(xì)胞對不同藥物的敏感性。
[0206]
一、原代肺癌腫瘤細(xì)胞的鋪板：按照實(shí)施例1中方法得到的分離后的肺癌腫瘤細(xì)胞(編號b13和編號b15)細(xì)胞懸液，按照4
×
104個/cm2密度接種至(購自bd生物科技公司)包被處理過的12孔板內(nèi)。向12孔板中添加2ml制備好的原代肺癌上皮細(xì)胞培養(yǎng)基flm，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱(購自賽默飛)中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞生長達(dá)到底面積的80％左右時(shí)，棄去12孔板內(nèi)的培養(yǎng)基上清，加入500μl 0.05％胰酶(購自gibco公司)對細(xì)胞進(jìn)行消化，37℃下孵育10分鐘，直至顯微鏡(invitrogen公司evos m500)下能觀察到細(xì)胞已經(jīng)消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)液1ml終止消化，并收集至15ml離心管內(nèi)，1500rpm離心4分鐘后，棄上清。使用flm培養(yǎng)基重懸離心后的細(xì)胞沉淀，使用流式圖像計(jì)數(shù)儀(江蘇卓微生物科技有限公司jimbio fil)進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞總數(shù)分別為83萬和76.8萬。按2000～4000個/孔密度接種于384孔板中，使細(xì)胞貼壁過夜。
[0207]
二、藥物梯度實(shí)驗(yàn)：
[0208]
(1)采用濃度梯度稀釋的方法配制藥物貯存板：分別吸取10μl的待測藥物母液(藥物母液濃度按2倍于該藥物在人體中的最大血藥濃度c
max
配制)，加入到含20μl的dmso的0.5ml的ep管中，再從上述ep管中吸取10μl到第二個已裝有20μl的dmso的0.5ml的ep管中，即按照1:3稀釋藥品。重復(fù)以上方法，依次稀釋，最后得到加藥所需的8種濃度。將不同濃度的藥物加入384孔藥物儲存板中。溶劑對照組各孔加入等體積的dmso作為對照。本實(shí)施例中，待測藥物為紫杉醇(購自mce公司)、吉西他濱(購自mce公司)、阿法替尼(購自mce公司)和厄洛替尼(購自mce公司)。
[0209]
(2)使用高通量自動化工作站(perkin elmer公司janus)將384孔藥物貯存板內(nèi)的不同濃度藥物和溶劑對照加入到鋪有肺癌腫瘤細(xì)胞的384孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，藥物組和溶劑對照組都各設(shè)3個復(fù)孔。每孔加入藥物體積為100nl。
[0210]
(3)細(xì)胞活性檢測：給藥72小時(shí)后，用cell titer-glo檢測試劑(購自promega公司)檢測加藥培養(yǎng)后細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光數(shù)值，化學(xué)發(fā)光數(shù)值的大小反映細(xì)胞活力以及藥物對細(xì)胞活力的影響，每孔加入10μl配制好的cell titer-glo檢測液，混勻后使用酶標(biāo)儀(perkin elmer公司envision)檢測化學(xué)發(fā)光數(shù)值。
[0211]
(4)細(xì)胞活性檢測：按照公式細(xì)胞存活率(％)＝加藥孔化學(xué)發(fā)光數(shù)值/對照孔化學(xué)發(fā)光數(shù)值*100％，計(jì)算得到不同藥物作用細(xì)胞后的細(xì)胞存活率，使用graphpad prism軟件作圖并計(jì)算半數(shù)抑制率ic
50
。
[0212]
(5)藥物敏感性測試結(jié)果如圖11所示。
[0213]
圖11a和11b分別表示從兩個不同的肺癌患者的手術(shù)切除癌組織樣本(編號b13和編號b15)所培養(yǎng)獲得的肺癌腫瘤細(xì)胞，對兩種化療藥物紫杉醇和吉西他濱的藥物敏感性、以及對兩種靶向藥物阿法替尼和厄洛替尼的藥物敏感性。其中圖11a為編號b13樣本培養(yǎng)獲得的肺癌細(xì)胞對四種藥物的敏感性測試結(jié)果；圖11b為編號b15樣本培養(yǎng)獲得的肺癌細(xì)胞對四種藥物的敏感性測試結(jié)果。結(jié)果顯示，同一病人的細(xì)胞對不同藥物具有不同的敏感性，不
同病人的細(xì)胞對同一藥物的敏感性也不同。
[0214]
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本說明書基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
技術(shù)特征：
1.一種用于培養(yǎng)原代肺癌上皮細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：含有mst1/2激酶抑制劑；選自y27632、法舒地爾、和h-1152中的至少一種的rock激酶抑制劑；成纖維細(xì)胞生長因子7；b27添加劑和n2添加劑中的至少一種添加劑；肝細(xì)胞生長因子；胰島素樣生長因子1；白介素6；選自a83-01、sb431542、repsox、sb505124、sb525334、sd208、ly36494、和sjn2511中的至少一種的tgfβi型受體抑制劑，其中，所述mst1/2激酶抑制劑包括式(i)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、或溶劑化物，其中，r1選自c1-c6烷基、c3-c6環(huán)烷基、c4-c8環(huán)烷基烷基、c2-c6螺環(huán)烷基、以及任選地被1-2個獨(dú)立地r6取代的芳基、芳基c1-c6烷基和雜芳基；r2和r3各自獨(dú)立地選自c1-c6烷基；r4和r5各自獨(dú)立地選自氫、c1-c6烷基、c3-c6環(huán)烷基、c4-c8環(huán)烷基烷基、c1-c6烷基羥基、c1-c6鹵代烷基、c1-c6烷基氨基c1-c6烷基、c1-c6烷氧基c1-c6烷基、和c3-c6雜環(huán)基c1-c6烷基；r6選自鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、和c1-c6鹵代烷基。2.如權(quán)利要求1所述的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其中r1選自c1-c6烷基、c3-c6環(huán)烷基、c4-c8環(huán)烷基烷基、c2-c6螺環(huán)烷基、以及任選地被1-2個獨(dú)立地r6取代的苯基、萘基、苯甲基和噻吩基；r2和r3各自獨(dú)立地選自c1-c3烷基；r4和r5各自獨(dú)立地選自氫、c1-c6烷基、c3-c6環(huán)烷基、c4-c8環(huán)烷基烷基、c1-c6烷基羥基、c1-c6鹵代烷基、c1-c6烷基氨基c1-c6烷基、c1-c6烷氧基c1-c6烷基、基c1-c6烷基、和四氫吡喃基c1-c6烷基；r6選自鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、和c1-c6鹵代烷基。3.如權(quán)利要求1所述的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述mst1/2激酶抑制劑包括式(ia)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、或溶劑化物，
其中，r1選自c1-c6烷基、任選地被1-2個獨(dú)立地r6取代的苯基、任選地被1-2個獨(dú)立地r6取代的噻吩基、和任選地被1-2個獨(dú)立地r6取代的苯甲基；r5選自氫、c1-c6烷基、和c3-c6環(huán)烷基；r6各自獨(dú)立地選自鹵素、c1-c6烷基、和c1-c6鹵代烷基。4.如權(quán)利要求3所述的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其中r1為任選地被1-2個獨(dú)立地r6取代的苯基；r5為氫；r6優(yōu)選為氟、甲基或三氟甲基。5.如權(quán)利要求1所述的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述mst1/2激酶抑制劑選自以下化合物或其藥學(xué)可接受的鹽中的至少一種：
6.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述mst1/2激酶抑制劑在培養(yǎng)基中的含量為2.5μm～10μm，優(yōu)選為5μm～7.5μm。7.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于所述原代細(xì)胞培養(yǎng)基滿足以下任意一項(xiàng)或多項(xiàng)或全部滿足：所述rock激酶抑制劑在培養(yǎng)基中的含量為2.5μm～15μm，優(yōu)選為5μm～15μm，更優(yōu)選為10μm～12.5μm；所述成纖維細(xì)胞生長因子7的含量為5ng/ml～160ng/ml，更優(yōu)選為10ng/ml～80ng/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為20ng/ml～40ng/ml；所述b27添加劑或n2添加劑在培養(yǎng)基中的體積濃度為1:25～1:800，更優(yōu)選為1:25～1:200，進(jìn)一步優(yōu)選1:50～1:100；所述肝細(xì)胞生長因子的含量為5ng/ml～160ng/ml，更優(yōu)選為20ng/ml～80ng/ml；所述胰島素樣生長因子1的含量為5ng/ml～160ng/ml，更優(yōu)選為20ng/ml～80ng/ml；所述白介素6的含量為2.5ng/ml～40ng/ml，更優(yōu)選為5ng/ml～40ng/ml；所述tgfβi型受體抑制劑的含量為62.5nm～500nm，優(yōu)選為250nm～500nm。8.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于所述原代細(xì)胞培養(yǎng)基滿足以下任意一項(xiàng)或多項(xiàng)或全部滿足：所述mst1/2激酶抑制劑為化合物1；所述rock激酶抑制劑為y27632；所述tgfβi型受體抑制劑為a83-01。9.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于還包括：選自dmem/f12、dmem、f12或rpmi-1640的初始培養(yǎng)基；和選自鏈霉素/青霉素、兩性霉素b和primocin中的一種或多種的抗生素。10.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：不含血清、牛垂體提取物、wnt激動劑、r-spondin家族蛋白、bmp抑制劑、煙酰胺和n-乙酰半胱氨酸。11.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述原代肺癌上皮細(xì)胞選自肺癌腫瘤細(xì)胞、正常肺癌上皮細(xì)胞、和肺癌上皮干細(xì)胞。12.一種原代肺癌上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)配制如權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的原代細(xì)胞培養(yǎng)基；(2)用細(xì)胞外基質(zhì)膠稀釋液包被培養(yǎng)器皿，所述細(xì)胞外基質(zhì)膠選自matrigel和bme中的至少一種；(3)在包被有細(xì)胞外基質(zhì)膠的培養(yǎng)器皿內(nèi)接種從肺癌組織分離得到原代肺癌上皮細(xì)胞，使用步驟(1)中的所述原代細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。13.一種評估或篩選用于肺癌疾病的藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)根據(jù)權(quán)利要求12所述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到肺癌上皮細(xì)胞；(2)選定需要檢測的藥物，稀釋成不同的藥物濃度梯度；(3)向步驟(1)培養(yǎng)得到的肺癌上皮細(xì)胞中添加梯度稀釋后的所述藥物，并進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)原代肺癌上皮細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，其含有MST1/2激酶抑制劑、ROCK激酶抑制劑、成纖維細(xì)胞生長因子7、B27添加劑和2添加劑中的至少一種添加劑、肝細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子1、白介素6、和TGFβI型受體抑制劑。本發(fā)明還涉及使用該原代細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法及其在藥物療效評估和篩選中的應(yīng)用。該培養(yǎng)方法使用上述原代細(xì)胞培養(yǎng)基在包被有細(xì)胞外基質(zhì)膠的培養(yǎng)器皿上培養(yǎng)原代細(xì)胞，使得原代細(xì)胞快速增殖。由本發(fā)明的原代細(xì)胞培養(yǎng)基和原代細(xì)胞培養(yǎng)方法得到的細(xì)胞模型，能夠用于藥物的療效評估和篩選。能夠用于藥物的療效評估和篩選。
